MolecularBiologyⅣ.真核生物的基因轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控三、真核生物的通用轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄必需因素：DNA模板啟動(dòng)子

RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)所依賴的DNA結(jié)合蛋白2兩大類轉(zhuǎn)錄因子：

通用轉(zhuǎn)錄因子(generaltranscriptionfactors，GTFs)基因特異轉(zhuǎn)錄因子(Gene-specifictranscriptionfactors，GSTFs)3Q1：轉(zhuǎn)錄因子有多少？怎么分類？50xRepression25,000xActivation10xActivation50xRepressiontheDynamicRangeofTranscriptionModifiedfromCell1999;99:454GTFsGSTFsEpigeneticmodulator4真核生物與原核生物轉(zhuǎn)錄的不同原核生物RNA聚合酶需要σ因子來啟動(dòng)特定染色體區(qū)段轉(zhuǎn)錄；真核生物需要多種不同起始因子（通用轉(zhuǎn)錄因子）來協(xié)助RNA聚合酶在特定啟動(dòng)子序列有效起始轉(zhuǎn)錄。在體外條件下，通用轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶足以啟動(dòng)特定DNA模板的轉(zhuǎn)錄；而在細(xì)胞內(nèi)條件下，還需要其它蛋白因子來啟動(dòng)和促進(jìn)轉(zhuǎn)錄【如中介物(mediator)、染色質(zhì)重塑因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白(激活因子)等】。5與RNA聚合酶對(duì)應(yīng)，將通用轉(zhuǎn)錄因子分為三類：Ⅱ類因子(RNA聚合酶Ⅱ所需)Ⅰ類因子(RNA聚合酶Ⅰ所需)Ⅲ類因子(RNA聚合酶Ⅲ所需)6

Ⅱ類因子(按組裝前起始復(fù)合物的先后順序)

TFIID（TFIIA）

TFIIB

TFIIF

TFIIE

TFIIH7Q2:如何得知每一種Ⅱ類因子結(jié)合到啟動(dòng)子的順序及位置？DannyReinbergNYUSchoolofMedicinePhillipA.SharpMITJackGreenblattUniversityofToronto8結(jié)合順序：@DNA凝膠阻滯分析（gelmobilityshiftassay）參見第五章：Figure5.369D、A、B、F、PolII結(jié)合啟動(dòng)子的順序

Figure11.11011E、H、PolII結(jié)合啟動(dòng)子的順序

miR-122基因組上轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的位置示意圖12DNA凝膠阻滯分析應(yīng)用實(shí)例Xuetal,unpublisheddata13結(jié)合位置：@

DNA酶足跡法（DNAse

Footpringting）參見第五章：Figure5.37DNaseI14D、A、B及其復(fù)合物結(jié)合的位置Figure11.2AHⅡ類因子結(jié)合到啟動(dòng)子的順序及位置示意圖15D

“前起始復(fù)合物”

=RNA聚合酶+通用轉(zhuǎn)錄因子TFIID在TFIIA的協(xié)助下，首先結(jié)合到TATAbox，形成DA復(fù)合物，然后TFIIB再結(jié)合到BRE上去；16轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物的形成過程TFIID的結(jié)構(gòu)及功能TFIID本身是一個(gè)復(fù)合物，含1個(gè)進(jìn)化上高度保守的TATAbox結(jié)合蛋白（TATAbox-bindingprotein,TBP）和8-10個(gè)TBP相聯(lián)因子（TBP-associatedfactors,TAFs）17TFIID的結(jié)構(gòu)及功能TBP蛋白結(jié)構(gòu)呈馬鞍形，用β-折疊結(jié)合到DNA雙螺旋的小溝上，能使TATAbox彎曲80°，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的裝配。1819Q：基因?yàn)楹芜x擇TATAbox（A:T堿基對(duì)）作為轉(zhuǎn)錄起始裝配起點(diǎn)？20TFIID的結(jié)構(gòu)及功能TBP蛋白對(duì)所有三類聚合酶結(jié)合到其對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子上都起重要作用。TBP的突變對(duì)對(duì)三類聚合酶轉(zhuǎn)錄的影響TAFs的功能TAFs幫助TFIID結(jié)合到啟動(dòng)子上（包括沒有TATAbox的啟動(dòng)子上，

TAFs可識(shí)別上游或下游啟動(dòng)子元件）21TAFII的亞基組成有一定保守性22ModelfortheinteractionbetweenTBPandTATA-containingorTATA-lesspromoters23TAFs的功能TAFs幫助TFIID結(jié)合到啟動(dòng)子上；TAFs參與激活因子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活24Sp1&Gal4-NTF-1是轉(zhuǎn)錄激活因子25TFIIATFIIA可以看成是一種TAF(與TBP結(jié)合)，能穩(wěn)定TFIID與啟動(dòng)子之間的結(jié)合在體外體系中，TFIIA并非必不可少26TFIIB結(jié)合在BRE元件上；把TFIID與TFIIF/PolII相連在一起；定位轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄方向。27

前起始復(fù)合物=RNA聚合酶+通用轉(zhuǎn)錄因子TFIID在TFIIA的協(xié)助下，首先結(jié)合到TATAbox，形成DA復(fù)合物，然后TFIIB再結(jié)合到BRE上去；TFIIF協(xié)助polymeraseII結(jié)合到DNA鏈上（-34~+17區(qū)域）；轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物的形成過程28TFIIF由2條多肽構(gòu)成：RAP30與RAP70，RAP30與細(xì)菌σ因子有一定的同源性.引導(dǎo)聚合酶到已結(jié)合有TFIID、TFIIA和TFIIB的啟動(dòng)子上（與Pol

II結(jié)合后，能減少聚合酶與DNA之間非特異的相互作用

）。29+1-33TFIIF和polymeraseII結(jié)合位點(diǎn)（-34~+17）30

前起始復(fù)合物=RNA聚合酶+通用轉(zhuǎn)錄因子TFIID在TFIIA的協(xié)助下，首先結(jié)合到TATAbox，形成DA復(fù)合物，然后TFIIB再結(jié)合到BRE上去；TFIIF協(xié)助polymeraseII結(jié)合到DNA鏈上（-34~+17區(qū)域）；TFIIE、TFIIH結(jié)合到復(fù)合體中，形成DABPolFEH前起始復(fù)合物。轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物的形成過程31TFIIE有2個(gè)亞基（56kD,34kD），每個(gè)亞基在TFIIE中都有2個(gè)拷貝（總分子量約為200kD）起到招募TFIIH的作用。32TFIIH使PolII最大一個(gè)亞基的羧基末端域（CTD）磷酸化，即使PolIIA變?yōu)镻olIIO，使轉(zhuǎn)錄起始到轉(zhuǎn)錄延伸過渡；具有DNA解螺旋酶（helicase）的活性，是聚合酶離開啟動(dòng)子往前轉(zhuǎn)錄（promoterclearance）所需。33TFIIH在啟動(dòng)子清除中的作用34小結(jié)：RNA聚合酶II介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄起始過程MolecularBiologyoftheGene,6e,figure12-15D(TBP)toTATAbox,A&BtoBRE,F&PolⅡtocorepromoter,E&Htodownstream,Promotermelting(H+ATP),Promoterescapes(CTD+P).II類前起始復(fù)合物模型(R.Korberg)σ因子同源區(qū)36通用轉(zhuǎn)錄因子的“通用性”37通用是相對(duì)的，相對(duì)于大多數(shù)基因而言真核生物與原核生物轉(zhuǎn)錄的不同原核生物RNA聚合酶需要σ因子來啟動(dòng)特定染色體區(qū)段轉(zhuǎn)錄；真核生物需要多種不同起始因子（通用轉(zhuǎn)錄因子）來協(xié)助RNA聚合酶在特定啟動(dòng)子序列有效起始轉(zhuǎn)錄。在體外條件下，通用轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶足以啟動(dòng)特定DNA模板的轉(zhuǎn)錄；而在細(xì)胞內(nèi)條件下，還需要其它蛋白因子來啟動(dòng)和促進(jìn)轉(zhuǎn)錄【如中介物(mediator)、染色質(zhì)重塑因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白(激活因子)等】。38體內(nèi)轉(zhuǎn)錄所需的轉(zhuǎn)錄因子39中介物（mediator）是II類前起始復(fù)合物的組分；參與轉(zhuǎn)錄激活而非轉(zhuǎn)錄起始。4041激活因子（activator）結(jié)合增強(qiáng)子，幫助聚合酶結(jié)合到啟動(dòng)子上，并使其穩(wěn)定地結(jié)合42染色質(zhì)重塑因子(chromatinremodeler)在結(jié)合聚合酶的啟動(dòng)子部位，改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)便于轉(zhuǎn)錄進(jìn)行。43RNA聚合酶II“全酶概念”RNA聚合酶也可能與通用轉(zhuǎn)錄因子預(yù)先形成復(fù)合體（RNA聚合酶全酶），然后結(jié)合與啟動(dòng)子上，起始轉(zhuǎn)錄。RogerKorberg&RichardYoung給出了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。免疫沉淀分離到包含通用轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶、中介物（mediator）的蛋白復(fù)合體。44延伸因子(elongationfactor)延伸過程中所需的通用轉(zhuǎn)錄因子TFIIS促進(jìn)轉(zhuǎn)錄延伸，阻止聚合酶在轉(zhuǎn)錄過程中較長時(shí)間的暫停（轉(zhuǎn)錄停滯）；TFIIS促進(jìn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的校正。4546TFIIS對(duì)轉(zhuǎn)錄停滯的逆轉(zhuǎn)延伸因子FACT（facilitateschromatintranscriptionfactor）前方拆除組蛋白，后方修復(fù)（又稱核小體修復(fù)酶）。47

Ⅰ類因子核心結(jié)合因子（人類稱SL1，其它生物稱TIF-IB）UPE結(jié)合因子（upstream-bindingfactor，UBF）48

Ⅰ類因子SL1由TBP（TATAbox結(jié)合蛋白）和3種TAFs（TBP相聯(lián)因子）組成；并不直接與啟動(dòng)子結(jié)合，但它能加強(qiáng)UBF與啟動(dòng)子的結(jié)合。UBF由2條多肽構(gòu)成（97kD和94kD），能與Ⅰ類啟動(dòng)子的核心元件及UPE（上游控制元件）的位點(diǎn)結(jié)合，再與SL1一起，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。49ModelforrRNAtranscriptioninitiation50

Ⅲ類因子包含TFIIIA、TFIIIB、TFIIICTFIIIB和TFIIIC是所有在基因內(nèi)部有III類啟動(dòng)子的基因的轉(zhuǎn)錄所需的；TFIIIB包含TBP（TATAbox結(jié)合蛋白）及一些TAFIIIs；

5SrRNA基因的轉(zhuǎn)錄還需要TFIIIA51典型的III類啟動(dòng)子上轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的裝配52TBP在3類轉(zhuǎn)錄因子中的作用53TATA疑問：TBP稱為TATAbox結(jié)合蛋白是否合適？兩大類轉(zhuǎn)錄因子：

通用轉(zhuǎn)錄因子(generaltranscriptionfactors，GTFs)基因特異轉(zhuǎn)錄因子(Gene-specifictranscriptionfactors，GSTFs)54通用轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別啟動(dòng)子；招募RNA聚合酶到啟動(dòng)子上；決定轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)和方向?；蛱禺愞D(zhuǎn)錄因子識(shí)別增強(qiáng)子（或沉默子）；對(duì)各種信號(hào)作出反應(yīng)，調(diào)控轉(zhuǎn)錄機(jī)器；決定轉(zhuǎn)錄與否及強(qiáng)度。1、兩類轉(zhuǎn)錄因子的對(duì)比552、真核生物與原核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的不同更多調(diào)控序列（順式元件）562、真核生物與原核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的不同更多調(diào)控序列（順式元件）更多調(diào)控因子（反式因子）572、真核生物與原核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的不同更多調(diào)控序列（順式元件）增強(qiáng)子、沉默子更多調(diào)控因子（反式因子）轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控因子（coactivators,chromatinremodelers,histoneacetylases,deacetylases,kinases,andmethylases

）58GeneralinformationaboutTFAdefiningfeatureoftranscriptionfactorsisthattheycontainoneormoreDNA-bindingdomains(DBDs).Additionalproteinssuchascoactivators,chromatinremodelers,histone

acetylases,deacetylases,kinases,andmethylases,whilealsoplayingcrucialrolesingeneregulation,lackDNA-bindingdomains,and,therefore,arenotclassifiedastranscriptionfactors.From59GeneralinformationaboutTFThenumberoftranscriptionfactorsfoundwithinanorganismincreaseswithgenomesize.Thereareapproximately2600proteinsinthehumangenomethatcontainDNA-bindingdomains,andmostofthesearepresumedtofunctionastranscriptionfactors.Therefore,approximately

10%ofgenesinthegenomecodefortranscriptionfactors,whichmakesthisfamilythesinglelargestfamilyofhumanproteins.From60GeneralinformationaboutTFGenesareoftenflankedbyseveralbindingsitesfordistincttranscriptionfactors,andefficientexpressionofeachofthesegenesrequiresthecooperativeactionofseveraldifferenttranscriptionfactors.Combinatorialuseofasubsetof~2000transcriptionfactorseasilyaccountsfortheuniqueregulationofeachgeneinthehumangenomeduringdevelopment.From613、基因特異轉(zhuǎn)錄因子的作用位于各種pathway下游的關(guān)鍵調(diào)控蛋白62MAPK/Erksignalingpathway63藍(lán)色橢圓代表各種轉(zhuǎn)錄因子TGFβsignalingpathway64藍(lán)色橢圓代表各種轉(zhuǎn)錄因子從基因表達(dá)調(diào)控角度來看：

通用轉(zhuǎn)錄因子：6種UnitsofTranscriptionMachine基因特異轉(zhuǎn)錄因子:~2600種FineControlofTranscription現(xiàn)代化？3、基因特異轉(zhuǎn)錄因子的作用65基因特異轉(zhuǎn)錄因子的功能:Activator（激活因子）Repressor（抑制因子）有時(shí)統(tǒng)稱activator同一轉(zhuǎn)錄因子功能是可變的:激活一些基因，抑制另一部分基因；在某種信號(hào)作用下抑制轉(zhuǎn)錄，在另一種信號(hào)下激活轉(zhuǎn)錄（Ⅱ型核受體）。3、基因特異轉(zhuǎn)錄因子的作用66Domain(結(jié)構(gòu)域):蛋白質(zhì)的獨(dú)立區(qū)域FoldingCompactStructurePyruvatekinase（threedomains）From4、基因特異轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)67Domain(結(jié)構(gòu)域):蛋白質(zhì)的獨(dú)立區(qū)域FoldingCompactStructureFunctionEvolution4、基因特異轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)P53與DNA結(jié)合的模型68Domain：Manyproteinsconsistofseveralstructuraldomains.Onedomainmayappearinavarietyofdifferentproteins.Molecularevolutionusesdomainsasbuildingblocks

andthesemayberecombinedindifferentarrangementstocreateproteinswithdifferentfunctions.4、基因特異轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)697071Domain的重排是基因進(jìn)化的一種方式共有結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合域（DNA-bindingdomain）轉(zhuǎn)錄激活域（Transcription-activationdomain）4、基因特異轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)72非共有結(jié)構(gòu)域：二聚體形成域（Dimerizationdomain）配體結(jié)合域（Ligand-bindingdomain）4、基因特異轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)73糖皮質(zhì)激素三大類DNA-bindingmotif：含鋅組件（Zinc-ContainingModules）同源結(jié)構(gòu)域（Homeodomains）亮氨酸拉鏈（bZIP）&螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）

4.1、DNA結(jié)合域74（一）含鋅組件Useoneormorezinc

ionstocreateashapetofitana-helixofthemotifintotheDNAmajorgroove分類：ClassicZincfingerZincfinger-like(non-classicZincfinger)From4.1、DNA結(jié)合域75Zincfinger（主要）依靠a-helix的氨基酸識(shí)別DNA大溝中的堿基對(duì)（~5-7nt）

76The“classicZincfinger”：

Cys2His2-like(Zn+a-helix+β-ribbon)

77The“classicZincfinger”：

Zif268(小鼠的TFⅢA)78non-classicZincfinger

Zinc2/Cys6(酵母GAL4蛋白)79non-classicZincfinger

Zinc2/Cys4(人孕酮受體)StructureofthehumanprogesteronereceptorDNA-bindingdomaindimer(cyanandgreen)complexedwithdoublestrainedDNA(magenta).Zincatomsofaredepictedasgreyspheres.80NuclearReceptor(Zinc2/Cys4)Superfamilyofligand-dependenttranscriptionfactors（結(jié)合各種激素，形成激素-受體復(fù)合物，起激活子的作用）分類：TypeⅠTypeⅡTypeⅢ81TypeⅠNuclearReceptor當(dāng)激素配體缺乏時(shí)，它們與其它蛋白（如分子伴侶HSP90）結(jié)合，以無功能形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)激素刺激時(shí)，它們與激素結(jié)合，構(gòu)象改變，與分子伴侶脫離，以同源二聚體形式進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合在靶基因的增強(qiáng)子上，激活轉(zhuǎn)錄。代表：類固醇激素受體82TypeⅠNuclearReceptorAction83TypeⅡNuclearReceptor有無激素配體時(shí)，它們都可以結(jié)合DNA上的調(diào)控元件，無配體結(jié)合時(shí)抑制基因轉(zhuǎn)錄，與配體結(jié)合后構(gòu)象改變，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。代表：甲狀腺激素受體。通常以異二聚體的形式存在，如甲狀腺激素受體與視黃酸受體（RXR）結(jié)合成二聚體。84TypeⅡNuclearReceptorAction85TypeⅢ配體尚不清楚，故稱Orphanreceptor。86（二）同源結(jié)構(gòu)域（Homeodomains）Containhelix-turn-helixDNA-bindingmotifs第三個(gè)helix識(shí)別DNA堿基87（二）同源結(jié)構(gòu)域（Homeodomains）存在于Homeobox基因果蠅Homeobox基因突變導(dǎo)致的觸角足(antennapedia)表型88（三）bZIP&bHLHMotifs亮氨酸拉鏈（BasicLeucineZipper）

代表：AP1AP1transcriptionfactor(c-fosandc-jun)89（三）bZIP&bHLHMotifs螺旋-環(huán)-螺旋（Basichelix-loop-helix）代表：MyoD90（三）bZIP&bHLHMotifs有些轉(zhuǎn)錄因子兼具ZIP和HLH代表：Myc91轉(zhuǎn)錄激活域

酸性域（Acidicdomains）

富谷氨酰胺域（Glutamine-richdomains）

富脯氨酸域（Proline-richdomains）4.2、轉(zhuǎn)錄激活域924.3、轉(zhuǎn)錄因子各結(jié)構(gòu)域的獨(dú)立性93嵌合體（chimeric）實(shí)驗(yàn)5、基因特異轉(zhuǎn)錄因子的功能模式通過與通用轉(zhuǎn)錄因子相互作用，將聚合酶召集(recruitment)到啟動(dòng)子上。945、基因特異轉(zhuǎn)錄因子的功能模式通過與中介物、染色質(zhì)重塑因子等相互作用，將聚合酶召集到啟動(dòng)子上。95965、基因特異轉(zhuǎn)錄因子的功能模式二聚化或多聚化的意義增強(qiáng)結(jié)合能力結(jié)合位點(diǎn)更特異TranscriptionFactorSequenceMotifMYCandMAXCACGTGFOSandJUNTGAC/GTC/AACREBTGACGC/TC/AG/A

ThyroidhormonereceptorGTGTCAAAGGTCAETSG/CA/CGGAA/TGT/C

GATAT/AGATAMYBT/CAACG/TGMYODCAACTGACNFκBandRELGGGAA/CTNT/CCC(1)

RAR(retinoicacidreceptor)ACGTCATGACCTSRF(serumresponsefactor)GGATGTCCATATTAGGACATCTTableofRepresentativeTranscriptionFactors97

增強(qiáng)子(Enhancer)與沉默子(Silencer)

無方向和位置依賴的DNA元件，與DNA結(jié)合蛋白作用而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。具有組織特異性其活性依賴于DNA結(jié)合蛋白增強(qiáng)子和沉默子并不是絕對(duì)的，有時(shí)增強(qiáng)子可變現(xiàn)出沉默子活性。985、基因特異轉(zhuǎn)錄因子的功能模式免疫球蛋白γ2b重鏈基因增強(qiáng)子99蛋白檢測(cè)RNA檢測(cè)免疫球蛋白γ2b重鏈基因增強(qiáng)子100SusumuTone