2025年醫(yī)院檢驗(yàn)科PCR室出科考試試題（附答案）一、單項(xiàng)選擇題（每題2分，共20分）1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中，Ct值的定義是：A.擴(kuò)增產(chǎn)物熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)B.擴(kuò)增產(chǎn)物濃度達(dá)到平臺(tái)期時(shí)的循環(huán)數(shù)C.熒光信號(hào)首次超過(guò)基線時(shí)的循環(huán)數(shù)D.引物二聚體開(kāi)始形成的循環(huán)數(shù)2.PCR實(shí)驗(yàn)室“三區(qū)兩通道”中，“三區(qū)”指的是：A.試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴(kuò)增分析區(qū)B.清潔區(qū)、半污染區(qū)、污染區(qū)C.辦公區(qū)、實(shí)驗(yàn)區(qū)、緩沖區(qū)D.試劑存儲(chǔ)區(qū)、核酸提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)3.核酸提取過(guò)程中，加入異丙醇的主要目的是：A.裂解細(xì)胞釋放核酸B.沉淀核酸C.去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)D.中和反應(yīng)體系pH4.實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)中，若陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，最可能的原因是：A.引物濃度過(guò)低B.模板濃度過(guò)高C.實(shí)驗(yàn)室交叉污染D.退火溫度過(guò)高5.以下哪種物質(zhì)會(huì)抑制TaqDNA聚合酶活性？A.氯化鈉B.乙二胺四乙酸（EDTA）C.三羥甲基氨基甲烷（Tris）D.硫酸鎂6.新冠病毒核酸檢測(cè)中，選擇ORF1ab和N基因雙靶標(biāo)的主要目的是：A.提高檢測(cè)靈敏度B.降低檢測(cè)成本C.減少假陽(yáng)性D.避免病毒變異導(dǎo)致的漏檢7.PCR擴(kuò)增儀的溫度均勻性要求通常為：A.±0.1℃B.±0.5℃C.±1.0℃D.±2.0℃8.醫(yī)療廢物處理時(shí)，核酸檢測(cè)使用的一次性槍頭應(yīng)裝入：A.黑色生活垃圾袋B.黃色醫(yī)療廢物袋（感染性廢物）C.紅色化學(xué)廢物袋D.藍(lán)色可回收廢物袋9.實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)中，ROX染料的作用是：A.作為內(nèi)參校正加樣誤差B.指示擴(kuò)增產(chǎn)物量C.提高Taq酶活性D.防止引物二聚體形成10.核酸提取后，若A260/A280比值為1.2，提示樣本可能存在：A.蛋白質(zhì)污染B.多糖污染C.RNA污染D.鹽離子殘留二、多項(xiàng)選擇題（每題3分，共15分，多選、少選、錯(cuò)選均不得分）1.PCR實(shí)驗(yàn)室必須配備的防護(hù)設(shè)備包括：A.生物安全柜B.高壓蒸汽滅菌器C.紫外線消毒燈D.冰箱（2-8℃、-20℃）2.影響PCR擴(kuò)增效率的因素有：A.引物設(shè)計(jì)的特異性B.dNTP濃度C.模板核酸的純度D.擴(kuò)增儀的升降溫速率3.關(guān)于核酸提取質(zhì)量控制，正確的做法是：A.每批樣本至少設(shè)置1份陰性提取對(duì)照（無(wú)模板）B.提取后的核酸應(yīng)立即進(jìn)行擴(kuò)增或-20℃保存C.A260/A280比值在1.8-2.0之間提示DNA純度較好D.若A260/A230比值低于1.5，提示可能有胍鹽殘留4.實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果判讀時(shí)，“無(wú)效結(jié)果”的常見(jiàn)原因包括：A.陽(yáng)性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增B.內(nèi)參基因無(wú)擴(kuò)增C.擴(kuò)增曲線呈“波浪形”（非S型）D.Ct值＞405.實(shí)驗(yàn)室發(fā)生核酸污染時(shí)，可采取的處理措施有：A.用10%次氯酸鈉溶液擦拭臺(tái)面B.開(kāi)啟紫外線燈照射30分鐘以上C.使用DNA酶清除殘留核酸D.更換實(shí)驗(yàn)服和手套三、簡(jiǎn)答題（每題8分，共40分）1.簡(jiǎn)述PCR技術(shù)的基本原理及三步循環(huán)的具體條件（溫度、時(shí)間）。2.列舉PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)的功能及各區(qū)域的核心操作要求（至少4個(gè)分區(qū)）。3.核酸提取過(guò)程中，如何避免交叉污染？請(qǐng)列出5項(xiàng)關(guān)鍵措施。4.實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)參基因（如β-actin、GAPDH）的作用是什么？實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)注意哪些問(wèn)題？5.簡(jiǎn)述新冠病毒核酸檢測(cè)結(jié)果的判讀標(biāo)準(zhǔn)（依據(jù)《新型冠狀病毒肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南》）。四、案例分析題（共25分）某實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行新冠病毒核酸檢測(cè)時(shí)，出現(xiàn)以下情況：（1）當(dāng)天所有樣本的擴(kuò)增曲線均呈“拖尾”現(xiàn)象（Ct值30-38），但陽(yáng)性對(duì)照Ct值為18，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增；（2）其中1份樣本的ORF1ab基因Ct值=32，N基因無(wú)擴(kuò)增，內(nèi)參基因Ct值=25；（3）次日復(fù)查同一份樣本，ORF1ab和N基因均無(wú)擴(kuò)增，內(nèi)參基因Ct值=24。問(wèn)題：1.分析情況（1）中“拖尾擴(kuò)增曲線”的可能原因及解決措施（8分）。2.情況（2）中樣本的初篩結(jié)果應(yīng)如何報(bào)告？依據(jù)是什么？（6分）3.情況（3）中復(fù)查結(jié)果提示可能存在什么問(wèn)題？實(shí)驗(yàn)室應(yīng)如何處理？（11分）答案一、單項(xiàng)選擇題1.A2.A3.B4.C5.B6.D7.B8.B9.A10.A二、多項(xiàng)選擇題1.ABCD2.ABCD3.ABCD4.ABC5.ABCD三、簡(jiǎn)答題1.基本原理：通過(guò)高溫變性（雙鏈DNA解鏈為單鏈）、低溫退火（引物與單鏈模板結(jié)合）、適溫延伸（Taq酶催化dNTP合成互補(bǔ)鏈）的循環(huán)，實(shí)現(xiàn)特定DNA片段的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。三步循環(huán)條件：變性94-95℃（30秒-1分鐘），退火55-65℃（30秒-1分鐘，具體溫度取決于引物Tm值），延伸72℃（時(shí)間根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度，通常1kb/分鐘）。2.分區(qū)及功能：（1）試劑準(zhǔn)備區(qū)：配制PCR反應(yīng)體系（不含模板）。操作要求：使用專用移液器、試劑分裝后保存，避免與其他區(qū)域物品交叉。（2）樣本處理區(qū)（核酸提取區(qū)）：樣本滅活、核酸提取。操作要求：生物安全柜內(nèi)操作，嚴(yán)格遵循“一次使用”原則（槍頭、離心管等），設(shè)置陰性提取對(duì)照。（3）擴(kuò)增區(qū)：加入模板并配制PCR反應(yīng)體系（含模板）。操作要求：與前兩區(qū)物理隔離，使用帶濾芯槍頭，避免氣溶膠污染。（4）擴(kuò)增分析區(qū)：運(yùn)行擴(kuò)增儀并分析結(jié)果。操作要求：避免開(kāi)蓋，若需重新分析需記錄原因，廢棄物按感染性廢物處理。3.避免交叉污染的措施：（1）分區(qū)操作，嚴(yán)格遵循單向流程（試劑準(zhǔn)備區(qū)→樣本處理區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增分析區(qū)）；（2）各區(qū)域使用專用移液器、離心管、槍頭等，不得交叉使用；（3）核酸提取時(shí)，樣本處理順序?yàn)椤瓣幮浴?yáng)性”，每處理1份樣本后更換手套；（4）使用帶濾芯槍頭，避免氣溶膠污染；（5）每次實(shí)驗(yàn)后用10%次氯酸鈉擦拭臺(tái)面，紫外線照射30分鐘；（6）設(shè)置陰性提取對(duì)照和陰性擴(kuò)增對(duì)照，監(jiān)控污染。4.內(nèi)參基因作用：（1）驗(yàn)證樣本核酸提取有效性（若內(nèi)參無(wú)擴(kuò)增，提示提取失敗或抑制物存在）；（2）校正不同樣本間的加樣誤差，提高定量準(zhǔn)確性；（3）排除假陰性（若目標(biāo)基因無(wú)擴(kuò)增但內(nèi)參正常，提示樣本中目標(biāo)基因含量低或陰性）。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)注意：（1）選擇在檢測(cè)樣本中穩(wěn)定表達(dá)的基因（如人源β-actin適用于臨床樣本）；（2）內(nèi)參引物與目標(biāo)基因引物無(wú)交叉反應(yīng)；（3）內(nèi)參擴(kuò)增效率應(yīng)與目標(biāo)基因一致（ΔCt值穩(wěn)定）。5.新冠病毒核酸檢測(cè)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)（依據(jù)國(guó)家指南）：（1）陽(yáng)性：雙靶標(biāo)（ORF1ab/N）均擴(kuò)增且Ct≤37；或單靶標(biāo)擴(kuò)增且Ct≤37（需復(fù)查，復(fù)查仍為單靶標(biāo)陽(yáng)性可判陽(yáng)）；（2）陰性：雙靶標(biāo)均無(wú)擴(kuò)增或Ct＞40，且內(nèi)參擴(kuò)增正常；（3）無(wú)效：內(nèi)參無(wú)擴(kuò)增（提示提取失敗或抑制物），或陽(yáng)性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增（提示試劑失效）；（4）灰區(qū)：Ct值37-40，需重新采樣檢測(cè)，若復(fù)查仍在此范圍可結(jié)合流行病學(xué)史判讀。四、案例分析題1.情況（1）原因及措施：可能原因：樣本中核酸濃度較低（如咽拭子采集量不足），或擴(kuò)增體系中存在弱抑制物（如殘留的胍鹽、血紅蛋白）。解決措施：（1）復(fù)查樣本采集質(zhì)量，確認(rèn)是否規(guī)范（如咽拭子是否接觸咽后壁）；（2）優(yōu)化核酸提取步驟（如增加洗滌次數(shù)減少抑制物殘留）；（3）稀釋樣本（若抑制物濃度高，稀釋后可能改善擴(kuò)增曲線）；（4）檢查擴(kuò)增儀溫度準(zhǔn)確性（溫度偏差可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率下降）。2.情況（2）初篩應(yīng)報(bào)告“單靶標(biāo)陽(yáng)性（ORF1ab基因）”，需復(fù)查。依據(jù)：《指南》規(guī)定單靶標(biāo)陽(yáng)性（Ct≤37）需重新采樣檢測(cè)，若復(fù)查仍為單靶標(biāo)陽(yáng)性或雙靶標(biāo)陽(yáng)性可判陽(yáng)性；若復(fù)查陰性需結(jié)合臨床綜合判斷。3.情況（3）問(wèn)題及處理：可能問(wèn)題：初篩結(jié)果為“假陽(yáng)性”，可能因樣本間交叉污染（如加樣時(shí)氣溶膠擴(kuò)散）或擴(kuò)增產(chǎn)物污染（前次實(shí)驗(yàn)殘留）。實(shí)驗(yàn)室處理：（1）立即停