ChapterIIThePreparationofProteins1一、樣品制備原則二、樣品制備流程三、亞蛋白質(zhì)組成分的提取四、特殊樣品的制備五、蛋白質(zhì)含量測(cè)定六、出現(xiàn)問題和解決辦法2蛋白質(zhì)樣品的制備是蛋白質(zhì)組分析的基礎(chǔ)

目的分辨率有限目前雙向電泳（1000-5000個(gè)spot)，而樣品中的蛋白種類可達(dá)到10萬種以上濃縮樣品，增加蛋白質(zhì)拷貝：大部分蛋白質(zhì)拷貝數(shù)都少。3蛋白質(zhì)樣品制備原則應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測(cè)性。4蛋白質(zhì)樣品制備步驟分離：將生物提取液中的蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)進(jìn)分開提取：從總的蛋白質(zhì)溶液中提取目標(biāo)蛋白純化：從總的蛋白質(zhì)中或從目標(biāo)蛋白質(zhì)中分離出雜質(zhì)使蛋白質(zhì)單一化5SampleCategoriesPlasmaSerumBloodSamplesDiluteBiofluids:Urine,amnioticfluidBiofluid(nolysis)BacteriaYeastAnimal

TissuesandTumorsAnimalandPlantCellCulturesPlantTissuesTissueorCell(requireslysis)SampleType6可溶性樣品

固體組織樣品

細(xì)胞不同樣品的基本處理方法樣品的分級(jí)處理通過采用亞細(xì)胞分級(jí)、液相電泳和選擇性沉淀等方法對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分級(jí)處理，可降低樣品的復(fù)雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)。當(dāng)前最簡(jiǎn)單有效的處理是采用分級(jí)抽提，按樣品溶解度不同進(jìn)行分離。7FrequentlyappliedtreatmentsCellwashingCelldisruptionRemovalofcontaminantMicrodialysis

ElectrophreticdesaltingPrecipitationmethodsProteaseinhibitor81.CellwashingToremovecontaminantmaterial.FrequentusedbufferPBS:phosphatebuffersaline,sodiumchloride,145mM(0.85%)inphosphatebuffer,150mMpH7.2Trisbuffersucrose(10mMTris,250mMsucrose,pH7,2)Enoughosmoticumtoavoidcelllysis92.CelldisruptionGentlelysismethod

Osmoticlysis(culturedcells)Suspendcellsinhypoosmoticsolution.Repeatedfreezingandthawing(bacteria)FreezeusingliquidnitrogenDetergentlysis(yeastandfungi)Lysisbuffer(containingureaanddetergent)SDS(havetoberemovedbeforeIEF)Enzymaticlysis(plant,bacteria,fungi)Lysomzyme(bacteria)Celluloseandpectinase(plant)Lyticase(yeast)10Vigorouslysismethod

Sonicationprobe(cellsuspension)Avoidoverheat,coolonicebetweenburst.Frenchpressure(microorganismwithcellwall)Cellsarelysedbyshearforce.Mortarandpestle(solidtissue,microorganism)Grindsolidtissuetofinepowderwithliquidnitrogen.Samplegrindingkit(forsmallamountofsample)Forprecioussample.Glassbead(cellsuspension,microorganism)Usingabrasivevortexedbeadtobreakcellwalls.11

Keyvariableforsuccessfulextraction

fromcrudematerial1.Themethodofcelllysis2.ThecontrolofpH3.Thecontroloftemperature4.Avoidanceofproteolyticdegradation123.RemovalofcontaminantsMajortypeofcontaminants:DNA/RNALipidspolysaccharidesSolidmaterialSalt13DNA/RNAcontaminantDNA/RNAcanbestainedbysilverstaining.Theycausehorizontalstreakingattheacidicpartofthegel.TheyprecipitatewiththeproteinswhensampleapplyingatbasicendofIEFgelHowtoremove:1.precipitationofproteins2.DNase/RNasetreatment3.sonication(mechanicalbreakage)4.DNA/RNAextractionmethod(phenol/chroloform)14RemovalofothercontaminantsRemovaloflipids:>2%detergentPrecipitationRemovalofpolysaccharides:EnzymaticprocedurePrecipitationRemovalofsolidmaterialCentrifugationRemovalofsaltsMicrodialysisPrecipitation154.MicrodialysisSpeciallydesignforsmall

volumesamplesMembranecut-offisabout8000DaDrawbacks:1.Timeconsuming(someproteasemightbeactiveanddigestproteinsduringthedialysis)2.Someproteinsprecipitationafterdialsis.165.Electrophoreticdesalting

電洗脫Therearesomecasewherethesamplemustnotbedialysed.(halobacterialysate)Someproteinswillgelifdesalted.(Bovinevitreousproteins)

Solutionforabove:lowvoltage(100V)for5hoursbeforeIEFrunning.(A.Gorg,1995)176.PrecipitationmethodsThereasonsforapplyingproteinprecipitationprocedure:1.Concentratelowconcentratedproteinsamples.2.Removalofseveraldisturbingmaterialatthesametime.3.Inhibitionofproteaseactivity.原理：加入適當(dāng)?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子處于等電點(diǎn)狀態(tài)或失去水化層，蛋白質(zhì)的膠體溶液就不在穩(wěn)定并將產(chǎn)生沉淀。18Fiveprecipitationmethods.1.硫酸銨沉淀（Ammoniumsulfateprecipitation）－中和蛋白質(zhì)的電荷2.三氯乙酸沉淀（Trichloroaceticacid，TCAprecipitation）－與蛋白質(zhì)中帶正電荷的基團(tuán)生成不溶性鹽3.丙酮沉淀（Acetoneprecipitation）－破壞蛋白質(zhì)水膜4.三氯乙酸/丙酮沉淀（TCA/Acetoneprecipitation）5.Ammoniumacetate/methodfollowingphenolextraction19AmmoniumsulfateprecipitationProteinstendtoaggregateinhighconcentrationofsalt(saltingout)AddAmmoniumsulfateslowlyintosolutionandstirfor10-30minsHarvestproteinbycentrifugation.LimitationSomeproteinsaresolubleathighsaltconc.AmmoniumsulfateseriouslyaffectIEF.20TCA

precipitationTCAisaveryaffectiveproteinprecipitant.AddTCAtoextracttofinalconc.10-20%.Add10-20%TCAdirectlytotissueorcells.Harvestproteinbycentrifugation.WashaccessTCAbyethanoloracetone.LimitationSometimesthepelletishardtoredissolve.TCAmustremovecomplete.(affectingIEF)Somedegradationormodificationofprotein

occurs21AcetoneprecipitationThemostcommonorganicsolventusedtoprecipitatedproteins,lipidanddetergentremaininsolution.Addatleast3vol.ofice-coldacetoneintoextract.Standoniceforatleast2hours.Harvestproteinbycentrifugation.Removeaccessacetonebyairdrying.LimitationSometimesthepelletishardtoredissolve.Someproteinswouldnotprecipitate.DNA/RNAandglycanalsoprecipitate.22Example,AcetoneprecipitationWithAcetoneprecipitationCrudeextractbylysisbuffer23TCA/acetoneprecipitationThemethodismoreactivethanTCAoracetone

alone.Mostcommonlyusedin2-DE.Suspensionsamplesin10%TCA/Acetonewith0.07%2-mercaptoethanolor20mMDTT.Standon-20Cforatleast45mins.Harvestproteinbycentrifugation.Washthepelletbyacetonewith0.07%2-mercaptoethanolor20mMDTT.Removeaccessacetonebyairdry.LimitationSometimesthepelletishardtoredissolve.TCAmustremovecomplete.(affectingIEF)Somedegradationormodificationofproteinoccurs24PrecipitationwithammoniumacetateinmethanolfollowingphenolextractionThemethodismoresuitableforplantsample

withhighlevelofinterferingsubstanceProteinsareextractedintobuffersaturatedphenol.Precipitatedbyammoniumacetate/methanol.Harvestproteinbycentrifugation.Washwithammoniumacetate/methanolfollowedbyacetone.LimitationComplicated.Timeconsuming.25ACDB823spots757spots969spots899spotsAcetoneIsopropanolTCATCA/AcetoneABDC267.Proteaseinhibitor抑制蛋白質(zhì)降解方法強(qiáng)變性劑(8mol／Lurea，10％TCA或2％SDS)低溫:蛋白酶低溫下無活性高pH:蛋白酶

pH超過9.0的時(shí)候失活。因此，在樣品裂解液中出現(xiàn)Tris、碳酸鈉和載體兩性電解質(zhì)時(shí)也可以抑制蛋白降解。蛋白酶抑制劑：27“蛋白酶抑制劑雞尾酒（proteaseinhibitorcocktail）”1.PMSF(苯甲基磺酰氟)：是一種不可逆抑制劑，常用濃度為1mmol／L，滅活絲氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是其局限在于可在水溶液中迅速失活。因此，現(xiàn)用現(xiàn)加效果較好；另外，在二硫蘇糖醇（DTT）或者β—巰基乙醇溶液中PMSF的抑制效果可能會(huì)減少。因此，含巰基的試劑可在晚些時(shí)候加入。2.AEBSF(PefablocTMSC)：通常工作濃度為4mmol／L，作用與PMSF相似，但溶解性較好，且毒性低。但是AEBSF可能改變蛋白的等電點(diǎn)。3.金屬蛋白酶抑制劑乙二胺四乙酸、乙二醇雙四乙酸(EDTA、EGTA)：通常應(yīng)用1mmol／L的工作濃度，通過螯合自由的金屬離子來抑制金屬蛋白酶活性。

28

4.肽蛋白酶抑制劑：亮抑酶肽(leupeptin)，它是可逆性蛋白酶抑制劑，在含DTT的溶液中以低濃度的形式保持活性，抑制一些絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶的活性；胃蛋白酶抑制劑A（pepstatinA），抑制天冬氨酸蛋白酶(如酸性蛋白酶)的活性；抑蛋白酶肽(aprotinin),抑制許多絲氨酸蛋白酶；苯丁抑制素(bestatin)，抑制氨基蛋白酶。但是，這些蛋白酶抑制劑價(jià)格昂貴，而且它們是小肽片段，可能會(huì)出現(xiàn)在二維電泳圖譜中，其中胃蛋白酶抑制劑A在pH=9的時(shí)候不能抑制蛋白酶。

5.甲苯磺酰賴氨酰氯甲酮(TLCK)，甲苯磺酰笨丙氨酰氯甲酮（TPCK)：通常作用濃度在0.1~0.15mmol/L,這些相同的成分不可逆抑制許多絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。

6.Benzamidine：通常作用濃度為1~2mmol/L，抑制絲氨酸蛋白酶。29樣品的溶解是2-DE成功分離蛋白質(zhì)的最關(guān)鍵因素之一。溶解的目標(biāo)：

1.樣品中非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個(gè)多肽的溶解液（否則樣品中結(jié)合牢固的蛋白復(fù)合物可能使2-DE中出現(xiàn)新的蛋白點(diǎn)，相應(yīng)的表示單個(gè)多肽的點(diǎn)的強(qiáng)度會(huì)下降）；

2.必須允許可能干擾2-DE分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質(zhì)的去除；

3.保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài)。30增加樣品溶解性的手段變性劑：通過改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性劑：經(jīng)過變性劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種表面活性劑來溶解疏水基團(tuán)。常用的表面活性劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑TritonX-100和NP-40、兩性離子去污劑CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。還原劑：在變性劑和表面活性劑聯(lián)用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的DTT或

-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦（TBP）進(jìn)行還原。31起載體作用的兩性電解質(zhì)：即便在變性劑和表面活性劑存在的情況下，某些蛋白質(zhì)也需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否則這些蛋白質(zhì)在其處于PI點(diǎn)時(shí)會(huì)發(fā)生沉淀。Carrierampholytes的作用在于捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性。應(yīng)用時(shí)，兩性電解質(zhì)的濃度應(yīng)小于0.2％（w/v)。濃度過高會(huì)使IEF的速度降低。另外，為了保證實(shí)驗(yàn)的精確性，在選擇不同pH范圍的IPG膠條時(shí)，也應(yīng)使兩性電解質(zhì)的pH值與之相符合。32樣品液的準(zhǔn)備ReagentAmount8Murea47mlof8.5stockor24gureain25mlH2O50mMDTTor2mMTBP385mgor500ulof200mMTBPstock4%CHAPS2g0.2%carrierampholytesSeenexttable0.0002%bromophenolblue100ulof0.1%stockddH2OTo50ml33IPGpHRangeBio-LyteAmpholyte(stock)rangeBio-LyteAmpholyte(stock)Conc.(w/v)SampleSolutionVolumePer5mlSampleSolutionVolumePer50ml3-103/1040%25

l250

l4-74/640%12.5

l125

l5/740%12.5

l125

l3-63/540%25

l250

l4/640%12.5

l125

l5-85/840%25

l250

l7-107/940%12.5

l125

l8/1020%25

l250

lSuggestedBio-lyteampholytecompositionforIPGuse34ReagentAmount7Murea4.1mlof8.5stockor2.1gureain3mlH2O2MThiourea760mg2mMTBP50ulof200mMTBPstock4%CHAPS200mg0.2%carrierampholytesSeetable0.0002%bromophenolblue10ulof0.1%stockddH2OTo5mlMultiplechaotropicagentsolutionpreparation35ReagentAmount5Murea2.9mlof8.5stockor1.5gureain3mlH2O2MThiourea760mg2mMTBP50ulof200mMTBPstock2%CHAPS100mg2%SB3-10100mg0.2%carrierampholytesSeetable40mMTris24.2mg0.0002%bromophenolblue10ulof0.1%stockddH2OTo5mlMultiplesurfactantsolutionpreparation36組織勻漿

硫酸銨分級(jí)離子交換凝膠過濾親和層析

一種目的蛋白經(jīng)五個(gè)純化步驟（分別取樣）的凝膠電泳圖37用超離心技術(shù)分離出細(xì)胞器、質(zhì)膜和細(xì)胞核等成分，再用適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)溶解液進(jìn)行溶解。其優(yōu)點(diǎn)是不僅大大減少樣品的復(fù)雜性，而且可對(duì)分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。但該法需要專業(yè)儀器，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽性。順序抽提法：根據(jù)細(xì)胞蛋白溶解性的差異，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液進(jìn)行抽提的方法。第一步：用Tris堿溶液裂解細(xì)胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的pellet用標(biāo)準(zhǔn)IEF樣品液溶解提取高疏水性蛋白；第三步：用含復(fù)合表面活性劑的蛋白溶解液，最后抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白約占整個(gè)樣品的11%（W/W）。三、亞蛋白質(zhì)組成分的提取38ForveryhydrophobicproteinsMembraneproteinsdonoteasilygointosolution.Alotofoptimizationworkisrequired.1.Thioureaprocedure2.SDSprocedure3.Newzwitterionicdetergentandsulfobetains39Thioureaprocedure7Murea+2Mthiourea(Rabilloud,1998)Pros:Increasespotnumberconsiderably.Cons:Causingartifactspots.

Causingverticalstreakingatacidicarea.40Example,thioureaprocedureLysisbuffer,8MureaLysisbuffer,7Murea+2Mthiourea41SDSprocedureForemergencycase.Upto2%SDScanbeused.HavetodiluteSDSsamplesatleast20fold

withureaananonorzwitterionicdetergentcontainingsolutions.ThemajorreasonsforusingSDS:1.Formationofoligomerscanbeprevented2.Dissolvedtoughcellwallssamples(withboiling)3.Dissolvedveryhydrophobicproteins42Newzwitterionicdetegentandsulfobetains

Threemajortypesofdetergent1.NonionicdetergentTritonx-100,Tween20,Brij-352.IonicdetergentSDS,CTAB,Digitonin3.ZwittergentCHAPS,CHAPSO,Zwittergent3-08,3-10,3-12…43亞細(xì)胞器的分離

亞細(xì)胞器的差速離心及密度梯度離心分離

44

細(xì)胞分離

激光捕獲微解剖(LaserCaptureMicrodissection,LCM)

方法

激光捕獲微切割儀

激光捕獲微切割流程

45乙烯乙酸乙烯酯膜激光捕獲微切割位置

激光捕獲微切割結(jié)果對(duì)比

46低豐度蛋白的分離：盡管增加上樣量和提高總蛋白的溶解度能增加分離時(shí)的低豐度蛋白的量，但同時(shí)增加了高豐度蛋白的負(fù)荷，且造成蛋白的疊加效應(yīng)而影響分離?，F(xiàn)常用預(yù)分級(jí)＋窄pH膠的微制備技術(shù)進(jìn)行分離：即將總蛋白組分成蛋白質(zhì)組亞群，再用pH梯度小于2個(gè)pH單位的IPG膠進(jìn)行窄pH范圍的分離。

四、特殊樣品的制備47強(qiáng)堿性蛋白質(zhì)（如核糖體）的處理：先將蛋白預(yù)處理以富集，再用特殊pH梯度的IPG膠條（如pH3－12、4-12或10-12）進(jìn)行等電聚焦。其中窄范圍堿性IPG膠（如pH10-12）的挑戰(zhàn)是克服反向、陰極向陽極、電滲流和水平條紋模式，而寬范圍的堿性IPG膠（如pH3-12、4-12）等消除了窄范圍膠所需要的專門水化液。48極端分子量的蛋白質(zhì)：小于8kD和大于200kD的蛋白在常規(guī)IPG-2D上不易看到，這可能是在Tris/glycine緩沖液中，樣品和游離的dodelcylsulfateions持續(xù)積累濃縮，與小分子量的蛋白質(zhì)發(fā)生對(duì)流混合，產(chǎn)生茸毛狀的或模糊的帶，從而降低小蛋白的分辨率；在膠底端，高濃度的十二磺酸使蛋白固定致染色困難。至于高分子量蛋白少的原因可能是在變性條件下，蛋白質(zhì)復(fù)合物變成了多肽，或者可能是大分子。49

Measuretheproteinconc.inyoursamples.WidelyusedproteinassaymethodsBiuretLowrymethods.Bradfordmethods.UVmethods.SpecialmethodsOthercommercialmethods.BCAassay(bicinchoninicacidassay,Pierce)DCproteinassay(detergentcompatible,Bio-rad)DC/RCproteinassay(detergent/reducingagentcompatible,Bio-rad)BeforerunninngIEF,youshould…五、蛋白質(zhì)含量測(cè)定50

Principle:Thereactivityofthepeptidebondswiththecopper[II]ionsunderalkalineconditionstoformpurplebiuretcomplex.Interferingsubstance:Ammoniumsulfate,Tris,etc.Sensitivity:>1-20mg1.BiuretmethodAwhite,crystalline,nitrogenoussubstance,C2O2N3H5,formedbyheatingurea.Itisintermediatebetweenureaandcyanuricacid.

51

Principle:Thereactivityofthepeptidenitrogen[s]withthecopper[II]ionsunderalkalineconditionsandthesubsequentreductionoftheFolin-Ciocalteayphosphomolybdicphosphotungsticacidtoheteropolymolybdenumbluebythecopper-catalyzedoxidationofaromaticacids(Try,Try).Interferingsubstance:aminoacidderivatives,certainbuffers,drugs,lipids,sugars,salts,nucleicacids,ammoniumions,zwitterionicbuffers,nonionicbuffersandthiolcompounds.Sensitivity:>0.1mg2.Lowrymethod52

Principle:TheassayisbasedontheobservationthattheabsorbancemaximumforanacidicsolutionofCoomassieBrilliantBlueG-250shiftsfrom465nmto595nmwhenbindingtoproteinoccurs.TheCoomassie?dyebindsprimarilywithbasicandaromaticsidechains.Theinteractionwitharginineisverystrongandlessstrongwithhistidine,lysine,tyrosine,tryptophan,andphenylalanine.About1.5to3moleculesofdyebindperpositivechargeontheprotein.Interferingsubstance:aminoacidderivatives,certainbuffers,drugs,lipids,sugars,salts,nucleicacids,ammoniumions,zwitterionicbuffers,nonionicbuffersandthiolcompounds.Sensitivity:>10-100ug3.Bradfordmethod53

4.UVmethodsPrinciple:Thearomaticgroups(Phe,Tyr,Trp)andthepeptidebondshavemaximumUVabsorbancearound280nmand200nm.280nmwasusedmostfrequently.Interferingsubstance:anythingcontainingSensitivity:>0.1–1mg54

5.SpecialmethodsPrinciple:Someproteinscontainfunctionalgroups,eg:Hemeinperoidase,hemoglobinandtransferrincanbedetectedat403nm,Cd2+insomephytochelatins.Interferingsubstance:similarfunctionalgroups.Sensitivity:various55

6.CommercialmethodsA.BCAassay(bicinchoninicacidassay,Pierce)B.DCproteinassay(detergentcompatible,Bio-rad)C.DC/RCproteinassay(detergent/reducingagentcompatible,Bio-rad)Thisprocessisatwo-stepreaction.Protein+Cu2++OH-Cu1+Cu1++2BCACu1+/BCAchromophore(562nm).56

Summaryofproteinquantitationmethods57六、出現(xiàn)問題和解決辦法樣品中非蛋白的不純物質(zhì)可能干擾蛋白的分離及二維電泳圖譜的質(zhì)量。因此，在樣品制備中需考慮清除這些雜質(zhì)。一、裂解液的影響離子去污劑，如SDS，通常用于蛋白的提取和溶解，但卻強(qiáng)烈干擾IEF。SDS與多肽形成復(fù)合物。如果SDS不被除去，則不能正確聚焦。通常用含有兼性離子去污劑或非離子去污劑的重泡脹溶液稀釋含SDS的樣品，因此，其終濃度為0.25％或更低。其他去污劑與之的比率為8：1。通過丙酮沉淀也可去除部分SDS。在高溫下沉淀將最大限度除去SDS。但是在-20℃沉淀會(huì)更完全。苯酚通常在許多植物組織中出現(xiàn)，通過酶催化的氧化反應(yīng)來修飾蛋白。通常在組織提取過程中應(yīng)用還原劑防止苯酚的氧化(如β-巰基乙醇、DTT)，也可通過沉淀方法迅速從酚組分中分離蛋白。或者用抑制劑，如硫脲來滅活多酚氧化酶，或用聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯聚吡咯烷酮吸收酚來清除酚組分。58二、鹽濃度的影響鹽離子可干擾電泳過程，應(yīng)盡可能保持低濃度或加以清除。在IPG膠條中，鹽離子可導(dǎo)致溶液的電導(dǎo)率增大。通過延長(zhǎng)IEF的聚焦時(shí)間，直到離子移至膠條末端時(shí)聚焦才會(huì)完成。水的運(yùn)動(dòng)也可能導(dǎo)致膠條一端干燥，一端膨脹，在膠條中的鹽離子可能導(dǎo)致較大區(qū)域不能聚焦(如水平條紋)。如果IPG膠條在樣品中進(jìn)行重泡脹，則重泡脹溶液的鹽濃度，應(yīng)低于10mmol／L。如果在樣品杯中加樣，則可耐受50mmol／L左右的鹽濃度。然而，當(dāng)?shù)鞍缀鋈灰频揭粋€(gè)低鹽環(huán)境中時(shí)，可能在加樣處發(fā)生沉淀。通常用透析、旋轉(zhuǎn)透析、凝膠過濾和沉淀／重懸的方法進(jìn)行脫鹽處理。透析是一個(gè)很有效的方法，可出現(xiàn)較少的樣品丟失，然而耗時(shí)較多，并要求較大體積的溶液。盡管旋轉(zhuǎn)透析較迅速，但蛋白吸附于透析膜也是一個(gè)問題。它應(yīng)該在加入尿素和去污劑之前應(yīng)用。凝膠過濾和沉淀／重懸后同樣可導(dǎo)致蛋白丟失。59三、其他影響因素1．內(nèi)源性小分子內(nèi)源性小分子，如核酸、代謝物和磷脂等。這些物質(zhì)通常帶負(fù)電荷，能發(fā)生偏陽極側(cè)的聚焦不全。通常TCA／丙酮沉淀在除去這類物質(zhì)時(shí)特別有效。2．核酸核酸(RNA、DNA)增加樣品的黏度，并導(dǎo)致背景彌散；高分子質(zhì)量的核酸能阻滯凝膠孔徑；核酸可能通過電穩(wěn)態(tài)相互作用與蛋白結(jié)合，從而阻礙聚焦；如果分離的蛋白通過銀染檢測(cè)，凝膠中的核酸也將染色，導(dǎo)致高背景。通常可用DNase和RNaseA混合物處理樣品中的核酸，將其變?yōu)閱位蚬押塑账?。這經(jīng)常需加入0.1倍體積的含有1mg／LDNase、0.25mg／mLRNaseA的溶液和50mmol／LMgCl2溶液在冰上孵育。然而DNase和RNaseA也可能出現(xiàn)在二維電泳圖像中。超離也可用來除去大分子核酸，然而，也會(huì)除去相對(duì)高分子質(zhì)量蛋白。當(dāng)應(yīng)用低離子強(qiáng)度的提取溶液時(shí)，帶負(fù)電荷的核酸很可能與帶正電荷的蛋白形成復(fù)合物。高離子強(qiáng)度提取或高pH提取可最大程度減少這些相互作用(注意：提取時(shí)所加的鹽離子必須在后續(xù)步驟中除去)。603.多糖多糖能阻礙凝膠孔徑，或?qū)е鲁恋恚蜓娱L(zhǎng)聚焦時(shí)間?；虺霈F(xiàn)水平條紋。某些多糖含有負(fù)電荷，能與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物。通常用硫酸銨或苯酚／醋酸銨沉淀的方法，隨后離心。超速離心可以除去高分子多糖。4.脂肪許多蛋白質(zhì)，尤其是膜蛋白，可以與脂類形成復(fù)合物，這會(huì)降低其溶解性，影響其等電點(diǎn)和分子量。脂類也能與去污劑形成復(fù)合物，減低其效率。通常用強(qiáng)變性劑和去污劑最大程度減少蛋白與脂類的相互作用，但可能需過多的去污劑。5.不溶物質(zhì)在樣品中的不溶物質(zhì)能阻礙凝膠孔徑，并導(dǎo)致聚焦不良。當(dāng)應(yīng)用樣品杯時(shí)，它能阻礙蛋白進(jìn)入IPG膠條中。通常在IEF之前，應(yīng)除去不溶物質(zhì)。61WashtissueinbufferedisotonicsalinesolutionUselysis-denaturingbufferinratioof0.5mLtissueto2.0mLbufferUseappropriatedisruptiontolysecellsHomogenizer–mechanicalorelectrical(Polytron)Mincetissuewithrazorthenthreecyclesoffreeze-thawandvortexSpin@20,000xginF2402Hrotorfor60minutesat18CExchangesupernatantwithStartBufferonPD10columnUsing0.2-0.3mLofsample,determineproteinconcentrationbyMicroBCAassayInject1-5mgofproteinintoth