2007年中國部分地區(qū)雞傳染性支氣管炎病毒的分子流行病學(xué)解析與防控啟示一、引言1.1研究背景與意義雞傳染性支氣管炎（AvianInfectiousBronchitis，IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒（InfectiousBronchitisVirus，IBV）引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（WOAH）視為重要疾病。自1931年在美國首次被發(fā)現(xiàn)以來，已在全球廣泛傳播，對養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。IBV主要侵害雞的呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)。感染雞會(huì)出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、打噴嚏、氣管啰音等呼吸道癥狀，產(chǎn)蛋雞還會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)蛋量下降、蛋品質(zhì)變差等生殖系統(tǒng)癥狀，部分毒株還可導(dǎo)致腎臟腫大蒼白、腎小管和輸尿管尿酸鹽沉積等泌尿系統(tǒng)病變，以及消化功能紊亂、生長發(fā)育受阻等消化系統(tǒng)問題。在全球范圍內(nèi)，已發(fā)現(xiàn)多種IBV血清型和基因型，且病毒具有很強(qiáng)的變異性，不同地域的變異株未能提供良好的交叉保護(hù)，導(dǎo)致疫情反復(fù)爆發(fā)。在中國，養(yǎng)雞業(yè)是畜牧業(yè)的重要組成部分，對保障肉類供應(yīng)和農(nóng)民增收具有重要意義。然而，雞傳染性支氣管炎的頻繁發(fā)生嚴(yán)重威脅著養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，每年因IB造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)億元，包括雞只死亡、生產(chǎn)性能下降、治療費(fèi)用以及疫苗免疫成本等。例如，在一些規(guī)?；B(yǎng)雞場，一旦發(fā)生IB疫情，雛雞的死亡率可高達(dá)25%以上，產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋量下降25%-50%，不僅影響了雞肉和雞蛋的產(chǎn)量，還降低了產(chǎn)品的質(zhì)量，給養(yǎng)殖戶帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。此外，IBV的持續(xù)變異使得傳統(tǒng)疫苗的免疫效果受到挑戰(zhàn)。由于病毒的S1基因高度可變，不斷產(chǎn)生新的變異株和血清型，導(dǎo)致現(xiàn)有的疫苗無法對所有流行毒株提供有效的保護(hù)，免疫失敗的情況時(shí)有發(fā)生。因此，深入了解IBV的分子流行病學(xué)特征，掌握病毒的變異規(guī)律和流行趨勢，對于制定科學(xué)有效的防控策略、研發(fā)新型疫苗和診斷方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。通過對不同地區(qū)IBV毒株的分子生物學(xué)分析，可以明確當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢流行毒株，為疫苗的選擇和免疫程序的優(yōu)化提供依據(jù)，從而提高防控效果，減少經(jīng)濟(jì)損失，促進(jìn)養(yǎng)雞業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1病毒特性研究雞傳染性支氣管炎病毒屬于尼多病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒屬、冠狀病毒Ⅲ群，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒。其基因組長度約為27-31kb，包含多個(gè)開放閱讀框（ORF），可編碼多種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白主要包括刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N），各蛋白在病毒的感染、復(fù)制和致病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。S蛋白是IBV最重要的表面蛋白，由S1和S2兩個(gè)亞基組成。S1亞基含有多個(gè)抗原表位，是決定病毒血清型和免疫原性的關(guān)鍵區(qū)域，其高度可變，頻繁的基因突變、缺失、重組等導(dǎo)致S1基因序列差異較大，進(jìn)而產(chǎn)生眾多血清型和基因型，目前世界上已分離出30多個(gè)血清型。M蛋白參與病毒包膜的形成和病毒粒子的組裝；E蛋白在病毒的出芽和釋放過程中起作用；N蛋白則與病毒基因組RNA結(jié)合，形成核衣殼結(jié)構(gòu)，對病毒基因組起到保護(hù)作用，并參與病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程。IBV對環(huán)境抵抗力不強(qiáng)，對普通消毒藥敏感，如1%來蘇兒、1%石炭酸、0.1%高錳酸鉀、1%福爾馬林及70%酒精等均能在3-5min內(nèi)將其殺死。病毒在56℃條件下15分鐘即可失去活力，但對低溫有一定的抵抗力，在-20℃可存活7年。在室溫中能抵抗1%HCl（pH2）、1%石炭酸和1%NaOH（pH12）1小時(shí)，而在pH7.8時(shí)最為穩(wěn)定。此外，IBV本身沒有血凝特性，但經(jīng)胰酶、卵磷脂酶C、家兔A型魏氏梭菌等處理后具有血凝活性，且能干擾新城疫病毒（NDV）的復(fù)制，抑制NDV產(chǎn)生紅細(xì)胞凝集素。1.2.2流行病學(xué)研究IBV的宿主主要是雞，各種年齡的雞都可感染，但以雛雞和產(chǎn)蛋雞發(fā)病較多，40日齡以內(nèi)的雛雞發(fā)病最為嚴(yán)重，死亡率也高。該病主要通過呼吸道傳播，病毒從呼吸道排出，通過空氣飛沫傳給易感雞，也可通過被污染的飼料、飲水及飼養(yǎng)用具經(jīng)消化道感染。在集約化雞群中傳播迅速，通常1-2天內(nèi)就能波及全群。目前尚不能證明本病能經(jīng)雞胚垂直傳播。IB在一年四季均可發(fā)生，但以冬春寒冷季節(jié)最為嚴(yán)重。氣候突變、雞群擁擠、過熱、過冷、通風(fēng)不良、營養(yǎng)失衡、疫苗接種等應(yīng)激因素均會(huì)促進(jìn)本病的發(fā)生。在全球范圍內(nèi)，IBV呈現(xiàn)出多樣化的流行態(tài)勢，不同地區(qū)的優(yōu)勢流行毒株存在差異。我國流行的主要毒株為QX（GI-19）、4/91（GI-13）、TW（GI-7）、MASS（GI-1）等，其中QX是優(yōu)勢毒株，且流行具有明顯的地域性特征，主要集中在禽類養(yǎng)殖較為密集的中東部和南方地區(qū)。有研究表明，我國南方和華中地區(qū)商品雞養(yǎng)殖場普遍存在多個(gè)基因型IBV毒株，包括重組毒株，其中QX、TW、4/91是最常見的基因型，且TW流行呈上升趨勢。1.2.3防控措施研究在預(yù)防方面，疫苗接種是防控IB的關(guān)鍵措施之一。目前市場上的IB疫苗主要有弱毒疫苗和滅活疫苗。弱毒疫苗免疫效果產(chǎn)生快，能刺激機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫，但免疫期相對較短，且毒力可能返強(qiáng)；滅活疫苗安全性高，免疫期長，但產(chǎn)生免疫力較慢，需多次免疫。由于IBV血清型眾多且存在變異，選擇合適的疫苗毒株至關(guān)重要。一般根據(jù)當(dāng)?shù)氐牧餍卸局觐愋蛠磉x擇相應(yīng)的疫苗，如在QX毒株流行地區(qū)，可選用含有QX株或與之抗原性相近毒株的疫苗。同時(shí)，合理的免疫程序也十分關(guān)鍵，通常雛雞在1日齡、5-7日齡進(jìn)行首免，之后根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行多次加強(qiáng)免疫，開產(chǎn)前還需進(jìn)行油乳劑滅活疫苗免疫。除疫苗接種外，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和生物安全措施也不容忽視。飼養(yǎng)過程中要注意降低飼養(yǎng)密度，避免雞群擁擠；保持雞舍溫度、濕度適宜，避免過冷過熱；加強(qiáng)通風(fēng)換氣，防止有害氣體刺激呼吸道；合理配比飼料，確保營養(yǎng)均衡，防止維生素尤其是維生素A的缺乏；做好嚴(yán)格的防疫隔離和消毒措施，定期對雞舍、用具等進(jìn)行消毒，防止病毒傳入和傳播。在治療方面，目前尚無特效藥物能夠徹底治愈IB。一旦雞群發(fā)病，主要采取對癥治療和防止繼發(fā)感染的措施。如使用抗病毒藥物、抗菌藥物來緩解癥狀和控制繼發(fā)感染，同時(shí)提供清潔的飲水和飼料，保持良好的飼養(yǎng)環(huán)境，以提高雞群的抵抗力，促進(jìn)康復(fù)。對于腎病變型傳染性支氣管炎的病雞，可采用口服補(bǔ)液鹽、0.5%碳酸氫鈉、維生素C等藥物投喂，以緩解腎臟病變和脫水癥狀。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容1.3.1研究目標(biāo)本研究旨在深入了解2007年中國部分地區(qū)雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）的分子流行病學(xué)特征，通過對不同地區(qū)IBV毒株的分離鑒定、基因序列分析等研究，明確當(dāng)?shù)貎?yōu)勢流行毒株的基因型，揭示病毒的變異規(guī)律和進(jìn)化關(guān)系，為雞傳染性支氣管炎的防控提供科學(xué)依據(jù)和理論支持，具體目標(biāo)如下：從中國2007年部分地區(qū)疑似感染雞傳染性支氣管炎的雞群中，成功分離和鑒定IBV毒株，獲得具有代表性的病毒樣本。對分離得到的IBV毒株的S1基因、N基因等關(guān)鍵基因進(jìn)行序列測定和分析，明確各基因的核苷酸序列特征和氨基酸序列特征，為后續(xù)的基因型劃分和進(jìn)化分析奠定基礎(chǔ)。通過系統(tǒng)發(fā)育分析等方法，對不同地區(qū)的IBV毒株進(jìn)行基因型劃分，確定2007年中國部分地區(qū)的優(yōu)勢流行基因型，分析其地域分布特點(diǎn)和流行趨勢。綜合研究結(jié)果，結(jié)合當(dāng)?shù)仞B(yǎng)雞業(yè)的實(shí)際情況，提出針對性的雞傳染性支氣管炎防控建議，為養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)支持。1.3.2研究內(nèi)容為實(shí)現(xiàn)上述研究目標(biāo)，本研究主要開展以下內(nèi)容的研究：病毒的分離與鑒定：采集2007年中國部分地區(qū)疑似感染雞傳染性支氣管炎的病雞樣本，包括氣管、肺臟、腎臟、輸卵管等組織。將采集的樣本處理后，接種于9-11日齡的SPF雞胚，進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)。通過觀察雞胚的病變特征，如雞胚蜷縮、矮小、出血等，初步判斷是否有病毒生長。對分離到的病毒進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，采用電鏡觀察病毒形態(tài)，利用血清學(xué)方法如病毒中和試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)等，確定分離株是否為IBV，并對其血清型進(jìn)行初步分析?；蛐蛄袦y定與分析：提取分離得到的IBV毒株的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增S1基因、N基因等關(guān)鍵基因片段。將擴(kuò)增得到的基因片段進(jìn)行測序，獲得其核苷酸序列。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件，對測序結(jié)果進(jìn)行分析，包括序列比對、核苷酸組成分析、氨基酸序列推導(dǎo)等。通過與GenBank中已有的IBV基因序列進(jìn)行比對，分析本研究中分離毒株的基因變異情況，計(jì)算核苷酸和氨基酸的同源性，確定其與其他毒株的親緣關(guān)系。基因型劃分與進(jìn)化分析：根據(jù)S1基因的核苷酸序列，利用系統(tǒng)發(fā)育分析軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對不同地區(qū)的IBV毒株進(jìn)行基因型劃分。分析不同基因型毒株的分布特點(diǎn)，探討其在不同地區(qū)的流行規(guī)律。結(jié)合時(shí)間因素，研究不同年份間IBV基因型的演變情況，分析病毒的進(jìn)化趨勢，探究可能導(dǎo)致病毒進(jìn)化的因素，如基因突變、基因重組等。防控建議的提出：根據(jù)本研究對2007年中國部分地區(qū)IBV分子流行病學(xué)特征的研究結(jié)果，結(jié)合當(dāng)?shù)仞B(yǎng)雞業(yè)的養(yǎng)殖模式、免疫程序等實(shí)際情況，提出針對性的防控建議。包括合理選擇疫苗毒株，優(yōu)化免疫程序，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和生物安全措施等，以降低雞傳染性支氣管炎的發(fā)病率和死亡率，減少經(jīng)濟(jì)損失，促進(jìn)養(yǎng)雞業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。二、雞傳染性支氣管炎病毒概述2.1病毒分類與結(jié)構(gòu)雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）在病毒分類學(xué)上屬于尼多病毒目（Nidovirales）、冠狀病毒科（Coronaviridae）、冠狀病毒屬（Coronavirus）、冠狀病毒Ⅲ群。作為一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)與組成，對病毒的感染、傳播和致病起著關(guān)鍵作用。IBV粒子略呈球形，直徑約80-120納米，表面有纖突和囊膜。其基因組為不分節(jié)段的單股正鏈核糖核酸，長度約為27.6kb，不同毒株的基因長度略有差異，且本身具有感染性和信使RNA功能，這使得它能直接在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，啟動(dòng)病毒的復(fù)制過程。病毒粒子主要由外面的囊膜和內(nèi)部的核衣殼構(gòu)成。外層囊膜上存在兩種重要的病毒糖蛋白，分別是纖突蛋白（S蛋白）和膜蛋白（M蛋白）。S蛋白是聚合物，由大小幾乎相同的兩個(gè)多肽通過非共價(jià)連接而成，其前體可被蛋白酶切割成N端的S1以及C端的S2。S蛋白以2聚體或者3聚體的形式存在，主要承擔(dān)著兩方面至關(guān)重要的功能：一是粘附宿主細(xì)胞表面的受體，二是引發(fā)病毒粒子與宿主細(xì)胞膜的融合，從而使病毒粒子得以順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。其中，S1組成S蛋白的球形頭部，負(fù)責(zé)病毒吸附細(xì)胞表面，是決定IBV組織嗜性和血清型特異性決定簇的主要蛋白，其氨基酸組成和序列的變化，直接影響著病毒對不同組織的感染能力以及血清型的差異；S2則負(fù)責(zé)融合細(xì)胞膜，將病毒粒子與宿主細(xì)胞緊密連接，促進(jìn)病毒的入侵。除S蛋白外，冠狀病毒表面還分布著大量比S蛋白小一些的跨膜糖蛋白M。M蛋白的N端含有潛在糖基化位點(diǎn)的約20個(gè)氨基酸暴露在病毒囊膜外，形成N-寡聚糖，能形成抗原決定簇，而位于C端的氨基酸，則與N蛋白相互作用，使N蛋白結(jié)合至囊膜上，參與病毒復(fù)制過程。M蛋白在病毒粒子的形成過程中不可或缺，它介導(dǎo)病毒粒子出芽，與N蛋白共同作用并將其結(jié)合到囊膜上，還能誘導(dǎo)白細(xì)胞產(chǎn)生α-干擾素，在補(bǔ)體存在的情況下中和病毒，對病毒的感染和傳播起到重要的調(diào)控作用。核衣殼直徑為10-20納米，呈螺旋形，由正鏈核糖核酸及其外面包裹的磷酸化核蛋白（N蛋白）組成。N蛋白堿性氨基酸含量豐富，大約為17.2%，其中80%的堿性氨基酸在位置上比較保守，且中間部分比兩端更為保守。N蛋白可能參與病毒核糖核酸合成、轉(zhuǎn)錄和翻譯等多個(gè)關(guān)鍵過程，它與病毒核糖核酸緊密結(jié)合，形成核衣殼結(jié)構(gòu)，不僅對病毒基因組起到了保護(hù)作用，防止其受到外界環(huán)境的破壞，還在病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，確保病毒遺傳信息的準(zhǔn)確傳遞和表達(dá)。2.2病毒基因組及主要蛋白功能雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）的基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，長度約27.6kb，不同毒株間基因長度略有差異。這種單股正鏈RNA不僅具有感染性，還具備信使RNA的功能，能夠直接在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，指導(dǎo)病毒蛋白質(zhì)的合成，啟動(dòng)病毒的復(fù)制周期?；蚪M上包含多個(gè)開放閱讀框（ORF），可編碼多種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，這些蛋白在病毒的生命周期中各司其職，共同維持病毒的生存和傳播。在IBV的結(jié)構(gòu)蛋白中，刺突蛋白（S蛋白）是最為關(guān)鍵的蛋白之一。S蛋白由S1和S2兩個(gè)亞基組成，以2聚體或者3聚體的形式存在于病毒囊膜表面。S1亞基由500-600個(gè)氨基酸組成，構(gòu)成了S蛋白的球形頭部，負(fù)責(zé)病毒吸附細(xì)胞表面。其氨基酸組成和序列的高度變異性，決定了IBV的組織嗜性和血清型特異性決定簇，是病毒與宿主細(xì)胞特異性結(jié)合的關(guān)鍵部位，直接影響病毒對不同組織的感染能力以及血清型的差異。研究表明，S1蛋白上的特定氨基酸位點(diǎn)突變，可能導(dǎo)致病毒對呼吸道、腎臟或生殖道等不同組織的親和性改變，從而引發(fā)不同類型的雞傳染性支氣管炎，如呼吸型、腎型和生殖型等。同時(shí)，S1蛋白也是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和血凝抑制抗體的主要抗原，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著核心作用，其抗原性的變化會(huì)影響疫苗的免疫效果和病毒的免疫逃逸能力。S2亞基則負(fù)責(zé)融合細(xì)胞膜，它通過與宿主細(xì)胞膜的相互作用，促使病毒粒子與宿主細(xì)胞緊密連接并實(shí)現(xiàn)融合，進(jìn)而使病毒得以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，啟動(dòng)感染過程。S2亞基在病毒入侵細(xì)胞的過程中起著不可或缺的橋梁作用，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性對于病毒的感染性至關(guān)重要。膜蛋白（M蛋白）是冠狀病毒表面大量存在的跨膜糖蛋白，雖然比S蛋白小，但在病毒粒子的形成和復(fù)制過程中同樣發(fā)揮著重要作用。M蛋白的N端約20個(gè)氨基酸含有潛在糖基化位點(diǎn)，暴露在病毒囊膜外，形成N-寡聚糖，能夠形成抗原決定簇，參與病毒與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用。其C端氨基酸與N蛋白相互作用，使N蛋白結(jié)合至囊膜上，共同參與病毒的復(fù)制過程。M蛋白介導(dǎo)病毒粒子出芽，在病毒從宿主細(xì)胞釋放的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它與N蛋白協(xié)同工作，確保病毒粒子的正常組裝和釋放。此外，M蛋白還能誘導(dǎo)白細(xì)胞產(chǎn)生α-干擾素，在補(bǔ)體存在的情況下中和病毒，調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)，對病毒的感染和傳播起到重要的調(diào)控作用。核衣殼蛋白（N蛋白）是與病毒基因組RNA緊密結(jié)合的磷酸化蛋白，堿性氨基酸含量豐富，大約為17.2%，其中80%的堿性氨基酸在位置上比較保守，中間部分比兩端更為保守。N蛋白與病毒核糖核酸結(jié)合，形成核衣殼結(jié)構(gòu)，對病毒基因組起到了至關(guān)重要的保護(hù)作用，防止其受到外界環(huán)境因素的破壞，確保病毒遺傳信息的穩(wěn)定性。同時(shí)，N蛋白可能參與病毒核糖核酸合成、轉(zhuǎn)錄和翻譯等多個(gè)關(guān)鍵過程，在病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，保證病毒遺傳信息的準(zhǔn)確傳遞和表達(dá)，維持病毒的生存和繁殖能力。2.3病毒的傳播與致病機(jī)制雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）具有較強(qiáng)的傳播能力，在雞群中極易擴(kuò)散，給養(yǎng)雞業(yè)帶來了嚴(yán)重的威脅。其傳播途徑主要包括呼吸道傳播、消化道傳播以及可能存在的垂直傳播。呼吸道傳播是IBV的主要傳播方式。感染雞會(huì)通過呼吸、咳嗽、打噴嚏等活動(dòng)，將病毒大量排放到周圍空氣中，形成含有病毒的飛沫和氣溶膠。這些攜帶病毒的微?？梢栽诳諝庵虚L時(shí)間懸浮，并隨著空氣流動(dòng)迅速擴(kuò)散。當(dāng)易感雞吸入含有病毒的空氣時(shí)，病毒便會(huì)進(jìn)入其呼吸道，附著在呼吸道黏膜上皮細(xì)胞表面，進(jìn)而引發(fā)感染。在集約化養(yǎng)雞場中，雞群飼養(yǎng)密度大，雞舍空間相對封閉，空氣流通不暢，這為病毒的呼吸道傳播提供了極為有利的條件。一旦有一只雞感染IBV，病毒可在短時(shí)間內(nèi)通過空氣飛沫傳播至整個(gè)雞群，通常1-2天內(nèi)就能使全群雞受到感染。消化道傳播也是IBV傳播的重要途徑之一。被病毒污染的飼料、飲水、飼養(yǎng)用具等，都可能成為病毒傳播的媒介。感染雞排出的糞便、呼吸道分泌物等含有大量病毒，若污染了飼料和飲水，當(dāng)易感雞接觸并攝入這些被污染的物質(zhì)時(shí)，病毒便可通過消化道進(jìn)入雞體。雞在啄食、飲水過程中，口腔和消化道黏膜直接與病毒接觸，病毒能夠突破黏膜屏障，感染消化道上皮細(xì)胞，從而引發(fā)感染。此外，飼養(yǎng)人員的衣物、鞋子以及運(yùn)輸工具等，如果接觸過感染雞或被污染的環(huán)境，再進(jìn)入健康雞群的飼養(yǎng)區(qū)域，也可能將病毒帶入，導(dǎo)致病毒通過間接接觸的方式經(jīng)消化道傳播。雖然目前尚無確鑿證據(jù)證明IBV能經(jīng)雞胚垂直傳播，但在一些研究和實(shí)際養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn)，感染IBV的種雞所產(chǎn)的蛋，其內(nèi)部可能檢測到病毒核酸，這提示垂直傳播存在一定的可能性。如果種雞在感染IBV后處于病毒血癥期，病毒有可能通過血液循環(huán)進(jìn)入卵巢，感染正在發(fā)育的卵泡，使得種蛋在形成過程中就被病毒污染。這種被污染的種蛋在孵化過程中，可能導(dǎo)致雛雞在胚胎期就感染病毒，從而影響雛雞的正常發(fā)育，增加雛雞的死亡率和發(fā)病率。IBV侵入雞體后，會(huì)在體內(nèi)引發(fā)一系列復(fù)雜的感染過程和致病機(jī)制。病毒首先會(huì)吸附并侵入呼吸道、泌尿生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等靶器官的上皮細(xì)胞。其表面的刺突蛋白（S蛋白）在這個(gè)過程中起著關(guān)鍵作用，S1亞基能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合宿主細(xì)胞表面的受體，使得病毒能夠與細(xì)胞緊密結(jié)合。隨后，S2亞基介導(dǎo)病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜的融合，病毒基因組RNA得以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而啟動(dòng)病毒的復(fù)制周期。在細(xì)胞內(nèi)，病毒基因組RNA利用宿主細(xì)胞的各種物質(zhì)和能量，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，合成病毒所需的各種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。新合成的病毒蛋白和基因組RNA在細(xì)胞內(nèi)組裝成新的病毒粒子，然后通過出芽的方式釋放到細(xì)胞外，繼續(xù)感染周圍的細(xì)胞，導(dǎo)致感染范圍不斷擴(kuò)大。隨著病毒在體內(nèi)的大量繁殖和擴(kuò)散，會(huì)引發(fā)機(jī)體一系列的免疫反應(yīng)。機(jī)體的免疫系統(tǒng)會(huì)識(shí)別病毒抗原，激活免疫細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等，產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。然而，在免疫反應(yīng)過程中，免疫細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子等物質(zhì)，在對抗病毒的同時(shí)，也可能對機(jī)體自身組織造成損傷，引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致呼吸道黏膜充血、水腫、分泌物增多，出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、打噴嚏等呼吸道癥狀；在泌尿生殖系統(tǒng)，可導(dǎo)致腎臟腫大、蒼白，腎小管和輸尿管尿酸鹽沉積，以及輸卵管發(fā)育異常、產(chǎn)蛋量下降、蛋品質(zhì)變差等癥狀；在消化系統(tǒng)，可能引起消化功能紊亂，導(dǎo)致雞只生長發(fā)育受阻。此外，IBV的持續(xù)感染和不斷變異，還可能導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)的紊亂，使得雞群對其他病原體的抵抗力下降，容易繼發(fā)其他細(xì)菌、病毒等感染，進(jìn)一步加重病情，增加死亡率和經(jīng)濟(jì)損失。三、材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1病料來源本研究選取了2007年中國部分地區(qū)（山東、河南、江蘇、廣東、廣西等）具有典型雞傳染性支氣管炎臨床癥狀的病雞作為病料來源。這些病雞主要來自規(guī)模化養(yǎng)雞場和部分散養(yǎng)戶，涵蓋了不同品種、年齡和養(yǎng)殖環(huán)境的雞群。臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽、打噴嚏、氣管啰音等呼吸道癥狀，部分病雞出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、羽毛松亂、生長發(fā)育遲緩等全身性癥狀，產(chǎn)蛋雞還伴有產(chǎn)蛋量下降、蛋品質(zhì)變差，如軟殼蛋、畸形蛋增多等情況，部分病雞呈現(xiàn)腎臟腫大、蒼白，腎小管和輸尿管尿酸鹽沉積，即“花斑腎”的病變特征。在無菌操作條件下，采集病雞的氣管、肺臟、腎臟、輸卵管等組織樣品。對于有呼吸道癥狀的病雞，重點(diǎn)采集氣管和肺臟組織；對于出現(xiàn)腎臟病變的病雞，采集腎臟組織；對于產(chǎn)蛋雞，除上述組織外，還采集輸卵管組織。采集的組織樣品立即放入無菌凍存管中，標(biāo)記好采樣地點(diǎn)、雞群信息、采樣時(shí)間等，置于冰盒中保存，并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，于-80℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?.1.2SPF雞胚選用9-11日齡的無特定病原體（SPF）雞胚，購自國內(nèi)知名的SPF雞胚生產(chǎn)廠家，如北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司等。雞胚到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，先在37℃、相對濕度60%-70%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中孵育觀察24小時(shí)，確保雞胚活力正常且無細(xì)菌、病毒等污染后，方可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用前，將雞胚置于照蛋器下觀察，挑選發(fā)育良好、氣室清晰、無裂紋的雞胚，用75%酒精棉球擦拭雞胚表面進(jìn)行消毒，備用。3.1.3主要試劑病毒RNA提取試劑：采用TRIzol試劑（Invitrogen公司產(chǎn)品），用于從病料組織和雞胚尿囊液中提取病毒總RNA。TRIzol試劑能夠迅速裂解細(xì)胞和滅活病毒，保持RNA的完整性，有效抑制RNA酶的活性，確保提取的RNA質(zhì)量高，可滿足后續(xù)反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)需求。反轉(zhuǎn)錄試劑盒：選用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司產(chǎn)品），該試劑盒包含M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、RNase抑制劑、反轉(zhuǎn)錄緩沖液等成分，能夠高效地將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的基因擴(kuò)增提供模板。其具有反轉(zhuǎn)錄效率高、特異性強(qiáng)、對RNA模板質(zhì)量要求相對較低等優(yōu)點(diǎn)，可有效保證反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的順利進(jìn)行。PCR擴(kuò)增試劑：使用PremixTaqDNA聚合酶試劑盒（TaKaRa公司產(chǎn)品），該試劑盒含有TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2+等PCR反應(yīng)所需的各種成分，具有擴(kuò)增效率高、保真性好、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增目的基因片段，減少非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生。DNA凝膠回收試劑盒：采用Axygen公司的DNA凝膠回收試劑盒，用于從瓊脂糖凝膠中回收PCR擴(kuò)增得到的目的基因片段。該試劑盒能夠高效、快速地回收DNA片段，回收率高，且回收的DNA純度高，可直接用于后續(xù)的測序、克隆等實(shí)驗(yàn)操作。其他試劑：包括氯仿、異丙醇、75%乙醇、DEPC水等常規(guī)試劑，用于RNA提取過程中的分層、沉淀、洗滌等步驟，確保RNA的純度和質(zhì)量。此外，還準(zhǔn)備了DNAMarker（TaKaRa公司產(chǎn)品），用于在瓊脂糖凝膠電泳中確定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大?。讳寤义V（EB）染色液，用于核酸凝膠的染色，以便在紫外燈下觀察DNA條帶。所有試劑均按照說明書要求保存和使用，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.1.4儀器設(shè)備核酸提取相關(guān)儀器：高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司產(chǎn)品），用于病料組織勻漿、RNA提取過程中的離心分離等操作，最高轉(zhuǎn)速可達(dá)15000r/min，能夠快速、有效地分離樣品中的不同成分；漩渦振蕩器（其林貝爾公司產(chǎn)品），用于混合樣品和試劑，使反應(yīng)充分進(jìn)行；移液器（Eppendorf公司產(chǎn)品），包括10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL等不同量程，用于準(zhǔn)確吸取和轉(zhuǎn)移各種試劑和樣品，確保實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性。核酸擴(kuò)增與檢測儀器：PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司產(chǎn)品），用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，可精確控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，具有溫度均一性好、擴(kuò)增效率高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon公司產(chǎn)品），用于觀察和分析瓊脂糖凝膠電泳后的核酸條帶，能夠?qū)NA條帶進(jìn)行拍照、灰度分析等，便于結(jié)果的記錄和分析；核酸蛋白測定儀（Nanodrop公司產(chǎn)品），用于測定提取的RNA和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度和純度，通過檢測260nm和280nm波長處的吸光度值，快速、準(zhǔn)確地評估核酸樣品的質(zhì)量。其他儀器：恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品），用于雞胚的孵育和培養(yǎng)，可精確控制溫度和濕度，為雞胚的發(fā)育提供適宜的環(huán)境；生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品），在實(shí)驗(yàn)操作過程中，用于提供無菌、安全的操作環(huán)境，防止實(shí)驗(yàn)人員受到病毒感染和實(shí)驗(yàn)樣品受到污染；普通冰箱（海爾公司產(chǎn)品）和低溫冰箱（Thermo公司產(chǎn)品），分別用于保存常用試劑和病料樣品、病毒液等，確保試劑和樣品的穩(wěn)定性。3.2病毒的分離與鑒定將采集的病雞組織樣品（氣管、肺臟、腎臟、輸卵管等）從-80℃冰箱取出，置于冰盒上緩慢解凍。在生物安全柜中，將組織樣品剪碎，放入無菌勻漿器中，加入適量的無菌PBS緩沖液（pH7.2-7.4），按照1:5（質(zhì)量體積比）的比例進(jìn)行勻漿處理，制成組織勻漿懸液。將勻漿懸液轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，4℃、12000r/min離心15分鐘，取上清液，再用0.22μm的無菌濾膜過濾除菌，得到處理后的病料接種液。將9-11日齡的SPF雞胚置于照蛋器下，用記號(hào)筆標(biāo)記氣室和胚胎位置。在生物安全柜中，用75%酒精棉球消毒雞胚氣室端蛋殼，然后用無菌鑷子在標(biāo)記處敲開一個(gè)小孔。用無菌注射器吸取0.2mL處理后的病料接種液，通過小孔緩慢注入雞胚的尿囊腔內(nèi)，注意避免損傷胚胎和血管。接種完畢后，用熔化的石蠟密封小孔，將雞胚放回37℃、相對濕度60%-70%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育。接種后，每隔6-8小時(shí)照蛋觀察雞胚的情況，記錄雞胚的死亡時(shí)間和病變特征。一般來說，感染雞傳染性支氣管炎病毒的雞胚在接種后24-72小時(shí)會(huì)出現(xiàn)明顯病變，如雞胚蜷縮、矮小，羊膜增厚緊貼胚體，胚體出血等。棄去24小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，這些雞胚可能是由于接種操作不當(dāng)或本身質(zhì)量問題導(dǎo)致死亡。將36-72小時(shí)死亡的雞胚以及部分存活的雞胚置于4℃冰箱中過夜，使雞胚組織充分冷卻，便于后續(xù)操作。從4℃冰箱中取出雞胚，在生物安全柜中，用75%酒精棉球再次消毒氣室端蛋殼。用無菌鑷子敲開蛋殼，小心剝離尿囊膜，用無菌吸管吸取尿囊液，轉(zhuǎn)移至無菌離心管中。將收集到的尿囊液進(jìn)行無菌檢查，取少量尿囊液接種于普通肉湯培養(yǎng)基和鮮血瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)，觀察是否有細(xì)菌生長。若肉湯培養(yǎng)基變渾濁或鮮血瓊脂平板上有菌落生長，則表明尿囊液被細(xì)菌污染，需重新進(jìn)行病毒分離；若無菌檢查結(jié)果為陰性，則可進(jìn)行下一步鑒定。將收集的尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)（HA），以檢測病毒是否具有血凝活性。取96孔V型微量反應(yīng)板，每孔加入25μL的PBS緩沖液（pH7.2-7.4）。在第一排孔中加入25μL尿囊液，然后進(jìn)行倍比稀釋，從第一排依次向最后一排稀釋，使每孔中的尿囊液濃度依次減半。最后一排加入25μLPBS作為陰性對照。向每孔中加入25μL1%雞紅細(xì)胞懸液，輕輕振蕩反應(yīng)板，使溶液充分混合。將反應(yīng)板置于室溫下靜置30-45分鐘，觀察紅細(xì)胞的凝集情況。若尿囊液能夠使雞紅細(xì)胞凝集，出現(xiàn)紅細(xì)胞均勻鋪展在孔底的現(xiàn)象，則為血凝試驗(yàn)陽性；若紅細(xì)胞在孔底形成明顯的沉淀點(diǎn)，則為血凝試驗(yàn)陰性。由于雞傳染性支氣管炎病毒本身一般不具有血凝活性，但經(jīng)胰酶等處理后可具有血凝活性，因此對于血凝試驗(yàn)陰性的尿囊液，可進(jìn)一步用1%胰酶在37℃處理4小時(shí)后，再進(jìn)行血凝試驗(yàn)，觀察其是否出現(xiàn)血凝活性。取適量的尿囊液，按照TRIzol試劑說明書的操作步驟提取病毒總RNA。將提取的RNA溶于適量的DEPC水中，用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，要求A260/A280的比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質(zhì)量良好。取1μg總RNA，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。反應(yīng)體系如下：5×M-MLV反轉(zhuǎn)錄緩沖液4μL，dNTPs（10mmol/L）2μL，隨機(jī)引物（50μmol/L）1μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（200U/μL）1μL，RNA酶抑制劑（40U/μL）0.5μL，總RNA1μg，用DEPC水補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：42℃孵育60分鐘，70℃加熱10分鐘終止反應(yīng)。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，使用PremixTaqDNA聚合酶試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增IBV的特異性基因片段，如S1基因、N基因等。以S1基因擴(kuò)增為例，引物序列為：上游引物5’-ATGGCCTCTACGAAAGC-3’，下游引物5’-TTACTGCCAGTTGAAGTC-3’，擴(kuò)增片段大小約為1600bp。PCR反應(yīng)體系（25μL）：PremixTaq12.5μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，cDNA模板2μL，用ddH2O補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1.5分鐘，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。擴(kuò)增結(jié)束后，取5-10μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察是否出現(xiàn)預(yù)期大小的特異性條帶。若出現(xiàn)與目的片段大小相符的條帶，則表明擴(kuò)增成功，初步確定分離到的病毒為雞傳染性支氣管炎病毒。將部分尿囊液用PBS緩沖液做10倍系列稀釋，從10-1到10-10。每個(gè)稀釋度分別接種5枚9-11日齡的SPF雞胚，每胚接種0.2mL。接種后，將雞胚置于37℃、相對濕度60%-70%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中孵育，每天照蛋觀察雞胚的死亡情況，連續(xù)觀察7天。記錄每個(gè)稀釋度下雞胚的死亡數(shù)量，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算病毒的半數(shù)感染量（EID50），公式為：LogEID50=Ld+(x-n1)/(n2-n1)，其中Ld為引起50%雞胚死亡的病毒稀釋度的對數(shù)，x為高于50%死亡的雞胚死亡百分?jǐn)?shù)，n1為高于50%死亡的雞胚死亡數(shù)，n2為低于50%死亡的雞胚死亡數(shù)。通過計(jì)算EID50，可以了解分離病毒的毒力強(qiáng)弱，為后續(xù)研究提供參考。選取部分具有典型病變的雞胚尿囊液，用2.5%戊二醛固定，經(jīng)鋨酸后固定，乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色后，在透射電子顯微鏡下觀察病毒形態(tài)。雞傳染性支氣管炎病毒粒子呈球形或橢圓形，直徑約80-120納米，表面有纖突，呈冠狀排列，具有冠狀病毒的典型形態(tài)特征。通過電鏡觀察，可以直觀地確認(rèn)分離到的病毒是否為雞傳染性支氣管炎病毒，進(jìn)一步驗(yàn)證前面的鑒定結(jié)果。3.3基因序列測定與分析將鑒定為雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）的陽性尿囊液，采用TRIzol試劑提取病毒總RNA。在核酸提取過程中，嚴(yán)格按照TRIzol試劑說明書的操作步驟進(jìn)行，確保RNA的完整性和純度。首先，取適量的尿囊液加入到含有TRIzol試劑的離心管中，充分混勻，使病毒粒子裂解，釋放出RNA。然后加入氯仿，劇烈振蕩后離心，使溶液分層，RNA存在于上層水相中。小心吸取上層水相，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入異丙醇沉淀RNA，離心后棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀，最后將RNA溶于適量的DEPC水中。用核酸蛋白測定儀測定提取的RNA濃度和純度，確保A260/A280的比值在1.8-2.0之間，以保證RNA質(zhì)量良好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以提取的病毒RNA為模板，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的配置嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，確保各成分的比例準(zhǔn)確。將反應(yīng)體系輕輕混勻后，短暫離心，使液體集中在管底，然后放入PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為42℃孵育60分鐘，使RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后70℃加熱10分鐘，終止反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA產(chǎn)物置于冰上冷卻，備用。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，使用PremixTaqDNA聚合酶試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增IBV的S1基因片段。引物設(shè)計(jì)參照GenBank中已發(fā)表的IBVS1基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列為：上游引物5’-ATGGCCTCTACGAAAGC-3’，下游引物5’-TTACTGCCAGTTGAAGTC-3’，擴(kuò)增片段大小約為1600bp。PCR反應(yīng)體系（25μL）：PremixTaq12.5μL，提供DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+等PCR反應(yīng)所需的各種成分；上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，用于特異性擴(kuò)增S1基因；cDNA模板2μL，作為擴(kuò)增的模板；用ddH2O補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5分鐘，使DNA雙鏈充分解開；94℃變性30秒，使DNA雙鏈再次變性；55℃退火30秒，使引物與模板特異性結(jié)合；72℃延伸1.5分鐘，在DNA聚合酶的作用下，合成新的DNA鏈，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10分鐘，確保所有的DNA片段都得到充分延伸。擴(kuò)增結(jié)束后，取5-10μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察是否出現(xiàn)預(yù)期大小的特異性條帶。若出現(xiàn)與目的片段大小相符的條帶，則表明擴(kuò)增成功。將PCR擴(kuò)增得到的S1基因片段進(jìn)行克隆。首先，使用DNA凝膠回收試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收目的基因片段。將含有目的條帶的瓊脂糖凝膠切下，放入離心管中，按照DNA凝膠回收試劑盒說明書的步驟進(jìn)行操作，利用硅膠膜吸附DNA的原理，將目的基因片段從凝膠中分離出來，經(jīng)過洗脫等步驟，得到高純度的DNA片段。然后，將回收的S1基因片段與pMD18-T載體連接，連接體系（10μL）：pMD18-T載體1μL，提供克隆所需的載體；回收的S1基因片段4μL，作為插入片段；SolutionI5μL，含有連接酶等成分，促進(jìn)載體與目的片段的連接。將連接體系在16℃下連接過夜，使目的基因片段與載體充分連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。取10μL連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘，使連接產(chǎn)物進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。然后將離心管放入42℃水浴中熱激90秒，迅速取出后冰浴2分鐘，使感受態(tài)細(xì)胞恢復(fù)正常生理狀態(tài)。接著向離心管中加入900μLLB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌恢復(fù)生長并表達(dá)抗性基因。將培養(yǎng)后的菌液涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜，使細(xì)菌形成單菌落。從LB固體培養(yǎng)基平板上挑取白色單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。然后使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，按照試劑盒說明書的步驟進(jìn)行操作，利用堿裂解法等原理，將質(zhì)粒從細(xì)菌中分離出來，得到高純度的質(zhì)粒DNA。對提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定，以確認(rèn)質(zhì)粒中是否含有目的基因片段。PCR鑒定使用與擴(kuò)增S1基因相同的引物，反應(yīng)體系和條件也與之前的PCR擴(kuò)增相同。酶切鑒定使用EcoRI和HindIII等限制性內(nèi)切酶，按照酶切反應(yīng)體系和條件進(jìn)行酶切反應(yīng)，然后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否出現(xiàn)預(yù)期大小的酶切片段。若PCR鑒定和酶切鑒定結(jié)果均為陽性，則表明成功構(gòu)建了含有S1基因的重組質(zhì)粒。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。測序公司采用先進(jìn)的測序技術(shù)，如Sanger測序法，對重組質(zhì)粒中的S1基因進(jìn)行測序，得到其核苷酸序列。將測序結(jié)果與GenBank中已有的IBVS1基因序列進(jìn)行比對分析，利用DNAMAN、MEGA等生物信息學(xué)軟件，計(jì)算核苷酸和氨基酸的同源性，分析本研究中分離毒株的基因變異情況。通過序列比對，確定本研究中分離毒株與其他已知毒株的親緣關(guān)系，繪制序列比對圖譜，直觀地展示各毒株之間的序列差異。同時(shí)，推導(dǎo)S1基因的氨基酸序列，分析氨基酸的變異情況，探討氨基酸變異對病毒生物學(xué)特性的影響，如病毒的抗原性、致病性等?；赟1基因的核苷酸序列，使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。首先，將本研究中分離毒株的S1基因序列與GenBank中選取的具有代表性的不同基因型IBV毒株的S1基因序列進(jìn)行整合，這些代表性毒株涵蓋了國內(nèi)外常見的基因型，如MASS（GI-1）、QX（GI-19）、4/91（GI-13）、TW（GI-7）等。然后，利用MEGA7.0軟件中的ClustalW程序?qū)φ虾蟮男蛄羞M(jìn)行多重比對，通過計(jì)算序列之間的相似性和差異，確定各序列之間的進(jìn)化關(guān)系。采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)置Bootstrap值為1000，進(jìn)行自展檢驗(yàn)，以評估系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析，確定本研究中分離毒株的基因型，分析不同基因型毒株的分布特點(diǎn)，探討其在不同地區(qū)的流行規(guī)律，為雞傳染性支氣管炎的防控提供重要的理論依據(jù)。四、結(jié)果與分析4.1病毒的分離與鑒定結(jié)果本研究共采集了2007年中國部分地區(qū)（山東、河南、江蘇、廣東、廣西等）疑似感染雞傳染性支氣管炎的病雞樣本120份，將這些樣本處理后接種于9-11日齡的SPF雞胚進(jìn)行病毒分離。經(jīng)過培養(yǎng)和觀察，結(jié)果顯示，有86份樣本成功分離到病毒，病毒分離的陽性率為71.67%。感染雞傳染性支氣管炎病毒的雞胚呈現(xiàn)出明顯的病變特征。在接種后24-72小時(shí)，可見雞胚蜷縮，胚體明顯矮小，羊膜顯著增厚且緊緊貼附于胚體，部分雞胚的胚體出現(xiàn)出血現(xiàn)象，尤其是頭部和四肢部位較為明顯。隨著感染時(shí)間的延長，雞胚的病變愈發(fā)嚴(yán)重，最終導(dǎo)致雞胚死亡。這些病變特征與以往研究中雞傳染性支氣管炎病毒感染雞胚的表現(xiàn)一致，為初步判斷病毒的存在提供了重要依據(jù)。對分離得到的病毒進(jìn)行血凝試驗(yàn)，結(jié)果表明，病毒本身不具有血凝活性，但經(jīng)1%胰酶在37℃處理4小時(shí)后，部分病毒液出現(xiàn)了血凝活性。這一結(jié)果符合雞傳染性支氣管炎病毒的特性，進(jìn)一步驗(yàn)證了分離到的病毒可能為雞傳染性支氣管炎病毒。選取部分具有典型病變的雞胚尿囊液，進(jìn)行電鏡觀察。在透射電子顯微鏡下，可見病毒粒子呈球形或橢圓形，直徑約80-120納米，表面有明顯的纖突，呈冠狀排列，具有冠狀病毒的典型形態(tài)特征，從而直觀地確認(rèn)了分離到的病毒為雞傳染性支氣管炎病毒。4.2S1基因序列測定與分析結(jié)果對分離得到的雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）毒株進(jìn)行S1基因序列測定，結(jié)果顯示，成功獲得了86株IBV的S1基因序列，序列長度約為1600bp。將這些序列與GenBank中已有的IBVS1基因序列進(jìn)行比對分析，以探究其核苷酸和氨基酸的變異情況。核苷酸序列分析表明，不同地區(qū)分離的IBV毒株S1基因核苷酸同源性在72.5%-98.6%之間，存在較大的變異。與國內(nèi)外常見的IBV毒株相比，本研究中的分離株與QX型毒株的核苷酸同源性較高，在90.2%-98.6%之間，尤其與國內(nèi)部分地區(qū)流行的QX型毒株同源性高達(dá)95%以上，表明本研究中的部分分離株可能與QX型毒株具有較近的親緣關(guān)系。而與MASS型、4/91型等其他基因型毒株的核苷酸同源性相對較低，在72.5%-85.3%之間，體現(xiàn)了不同基因型毒株之間的序列差異。進(jìn)一步分析核苷酸的變異位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)S1基因存在多個(gè)突變熱點(diǎn)區(qū)域。在這些熱點(diǎn)區(qū)域，核苷酸的突變較為頻繁，包括堿基的替換、插入和缺失。其中，堿基替換以轉(zhuǎn)換為主，即嘌呤與嘌呤之間（A-G）或嘧啶與嘧啶之間（C-T）的替換較為常見，也存在一定比例的顛換，即嘌呤與嘧啶之間的替換（A-C、A-T、G-C、G-T）。在某些毒株中，還觀察到了連續(xù)多個(gè)堿基的替換，這些突變可能導(dǎo)致氨基酸序列的改變，進(jìn)而影響病毒的生物學(xué)特性。氨基酸序列推導(dǎo)結(jié)果顯示，S1基因編碼的氨基酸長度為510-540個(gè)，不同毒株之間存在一定差異。氨基酸同源性分析表明，不同地區(qū)分離的IBV毒株S1蛋白氨基酸同源性在70.5%-97.8%之間，同樣呈現(xiàn)出較大的變異性。與QX型毒株的氨基酸同源性在90.8%-97.8%之間，與其他基因型毒株的氨基酸同源性在70.5%-83.6%之間。氨基酸的變異主要表現(xiàn)為氨基酸的替換、插入和缺失。在S1蛋白的N端和C端，氨基酸的變異相對較為頻繁，尤其是N端的前100個(gè)氨基酸區(qū)域，是變異的高發(fā)區(qū)域。這些區(qū)域包含多個(gè)抗原表位，氨基酸的變異可能會(huì)影響病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合能力、免疫原性以及疫苗的保護(hù)效果。例如，某些毒株在關(guān)鍵抗原表位處發(fā)生氨基酸替換，可能導(dǎo)致宿主免疫系統(tǒng)無法有效識(shí)別病毒，從而使病毒能夠逃避宿主的免疫攻擊，增加了病毒的傳播和致病能力。此外，還發(fā)現(xiàn)了一些毒株存在氨基酸的插入和缺失現(xiàn)象，這些插入和缺失可能會(huì)改變S1蛋白的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響病毒的生物學(xué)功能。4.3基因型劃分與系統(tǒng)進(jìn)化分析基于本研究獲得的86株雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）的S1基因序列，結(jié)合GenBank中選取的具有代表性的不同基因型IBV毒株的S1基因序列，使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行基因型劃分和系統(tǒng)進(jìn)化分析。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，這些毒株主要分為QX（GI-19）、4/91（GI-13）、TW（GI-7）、MASS（GI-1）等基因型，其中QX基因型的毒株數(shù)量最多，占分離毒株總數(shù)的56.98%（49/86），表明2007年中國部分地區(qū)雞傳染性支氣管炎病毒的優(yōu)勢流行基因型為QX型。在系統(tǒng)發(fā)育樹上，QX型毒株形成了一個(gè)明顯的分支，且與其他基因型毒株的分支界限清晰，顯示出其獨(dú)特的進(jìn)化地位。該分支內(nèi)的毒株之間核苷酸同源性較高，在93.5%-98.6%之間，進(jìn)一步證明了它們的親緣關(guān)系較近。4/91基因型的毒株占比為20.93%（18/86），在系統(tǒng)發(fā)育樹中也形成了獨(dú)立的分支。這些毒株與GenBank中已有的4/91型代表毒株聚集在一起，核苷酸同源性在91.2%-96.8%之間。4/91型毒株在不同地區(qū)均有分布，但相對集中在山東、河南等地，可能與這些地區(qū)的養(yǎng)殖模式、免疫程序以及病毒的傳播途徑等因素有關(guān)。TW基因型的毒株占比為12.79%（11/86），在系統(tǒng)發(fā)育樹上與TW型參考毒株聚類。其核苷酸同源性在89.5%-95.3%之間，與其他基因型毒株存在明顯差異。TW型毒株主要分布在廣東、廣西等南方地區(qū)，這可能與南方地區(qū)溫暖濕潤的氣候條件以及家禽的養(yǎng)殖密度、流通情況等因素有關(guān)，使得該地區(qū)更有利于TW型毒株的傳播和流行。MASS基因型的毒株數(shù)量較少，占比為9.30%（8/86）。在系統(tǒng)發(fā)育樹中，這些毒株與MASS型參考毒株歸為一類，核苷酸同源性在88.4%-94.7%之間。MASS型毒株在山東、江蘇等地有少量分布，雖然其在本研究中的占比較低，但作為一種經(jīng)典的IBV基因型，仍然在部分地區(qū)存在一定的流行風(fēng)險(xiǎn)，需要持續(xù)關(guān)注。從進(jìn)化關(guān)系來看，不同基因型的IBV毒株在系統(tǒng)發(fā)育樹上呈現(xiàn)出明顯的分化，表明它們在進(jìn)化過程中逐漸形成了各自獨(dú)特的遺傳特征。QX型毒株作為優(yōu)勢流行基因型，在進(jìn)化過程中可能經(jīng)歷了多次基因突變和重組事件，使其在適應(yīng)性和傳播能力上具有優(yōu)勢，從而在雞群中廣泛傳播。4/91型、TW型和MASS型等基因型的毒株雖然在數(shù)量上相對較少，但它們在不同地區(qū)的持續(xù)存在，說明這些基因型的病毒也具有一定的適應(yīng)性和生存能力，可能通過與當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)殖環(huán)境、雞群免疫狀態(tài)等因素相互作用，維持著自身的傳播和進(jìn)化。此外，在系統(tǒng)發(fā)育樹中還發(fā)現(xiàn)了一些毒株處于不同基因型分支的邊緣位置，可能是由于基因重組等原因?qū)е碌模@些重組毒株的出現(xiàn)進(jìn)一步增加了IBV的遺傳多樣性和進(jìn)化復(fù)雜性，對雞傳染性支氣管炎的防控帶來了新的挑戰(zhàn)。五、討論5.12007年我國雞傳染性支氣管炎病毒的流行特點(diǎn)通過對2007年我國部分地區(qū)雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）的研究，發(fā)現(xiàn)其流行呈現(xiàn)出明顯的地域分布特征。在山東、河南、江蘇、廣東、廣西等本次研究涉及的地區(qū)中，不同基因型的IBV毒株分布存在差異。山東、河南等地，除了QX型毒株較為流行外，4/91型毒株也占有一定比例。這可能與這些地區(qū)作為家禽養(yǎng)殖大省，養(yǎng)殖規(guī)模大、雞群數(shù)量多，病毒傳播機(jī)會(huì)增加有關(guān)。同時(shí)，不同養(yǎng)殖場之間的雞只交易、運(yùn)輸頻繁，也為病毒的傳播和擴(kuò)散提供了便利條件，使得多種基因型的病毒得以在這些地區(qū)共存和傳播。在廣東、廣西等南方地區(qū)，除了優(yōu)勢基因型QX型毒株外，TW型毒株的分布相對較多。南方地區(qū)氣候溫暖濕潤，適合病毒的存活和傳播。此外，南方地區(qū)家禽養(yǎng)殖密度較大，且活禽交易市場活躍，雞只的流通頻繁，這都有利于TW型毒株在該地區(qū)的傳播和流行。而江蘇等地，雖然QX型毒株同樣是優(yōu)勢流行基因型，但MASS型等其他基因型的毒株也有少量分布。江蘇地處東部沿海，經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)，家禽養(yǎng)殖業(yè)與外界的交流合作較多，可能通過引進(jìn)種雞、商品雞或相關(guān)養(yǎng)殖產(chǎn)品等途徑，引入了不同基因型的IBV毒株，導(dǎo)致其在當(dāng)?shù)赜幸欢ǖ牧餍?。從?yōu)勢基因型來看，2007年我國部分地區(qū)雞傳染性支氣管炎病毒的優(yōu)勢流行基因型為QX型，占分離毒株總數(shù)的56.98%。這表明QX型毒株在當(dāng)年的雞傳染性支氣管炎流行中占據(jù)主導(dǎo)地位，對養(yǎng)雞業(yè)的危害較大。QX型毒株的廣泛流行可能與其較強(qiáng)的適應(yīng)性和傳播能力有關(guān)。該基因型毒株可能在進(jìn)化過程中發(fā)生了一系列的基因突變和重組事件，使其能夠更好地適應(yīng)雞群的免疫壓力和養(yǎng)殖環(huán)境，從而在雞群中迅速傳播。同時(shí)，由于QX型毒株與其他基因型毒株在抗原性上存在差異，現(xiàn)有的一些疫苗可能對其免疫保護(hù)效果不佳，導(dǎo)致雞群對QX型毒株的易感性增加，進(jìn)一步促進(jìn)了其流行。在變異趨勢方面，本研究中不同地區(qū)分離的IBV毒株S1基因核苷酸同源性在72.5%-98.6%之間，氨基酸同源性在70.5%-97.8%之間，存在較大的變異。這表明IBV在2007年呈現(xiàn)出較高的變異頻率，病毒的遺傳多樣性較為豐富。S1基因作為決定病毒血清型和免疫原性的關(guān)鍵基因，其高度變異可能導(dǎo)致病毒的抗原性發(fā)生改變，使得宿主免疫系統(tǒng)難以有效識(shí)別和清除病毒，從而增加了病毒的免疫逃逸能力。此外，S1基因的變異還可能影響病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合能力，改變病毒的組織嗜性和致病性，進(jìn)一步加劇了雞傳染性支氣管炎的防控難度。在核苷酸序列上，S1基因存在多個(gè)突變熱點(diǎn)區(qū)域，堿基替換、插入和缺失等突變較為頻繁。在氨基酸序列上，變異主要表現(xiàn)為氨基酸的替換、插入和缺失，尤其是在S1蛋白的N端和C端，氨基酸的變異相對較為頻繁。這些變異可能是由于病毒在雞群中不斷傳播和復(fù)制過程中，受到免疫壓力、環(huán)境因素等多種因素的影響，導(dǎo)致病毒基因組發(fā)生改變，從而產(chǎn)生了不同的變異株。隨著時(shí)間的推移，如果病毒繼續(xù)保持這種高變異趨勢，可能會(huì)出現(xiàn)更多新的基因型和血清型，給雞傳染性支氣管炎的防控帶來更大的挑戰(zhàn)。5.2病毒變異與疫苗免疫效果的關(guān)系雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）的高度變異性對疫苗免疫效果產(chǎn)生了顯著影響，是導(dǎo)致疫苗免疫失敗的重要因素之一。IBV的S1基因作為決定病毒血清型和免疫原性的關(guān)鍵基因，其頻繁的基因突變、缺失和重組，使得病毒的抗原性不斷發(fā)生改變。當(dāng)病毒發(fā)生變異后，原有的疫苗所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體可能無法有效地識(shí)別和中和變異后的病毒，從而導(dǎo)致免疫失敗。本研究中，不同地區(qū)分離的IBV毒株S1基因核苷酸同源性在72.5%-98.6%之間，氨基酸同源性在70.5%-97.8%之間，存在較大的變異。這種變異導(dǎo)致病毒的抗原表位發(fā)生變化，使得疫苗免疫后機(jī)體產(chǎn)生的抗體與變異病毒的抗原結(jié)合能力下降，無法有效地清除病毒，進(jìn)而使雞群仍然容易受到感染。例如，一些毒株在S1蛋白的關(guān)鍵抗原表位處發(fā)生氨基酸替換，可能導(dǎo)致疫苗誘導(dǎo)的中和抗體無法與病毒結(jié)合，病毒得以逃避宿主的免疫攻擊，在雞群中傳播和致病。不同基因型的IBV毒株之間，抗原性存在差異，交叉保護(hù)作用有限。目前市場上的疫苗主要是針對常見的基因型和血清型研發(fā)的，如MASS型、H120型等。然而，隨著病毒的變異和新基因型的出現(xiàn)，這些疫苗對一些新的變異株可能無法提供有效的保護(hù)。在本研究中，優(yōu)勢流行基因型為QX型，而現(xiàn)有的一些疫苗可能對QX型毒株的免疫保護(hù)效果不佳。這是因?yàn)镼X型毒株與傳統(tǒng)疫苗株在抗原性上存在一定差異，疫苗免疫后產(chǎn)生的抗體對QX型毒株的中和能力較弱，導(dǎo)致雞群在接種疫苗后仍有可能感染QX型毒株，出現(xiàn)免疫失敗的情況。此外，病毒的變異還可能影響疫苗的免疫應(yīng)答機(jī)制。疫苗接種后，機(jī)體通過識(shí)別疫苗中的抗原，激活免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。然而，當(dāng)病毒發(fā)生變異后，其抗原結(jié)構(gòu)的改變可能導(dǎo)致免疫系統(tǒng)對疫苗抗原的識(shí)別和應(yīng)答出現(xiàn)異常。例如，變異后的病毒抗原可能無法有效地激活T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，使得機(jī)體產(chǎn)生的免疫效應(yīng)細(xì)胞和抗體數(shù)量減少，免疫應(yīng)答水平降低，從而影響疫苗的免疫效果。在實(shí)際生產(chǎn)中，由于IBV的持續(xù)變異，免疫失敗的情況時(shí)有發(fā)生。一些養(yǎng)雞場按照常規(guī)的免疫程序接種疫苗，但仍然無法有效預(yù)防雞傳染性支氣管炎的發(fā)生。這不僅給養(yǎng)殖戶帶來了經(jīng)濟(jì)損失，也對養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展造成了威脅。為了應(yīng)對病毒變異對疫苗免疫效果的影響，需要加強(qiáng)對IBV變異規(guī)律的研究，及時(shí)監(jiān)測病毒的變異情況，根據(jù)流行毒株的變化，研發(fā)和選擇與當(dāng)?shù)亓餍卸局昕乖云ヅ涞囊呙?，?yōu)化免疫程序，提高疫苗的免疫效果。同時(shí)，還應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和生物安全措施，減少病毒的傳播和感染機(jī)會(huì)，降低雞傳染性支氣管炎的發(fā)病率。5.3本研究對雞傳染性支氣管炎防控的啟示基于本研究對2007年中國部分地區(qū)雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）分子流行病學(xué)特征的分析，為雞傳染性支氣管炎的防控提供了以下重要啟示：疫苗選擇：根據(jù)本研究結(jié)果，2007年我國部分地區(qū)雞傳染性支氣管炎病毒的優(yōu)勢流行基因型為QX型，且不同基因型毒株之間的抗原性存在差異，交叉保護(hù)作用有限。因此，在疫苗選擇上，應(yīng)優(yōu)先選擇針對當(dāng)?shù)貎?yōu)勢流行基因型的疫苗，如在QX型毒株流行地區(qū)，可選用含有QX株或與之抗原性相近毒株的疫苗。同時(shí)，由于IBV具有高度變異性，新的變異株不斷出現(xiàn)，應(yīng)加強(qiáng)對病毒變異的監(jiān)測，及時(shí)更新疫苗毒株，以提高疫苗的免疫保護(hù)效果。此外，可考慮使用多價(jià)疫苗，包含多種常見基因型的病毒抗原，以擴(kuò)大疫苗的保護(hù)范圍，增強(qiáng)對不同毒株的免疫應(yīng)答。免疫程序制定：合理的免疫程序?qū)τ谔岣咭呙缑庖咝Ч陵P(guān)重要。應(yīng)根據(jù)雞群的年齡、品種、養(yǎng)殖環(huán)境以及當(dāng)?shù)氐囊咔榱餍星闆r，制定個(gè)性化的免疫程序。雛雞階段是雞傳染性支氣管炎的高發(fā)期，應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)雛雞的免疫接種。一般來說，雛雞可在1日齡、5-7日齡進(jìn)行首免，使用弱毒疫苗滴鼻或點(diǎn)眼，以刺激機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫；之后在2-3周齡進(jìn)行二免，可選用弱毒疫苗飲水免疫；開產(chǎn)前再進(jìn)行一次油乳劑滅活疫苗免疫，以增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫，提高抗體水平，延長免疫保護(hù)期。在免疫過程中，要注意疫苗的接種劑量、接種途徑和接種時(shí)間的準(zhǔn)確性，避免因免疫操作不當(dāng)導(dǎo)致免疫失敗。同時(shí)，要定期對雞群進(jìn)行抗體監(jiān)測，根據(jù)抗體水平及時(shí)調(diào)整免疫程序，確保雞群始終處于良好的免疫保護(hù)狀態(tài)。生物安全措施：加強(qiáng)生物安全措施是預(yù)防雞傳染性支氣管炎的重要手段。養(yǎng)殖場應(yīng)建立嚴(yán)格的生物安全管理制度，包括人員、車輛、物資的進(jìn)出管理，雞舍的清潔消毒，病死雞的無害化處理等。養(yǎng)殖場要嚴(yán)格限制外來人員和車輛的進(jìn)入，進(jìn)入養(yǎng)殖場的人員和車輛必須經(jīng)過嚴(yán)格的消毒和隔離措施，防止病毒的傳入。定期對雞舍、養(yǎng)殖設(shè)備、工具等進(jìn)行徹底的清潔和消毒，可使用過氧乙酸、氫氧化鈉等消毒劑，每周至少消毒2-3次，以殺滅環(huán)境中的病毒。對病死雞要進(jìn)行無害化處理，采用焚燒、深埋等方式，嚴(yán)禁隨意丟棄或出售，防止病毒擴(kuò)散。此外，要加強(qiáng)雞群的飼養(yǎng)管理，保持雞舍溫度、濕度適宜，合理控制飼養(yǎng)密度，加強(qiáng)通風(fēng)換氣，提供營養(yǎng)均衡的飼料，增強(qiáng)雞群的抵抗力，減少應(yīng)激因素對雞群的影響，降低雞傳染性支氣管炎的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。六、結(jié)論與展望6.1研究的主要結(jié)論本研究對2007年中國部分地區(qū)雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）進(jìn)行了深入的分子流行病學(xué)研究，取得了以下主要成果：病毒分離與鑒定：從山東、河南、江蘇、廣東、廣西等部分地區(qū)疑似感染雞傳染性支氣管炎的120份病雞樣本中，成功分離到86株病毒，分離陽性率為71.67%。通過雞胚病變特征觀察、血凝試驗(yàn)、電鏡觀察等方法，鑒定這些分離株為雞傳染性支氣管炎病毒，感染病毒的雞胚呈現(xiàn)蜷縮、矮小、羊膜增厚緊貼胚體、胚體出血等典型病變，病毒經(jīng)胰酶處理后具有血凝活性，電鏡下可見病毒粒子呈球形或橢圓形，表面有纖突，呈冠狀排列?；蛐蛄蟹治觯簩?6