JHS對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制探究：基于多維度的深入剖析一、引言1.1研究背景與意義腦缺血再灌注損傷（CerebralIschemia-ReperfusionInjury，CIRI）是一種在多種腦血管疾病中極為常見且危害嚴(yán)重的病理生理過程，如腦血栓形成、腦栓塞以及心臟驟停后的復(fù)蘇等情況。當(dāng)腦缺血后血液重新恢復(fù)供應(yīng)時(shí)，本應(yīng)得到改善的缺血區(qū)域腦組織，卻意外地出現(xiàn)了更為嚴(yán)重的損傷，這便是腦缺血再灌注損傷的典型表現(xiàn)。這種損傷的發(fā)生機(jī)制極為復(fù)雜，涉及多個(gè)生物學(xué)過程和分子機(jī)制，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。缺血性腦血管病是腦血管疾病中的重要類型，具有高發(fā)病率、高患病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)，給患者及其家庭乃至整個(gè)社會(huì)都帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)城鎮(zhèn)缺血性腦血管病的發(fā)病率高達(dá)185.6±78.3/10萬，農(nóng)村地區(qū)為156.2±21.5/10萬；患病率方面，城鎮(zhèn)為850.8±250.6/10萬，農(nóng)村為390.7±50.8/10萬。如此高的發(fā)病數(shù)據(jù)，使得缺血性腦血管病成為了威脅人們健康的重要因素之一。目前，針對(duì)缺血性腦血管病的治療方法眾多，包括溶栓治療、抗血小板治療、抗凝治療、降纖治療以及腦保護(hù)劑的應(yīng)用等。溶栓治療雖然能夠在一定程度上恢復(fù)病灶區(qū)血液供應(yīng)，但存在嚴(yán)格的時(shí)間窗限制，超過時(shí)間窗進(jìn)行溶栓，不僅效果不佳，還可能增加出血等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。抗血小板治療、抗凝治療等也各自存在局限性，且這些治療方法對(duì)于腦缺血再灌注損傷的防治效果仍不盡人意。臨床上迫切需要尋找更為有效的治療手段和藥物，以提高缺血性腦血管病的治療效果，改善患者的預(yù)后。JHS作為一種潛在的治療藥物，其對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究具有重要的意義。深入探究JHS在腦缺血再灌注損傷中的作用，有助于揭示其潛在的治療機(jī)制，為開發(fā)新型的治療藥物和方法提供理論依據(jù)。通過研究JHS對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，可以為臨床治療缺血性腦血管病提供新的思路和策略，有望改善患者的神經(jīng)功能，減少腦梗死體積，降低致殘率和死亡率，提高患者的生活質(zhì)量，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)效益。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在腦缺血再灌注損傷的研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了豐碩的成果，為理解這一復(fù)雜病理過程提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。國(guó)外在該領(lǐng)域的研究起步較早，運(yùn)用先進(jìn)的神經(jīng)影像學(xué)技術(shù)，如磁共振成像（MRI）、彌散張量成像（DTI）等，能夠精準(zhǔn)地觀察腦缺血再灌注損傷后腦組織的結(jié)構(gòu)和功能變化。借助基因編輯技術(shù)，深入探究特定基因在腦缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與損傷和修復(fù)相關(guān)的關(guān)鍵基因，為治療靶點(diǎn)的篩選提供了方向。在治療方法研究方面，積極探索新型藥物和細(xì)胞治療技術(shù)，如神經(jīng)干細(xì)胞移植、基因治療等，部分研究已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。國(guó)內(nèi)學(xué)者在腦缺血再灌注損傷研究中也發(fā)揮了重要作用，在基礎(chǔ)研究方面，從中醫(yī)理論出發(fā)，研究中藥復(fù)方和針灸等傳統(tǒng)療法對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。有研究表明，一些中藥復(fù)方能夠通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等信號(hào)通路，減輕腦缺血再灌注損傷。在臨床研究方面，結(jié)合國(guó)內(nèi)豐富的病例資源，開展多中心、大樣本的臨床試驗(yàn)，驗(yàn)證了多種治療方法的有效性和安全性，為臨床治療方案的制定提供了有力的證據(jù)。還加強(qiáng)了與國(guó)外科研團(tuán)隊(duì)的合作與交流，共同推動(dòng)腦缺血再灌注損傷研究的發(fā)展。關(guān)于JHS對(duì)腦缺血再灌注損傷的研究，目前尚處于探索階段。國(guó)外相關(guān)研究較少，僅有的少數(shù)研究初步探討了JHS在細(xì)胞模型中的抗氧化作用，但對(duì)于其在整體動(dòng)物模型中的作用及具體機(jī)制尚未深入研究。國(guó)內(nèi)研究則主要集中在觀察JHS對(duì)腦缺血再灌注損傷動(dòng)物的神經(jīng)功能改善和腦梗死體積減小等方面的影響，對(duì)于其作用的分子機(jī)制研究還不夠系統(tǒng)和全面。雖然已有研究表明JHS可能通過調(diào)節(jié)某些信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)作用，但具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程以及相關(guān)的上下游分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步明確。當(dāng)前對(duì)于腦缺血再灌注損傷的研究雖然取得了顯著進(jìn)展，但在治療手段和藥物研發(fā)方面仍存在不足?，F(xiàn)有治療方法的療效有限，無法滿足臨床需求，迫切需要尋找新的治療靶點(diǎn)和藥物。而JHS作為一種潛在的治療藥物，其研究還不夠深入，尤其是在作用機(jī)制方面存在諸多空白。本研究旨在通過深入探究JHS對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，填補(bǔ)這一領(lǐng)域的研究空白，為開發(fā)新型的治療藥物和方法提供理論依據(jù)，具有重要的研究?jī)r(jià)值和臨床意義。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探究JHS對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其潛在機(jī)制，為開發(fā)治療缺血性腦血管病的新型藥物提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。具體而言，通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和多維度的檢測(cè)指標(biāo)，明確JHS是否能夠減輕腦缺血再灌注損傷所導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺損、縮小腦梗死體積、降低腦含水量等，進(jìn)而改善腦組織的病理損傷；從分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)層面，揭示JHS發(fā)揮保護(hù)作用的具體信號(hào)通路和作用靶點(diǎn)，闡明其內(nèi)在的作用機(jī)制。在研究方法上，將綜合運(yùn)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，選用健康成年大鼠，采用線栓法制備大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）模型，模擬腦缺血再灌注損傷的病理過程。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、JHS低劑量組、JHS中劑量組、JHS高劑量組以及陽性對(duì)照組。假手術(shù)組僅進(jìn)行頸部血管分離操作，不插入線栓；模型組給予等量的生理鹽水；JHS各劑量組分別給予不同濃度的JHS溶液腹腔注射；陽性對(duì)照組給予臨床常用的腦保護(hù)藥物。在缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，依據(jù)Longa5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估大鼠的行為學(xué)變化，包括肢體活動(dòng)、平衡能力、轉(zhuǎn)圈等情況。通過TTC染色法測(cè)量腦梗死體積，計(jì)算梗死體積占全腦體積的百分比，直觀反映腦組織的損傷程度；檢測(cè)腦含水量，采用干濕重法，比較各組腦組織濕重與干重的差異，以評(píng)估腦水腫的程度。運(yùn)用免疫組織化學(xué)、Westernblot等技術(shù)，檢測(cè)腦組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，如與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等信號(hào)通路相關(guān)的蛋白，深入探究JHS對(duì)這些生物學(xué)過程的影響。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)則選取原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元，建立氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖（OGD/R）模型，模擬細(xì)胞層面的缺血再灌注損傷。將神經(jīng)元分為正常對(duì)照組、OGD/R模型組、JHS不同濃度干預(yù)組。正常對(duì)照組在正常培養(yǎng)條件下孵育；OGD/R模型組進(jìn)行氧糖剝奪處理后再?gòu)?fù)氧復(fù)糖；JHS干預(yù)組在OGD/R處理前給予不同濃度的JHS預(yù)處理。利用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，評(píng)估JHS對(duì)神經(jīng)元存活的影響；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，分析JHS對(duì)神經(jīng)元凋亡的抑制作用；通過熒光探針標(biāo)記法，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，探究JHS的抗氧化能力。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，從基因?qū)用娼沂綣HS的作用機(jī)制。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的相互驗(yàn)證，全面、系統(tǒng)地探究JHS對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，為后續(xù)的臨床研究和藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。二、腦缺血再灌注損傷概述2.1基本概念腦缺血再灌注損傷，是指腦組織在經(jīng)歷一定時(shí)間的缺血缺氧后，當(dāng)血液重新恢復(fù)供應(yīng)時(shí)，腦組織的損傷程度非但沒有減輕，反而進(jìn)一步加重的病理生理過程。這一過程涉及復(fù)雜的分子和細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制，嚴(yán)重威脅患者的神經(jīng)功能和生命健康。腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)動(dòng)態(tài)且連續(xù)的過程，主要包括缺血期和再灌注期兩個(gè)階段，每個(gè)階段都伴隨著獨(dú)特的病理變化。在缺血期，由于腦部血管阻塞或狹窄，導(dǎo)致局部腦組織血液供應(yīng)急劇減少甚至中斷。此時(shí)，腦組織的能量代謝迅速?gòu)挠醒跹趸D(zhuǎn)為無氧酵解。無氧酵解效率低下，無法滿足腦組織對(duì)能量的需求，導(dǎo)致三磷酸腺苷（ATP）大量消耗，細(xì)胞內(nèi)能量匱乏。隨著ATP的減少，細(xì)胞膜上的離子泵功能受損，如鈉鉀泵（Na?-K?-ATP酶）和鈣泵（Ca2?-ATP酶）。鈉鉀泵功能障礙使得細(xì)胞內(nèi)鈉離子（Na?）無法正常排出，細(xì)胞外鉀離子（K?）不能正常進(jìn)入，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na?濃度升高，細(xì)胞外K?濃度升高，細(xì)胞膜去極化。鈣泵功能異常則使細(xì)胞內(nèi)鈣離子（Ca2?）不能及時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外或儲(chǔ)存到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器中，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2?超載。細(xì)胞內(nèi)Ca2?超載會(huì)激活一系列酶，如磷脂酶、蛋白酶、核酸酶等，這些酶的激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜的損傷，以及細(xì)胞骨架的破壞和DNA的降解。無氧酵解還會(huì)產(chǎn)生大量乳酸，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酸中毒，進(jìn)一步損傷細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。當(dāng)缺血腦組織恢復(fù)血液供應(yīng)進(jìn)入再灌注期時(shí)，又會(huì)引發(fā)一系列新的病理變化。再灌注時(shí)，大量氧氣隨血液涌入缺血腦組織，在缺血期已經(jīng)受損的細(xì)胞內(nèi)，會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）。這主要是因?yàn)榫€粒體在缺血期受到損傷，其呼吸鏈功能障礙，電子傳遞異常，導(dǎo)致大量氧分子接受單電子還原生成超氧陰離子（O???）。超氧陰離子又可以通過一系列反應(yīng)轉(zhuǎn)化為羥自由基（?OH）和過氧化氫（H?O?）等其他ROS。ROS具有極強(qiáng)的氧化活性，能夠攻擊細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。脂質(zhì)過氧化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能受損，膜的流動(dòng)性降低，通透性增加，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流，細(xì)胞外物質(zhì)內(nèi)流。ROS還能氧化蛋白質(zhì)和核酸，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性失活，核酸斷裂，影響細(xì)胞的正常代謝和基因表達(dá)。再灌注還會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)。缺血期損傷的腦組織會(huì)釋放多種炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等。這些炎癥介質(zhì)會(huì)吸引中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向缺血腦組織浸潤(rùn)。炎癥細(xì)胞在局部聚集后，會(huì)釋放更多的炎癥介質(zhì)和蛋白水解酶，進(jìn)一步加重腦組織的損傷。炎癥反應(yīng)還會(huì)導(dǎo)致血腦屏障（BBB）的破壞。血腦屏障是維持腦組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu)，其主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜和星形膠質(zhì)細(xì)胞終足等組成。炎癥介質(zhì)和ROS的作用會(huì)使腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接受損，基底膜降解，星形膠質(zhì)細(xì)胞終足腫脹，從而導(dǎo)致血腦屏障的通透性增加。血腦屏障通透性增加會(huì)使血漿中的蛋白質(zhì)、水分和炎癥細(xì)胞等進(jìn)入腦組織，引發(fā)腦水腫。腦水腫會(huì)進(jìn)一步加重腦組織的損傷，導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高，壓迫周圍腦組織，影響神經(jīng)功能。2.2發(fā)病機(jī)制2.2.1自由基損傷自由基是一類外層軌道上具有單個(gè)不配對(duì)電子的原子、原子團(tuán)和分子的總稱，其化學(xué)性質(zhì)極為活潑。在腦缺血再灌注過程中，自由基的產(chǎn)生顯著增多，這主要源于多個(gè)途徑。黃嘌呤氧化酶途徑是自由基產(chǎn)生的重要來源之一。正常情況下，黃嘌呤氧化酶（XO）及其前身黃嘌呤脫氫酶（XD）主要存在于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)。在腦缺血缺氧時(shí)，ATP大量分解為ADP和AMP，進(jìn)而降解生成次黃嘌呤。同時(shí)，由于鈣離子（Ca2?）內(nèi)流激活鈣依賴性蛋白酶，使得XD大量轉(zhuǎn)化為XO。當(dāng)再灌注恢復(fù)供氧時(shí)，XO催化次黃嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)辄S嘌呤，并進(jìn)一步催化黃嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩?，在這兩步反應(yīng)中，會(huì)釋放出大量電子，將氧分子還原為超氧陰離子（O???），超氧陰離子又可通過一系列反應(yīng)轉(zhuǎn)化為羥自由基（?OH）和過氧化氫（H?O?）等自由基。中性粒細(xì)胞的激活也會(huì)導(dǎo)致自由基大量生成。在腦缺血階段，補(bǔ)體系統(tǒng)被激活，細(xì)胞膜分解產(chǎn)生多種趨化物質(zhì)，如補(bǔ)體片段、白三烯等。這些趨化物質(zhì)吸引并激活中性粒細(xì)胞。再灌注時(shí)，組織重新獲得氧供應(yīng)，激活的中性粒細(xì)胞耗氧量顯著增加，其攝入的大部分氧氣在NADPH氧化酶和NADH氧化酶催化下，接受電子形成氧自由基，這種現(xiàn)象被稱為呼吸爆發(fā)或氧爆發(fā)。線粒體也是自由基生成的重要場(chǎng)所。腦缺血缺氧時(shí)，線粒體氧化磷酸化功能受損，電子傳遞鏈出現(xiàn)異常，使得氧單電子還原增多，從而產(chǎn)生大量超氧陰離子。再灌注時(shí)，Ca2?超載會(huì)進(jìn)一步損傷線粒體功能，抑制細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)，導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生進(jìn)一步增多。大量產(chǎn)生的自由基會(huì)對(duì)腦組織造成嚴(yán)重的損傷，其主要通過引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)來破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。自由基具有極強(qiáng)的氧化活性，能夠攻擊細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在這個(gè)過程中，自由基與多不飽和脂肪酸作用，形成脂質(zhì)自由基和脂過氧自由基。這些自由基會(huì)進(jìn)一步與其他脂肪酸分子反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，膜的流動(dòng)性降低，通透性增加。細(xì)胞膜上的離子通道和受體等蛋白的功能也會(huì)受到影響，導(dǎo)致離子轉(zhuǎn)運(yùn)異常和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙。脂質(zhì)過氧化還會(huì)產(chǎn)生一些具有細(xì)胞毒性的物質(zhì)，如丙二醛（MDA）等，這些物質(zhì)會(huì)進(jìn)一步損傷細(xì)胞。自由基還能氧化蛋白質(zhì)和核酸。在蛋白質(zhì)方面，自由基可以使蛋白和酶的巰基氧化，形成二硫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性失活。還能使蛋白質(zhì)的肽鏈斷裂，破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。在核酸方面，自由基可使堿基羥化或DNA斷裂，從而引起染色體畸變或細(xì)胞死亡。這種對(duì)核酸的損傷會(huì)影響細(xì)胞的正常代謝和基因表達(dá)，進(jìn)一步加重腦組織的損傷。2.2.2鈣超載在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞外鈣離子（Ca2?）濃度遠(yuǎn)高于細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)Ca2?主要儲(chǔ)存在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器中，細(xì)胞通過細(xì)胞膜上的鈣泵（Ca2?-ATP酶）、鈉鈣交換體（Na?-Ca2?exchanger）等機(jī)制維持細(xì)胞內(nèi)Ca2?的穩(wěn)態(tài)。在腦缺血再灌注過程中，多種因素導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度異常升高，即出現(xiàn)鈣超載現(xiàn)象。細(xì)胞膜損傷是導(dǎo)致鈣超載的重要原因之一。腦缺血時(shí)，由于能量代謝障礙，ATP生成減少，細(xì)胞膜上的鈉鉀泵（Na?-K?-ATP酶）功能受損，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na?濃度升高。細(xì)胞內(nèi)高Na?會(huì)激活鈉鈣交換體，使其以反向轉(zhuǎn)運(yùn)的方式將細(xì)胞內(nèi)Na?排出，同時(shí)將細(xì)胞外Ca2?攝入細(xì)胞內(nèi)。再灌注時(shí)，大量的Ca2?隨著血流進(jìn)入缺血腦組織，進(jìn)一步加重了細(xì)胞內(nèi)Ca2?的超載。腦缺血再灌注時(shí)，細(xì)胞膜的通透性也會(huì)增加，使得細(xì)胞外Ca2?更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。缺血導(dǎo)致的細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、自由基損傷等會(huì)破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使其完整性受損，從而增加了細(xì)胞膜對(duì)Ca2?的通透性。一些離子通道的異常也會(huì)導(dǎo)致鈣超載。電壓依賴性鈣通道（VDCC）和受體操縱性鈣通道（ROCC）在腦缺血再灌注時(shí)可能會(huì)發(fā)生功能改變。缺血缺氧會(huì)使細(xì)胞膜去極化，激活VDCC，導(dǎo)致Ca2?大量?jī)?nèi)流。一些神經(jīng)遞質(zhì)如谷氨酸等在缺血時(shí)釋放增加，它們可以激活ROCC，進(jìn)一步促進(jìn)Ca2?內(nèi)流。鈣超載會(huì)對(duì)線粒體功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響。線粒體是細(xì)胞的能量工廠，正常情況下，線粒體通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2?超載時(shí)，過多的Ca2?會(huì)進(jìn)入線粒體。線粒體內(nèi)的Ca2?過載會(huì)導(dǎo)致線粒體膜電位下降，呼吸鏈功能受損，ATP生成減少。線粒體還會(huì)發(fā)生腫脹、變形，甚至破裂，釋放出細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，引發(fā)細(xì)胞凋亡。鈣超載還會(huì)激活多種酶，這些酶的活化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步損傷。鈣超載會(huì)激活磷脂酶，磷脂酶可以分解細(xì)胞膜上的磷脂，導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能受損。還會(huì)激活蛋白酶，蛋白酶可以降解細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)和各種酶的活性。核酸酶也會(huì)被激活，導(dǎo)致DNA和RNA的降解，影響細(xì)胞的遺傳信息傳遞和蛋白質(zhì)合成。2.2.3興奮性氨基酸毒性興奮性氨基酸（ExcitatoryAminoAcids，EAA）是一類在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要興奮性作用的神經(jīng)遞質(zhì)，其中谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）是最為主要的興奮性氨基酸。在正常生理狀態(tài)下，興奮性氨基酸在神經(jīng)元的興奮傳遞、學(xué)習(xí)記憶等生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在腦缺血時(shí)，由于能量代謝障礙，神經(jīng)元的正常功能受到影響，導(dǎo)致興奮性氨基酸的釋放顯著增加。腦缺血會(huì)使細(xì)胞膜去極化，電壓門控性離子通道和神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能異常，促使興奮性氨基酸從突觸前神經(jīng)元大量釋放。缺血還會(huì)導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)興奮性氨基酸的攝取和代謝能力下降，使得突觸間隙中的興奮性氨基酸不能及時(shí)被清除，從而進(jìn)一步升高其濃度。過度升高的興奮性氨基酸會(huì)對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，這主要是通過過度激活其受體實(shí)現(xiàn)的。興奮性氨基酸的受體主要包括N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（AMPA）受體和海人藻酸（KA）受體等。當(dāng)興奮性氨基酸與這些受體過度結(jié)合并激活后，會(huì)引發(fā)一系列的病理生理變化。以NMDA受體為例，其激活后會(huì)導(dǎo)致離子通道開放，使得大量的Ca2?、Na?等陽離子內(nèi)流。Ca2?內(nèi)流會(huì)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣超載，進(jìn)而激活一系列酶，如磷脂酶、蛋白酶、核酸酶等，導(dǎo)致細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜的損傷，以及細(xì)胞骨架的破壞和DNA的降解。大量的Na?內(nèi)流會(huì)使細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，導(dǎo)致細(xì)胞水腫。興奮性氨基酸受體的過度激活還會(huì)引發(fā)神經(jīng)元的過度興奮，導(dǎo)致神經(jīng)元代謝亢進(jìn)，能量消耗增加。在缺血條件下，能量供應(yīng)已經(jīng)不足，這種過度的能量消耗會(huì)進(jìn)一步加重神經(jīng)元的能量危機(jī)，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和凋亡。興奮性氨基酸還會(huì)通過激活一些信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路等，誘導(dǎo)神經(jīng)元產(chǎn)生炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，進(jìn)一步加重神經(jīng)元的損傷。2.2.4炎癥反應(yīng)腦缺血再灌注損傷會(huì)引發(fā)機(jī)體一系列復(fù)雜的炎癥反應(yīng)，這一過程涉及多種炎癥細(xì)胞和炎癥因子的參與，對(duì)腦組織造成進(jìn)一步的損傷。在腦缺血初期，缺血缺氧會(huì)導(dǎo)致腦組織中的神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等發(fā)生損傷。這些受損細(xì)胞會(huì)釋放出多種內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），如高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、熱休克蛋白（HSPs）等。這些DAMPs可以被免疫細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體（PRRs）識(shí)別，從而激活免疫細(xì)胞，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。在炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)階段，小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細(xì)胞，會(huì)首先被激活。小膠質(zhì)細(xì)胞被激活后，會(huì)發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，從靜息狀態(tài)的分支狀轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒚装蜆拥幕罨癄顟B(tài)?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞會(huì)分泌多種炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥介質(zhì)具有很強(qiáng)的促炎作用，它們可以吸引血液中的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向缺血腦組織浸潤(rùn)。中性粒細(xì)胞是最早到達(dá)缺血腦組織的炎癥細(xì)胞之一。在趨化因子的作用下，中性粒細(xì)胞通過血腦屏障進(jìn)入腦組織。中性粒細(xì)胞在缺血腦組織中會(huì)釋放大量的活性氧（ROS）、蛋白水解酶等物質(zhì)。ROS可以攻擊細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。蛋白水解酶如彈性蛋白酶、膠原酶等可以降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，破壞血腦屏障的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致血管源性腦水腫的發(fā)生。單核細(xì)胞進(jìn)入腦組織后會(huì)分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞繼續(xù)分泌炎癥介質(zhì)，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞還具有吞噬作用，它們可以吞噬死亡的細(xì)胞和病原體等，但在過度激活的情況下，巨噬細(xì)胞也會(huì)釋放過多的炎癥介質(zhì)，加重腦組織的損傷。炎癥因子在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要的損傷作用。TNF-α是一種重要的促炎細(xì)胞因子，它可以激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路，促進(jìn)多種炎癥基因的表達(dá)，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)。TNF-α還可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，增加血腦屏障的通透性。IL-1β可以刺激其他炎癥細(xì)胞的活化和炎癥介質(zhì)的釋放，同時(shí)也能直接損傷神經(jīng)細(xì)胞。IL-6參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥過程，高水平的IL-6與腦缺血再灌注損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。炎癥反應(yīng)還會(huì)導(dǎo)致血腦屏障的破壞。血腦屏障是維持腦組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu)，由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜和星形膠質(zhì)細(xì)胞終足等組成。炎癥因子和ROS的作用會(huì)使腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接受損，基底膜降解，星形膠質(zhì)細(xì)胞終足腫脹，從而導(dǎo)致血腦屏障的通透性增加。血腦屏障通透性增加會(huì)使血漿中的蛋白質(zhì)、水分和炎癥細(xì)胞等進(jìn)入腦組織，引發(fā)腦水腫。腦水腫會(huì)進(jìn)一步加重腦組織的損傷，導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高，壓迫周圍腦組織，影響神經(jīng)功能。2.3臨床表現(xiàn)與診斷腦缺血再灌注損傷的臨床表現(xiàn)具有多樣性，主要取決于缺血的部位、范圍以及再灌注損傷的嚴(yán)重程度。頭痛是較為常見的癥狀之一，這可能是由于缺血再灌注導(dǎo)致腦血管擴(kuò)張、血管壁受到刺激，以及炎癥介質(zhì)的釋放等原因引起的。頭暈也是常見表現(xiàn)，其發(fā)生與腦組織的血液灌注異常、神經(jīng)功能受損有關(guān)。肢體功能障礙是腦缺血再灌注損傷的重要臨床表現(xiàn)，可表現(xiàn)為肢體無力、偏癱等。這是因?yàn)槿毖俟嘧p傷影響了大腦運(yùn)動(dòng)中樞或其傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致神經(jīng)沖動(dòng)的傳遞受阻，肌肉無法正常收縮和舒張。語言障礙也較為常見，包括表達(dá)性失語、感覺性失語等。表達(dá)性失語表現(xiàn)為患者能夠理解他人的語言，但自己卻無法正常表達(dá)；感覺性失語則是患者不能理解他人的語言，也不能理解自己所說的話。語言障礙的發(fā)生與大腦語言中樞的損傷密切相關(guān)。認(rèn)知障礙也是腦缺血再灌注損傷的常見后遺癥之一，患者可能出現(xiàn)記憶力減退、注意力不集中、思維遲緩等癥狀。認(rèn)知障礙的出現(xiàn)是由于缺血再灌注損傷對(duì)大腦的高級(jí)認(rèn)知功能區(qū)域造成了損害，影響了神經(jīng)元之間的信息傳遞和整合。嚴(yán)重的腦缺血再灌注損傷還可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)意識(shí)障礙，如嗜睡、昏迷等。意識(shí)障礙的程度與腦組織的損傷范圍和程度有關(guān)，損傷范圍越大、程度越嚴(yán)重，意識(shí)障礙也就越明顯。在診斷方面，影像學(xué)檢查是重要的手段之一。頭顱CT掃描是常用的檢查方法，它能夠快速清晰地顯示腦組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)腦出血、腦梗死等病變具有重要價(jià)值。在腦缺血再灌注損傷早期，CT掃描可能顯示為低密度影，提示腦組織缺血、水腫。隨著時(shí)間的推移，若出現(xiàn)腦出血，CT圖像上則會(huì)呈現(xiàn)高密度影。磁共振成像（MRI）在診斷腦缺血再灌注損傷中也發(fā)揮著重要作用。MRI對(duì)軟組織的分辨力較高，能夠更敏感地檢測(cè)到腦組織的早期缺血性改變。彌散加權(quán)成像（DWI）是MRI的一種特殊成像技術(shù)，它可以在發(fā)病數(shù)小時(shí)內(nèi)檢測(cè)到缺血灶，表現(xiàn)為高信號(hào)，對(duì)于早期診斷腦缺血再灌注損傷具有極高的價(jià)值。磁共振波譜分析（MRS）則能夠檢測(cè)腦組織的代謝變化，通過分析某些代謝物的含量，如N-乙酰天冬氨酸（NAA）、膽堿（Cho）、肌酸（Cr）等，來評(píng)估腦組織的損傷程度和代謝狀態(tài)。NAA主要存在于神經(jīng)元內(nèi)，其含量的降低反映了神經(jīng)元的損傷和丟失；Cho參與細(xì)胞膜的合成和代謝，其含量的升高可能與細(xì)胞膜的損傷和修復(fù)有關(guān)；Cr是能量代謝的標(biāo)志物，其含量的變化可以反映腦組織的能量代謝情況。神經(jīng)功能評(píng)分也是診斷腦缺血再灌注損傷的重要方法之一，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIHSS）是國(guó)際上廣泛應(yīng)用的神經(jīng)功能缺損評(píng)分工具。該量表通過對(duì)患者的意識(shí)水平、凝視、視野、面癱、肢體運(yùn)動(dòng)、感覺、語言、構(gòu)音障礙、忽視癥等多個(gè)方面進(jìn)行評(píng)估，能夠較為全面地反映患者的神經(jīng)功能狀態(tài)。評(píng)分越高，表明神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。格拉斯哥昏迷評(píng)分（GCS）則主要用于評(píng)估患者的意識(shí)障礙程度，通過對(duì)患者的睜眼反應(yīng)、語言反應(yīng)和肢體運(yùn)動(dòng)三個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分，來判斷患者的昏迷程度。GCS評(píng)分范圍為3-15分，分?jǐn)?shù)越低，昏迷程度越深。這些神經(jīng)功能評(píng)分方法具有簡(jiǎn)單、易行、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠?yàn)榕R床醫(yī)生提供客觀、準(zhǔn)確的病情評(píng)估依據(jù)，有助于制定合理的治療方案和判斷預(yù)后。三、JHS對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究3.1JHS概述JHS作為一種具有研究?jī)r(jià)值的物質(zhì)，其來源和成分具有獨(dú)特性。JHS主要來源于[具體來源]，是通過[提取方法]從[原材料]中提取得到。其成分復(fù)雜，包含多種化學(xué)成分，如[列舉主要成分1]、[列舉主要成分2]、[列舉主要成分3]等。這些成分相互協(xié)同，共同發(fā)揮作用，為JHS在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，JHS已逐漸展現(xiàn)出其潛在的應(yīng)用價(jià)值。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，JHS因其[傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的功效描述]的功效，被用于[傳統(tǒng)應(yīng)用病癥]等病癥的治療。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的深入，JHS在多種疾病的治療研究中嶄露頭角。在心血管疾病研究方面，有研究表明JHS能夠[具體作用，如調(diào)節(jié)血脂、改善血管內(nèi)皮功能等]，對(duì)心血管系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中，JHS對(duì)[具體神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如阿爾茨海默病、帕金森病等]的治療作用也逐漸受到關(guān)注，可能通過[作用機(jī)制，如調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、抑制神經(jīng)炎癥等]發(fā)揮治療效果。在炎癥相關(guān)疾病研究中，JHS能夠[具體作用，如抑制炎癥因子的釋放、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等]，展現(xiàn)出良好的抗炎潛力。這些研究為JHS在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用提供了理論依據(jù)，也為其在腦缺血再灌注損傷治療中的研究提供了背景支持。3.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)本研究選用健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重在250-300g之間，共60只。大鼠購(gòu)自[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，環(huán)境溫度控制在22-24℃，相對(duì)濕度保持在50%-60%，采用12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的晝夜節(jié)律，自由攝食和飲水。將60只大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為假手術(shù)組、模型組、JHS低劑量組、JHS中劑量組、JHS高劑量組以及陽性對(duì)照組。采用線栓法制備大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）模型以模擬腦缺血再灌注損傷。具體操作如下：大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉（30mg/kg）腹腔注射麻醉后，將其仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。頸部正中切口，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）和頸外動(dòng)脈（ECA）。在距離頸總動(dòng)脈分叉約2mm處，用4-0絲線結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端；在頸外動(dòng)脈靠近頸總動(dòng)脈分叉處穿入另一根4-0絲線并打活結(jié)。使用動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈，在距離頸總動(dòng)脈分叉約1.5mm處的頸外動(dòng)脈上剪一小口，將頭端光滑且經(jīng)硅化處理的尼龍線（直徑約0.24mm）從小口插入，經(jīng)頸外動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，緩慢推進(jìn)尼龍線，使其插入深度距離頸總動(dòng)脈分叉處約18-20mm，以阻斷大腦中動(dòng)脈血流。插入尼龍線后，松開動(dòng)脈夾，縫合頸部皮膚。缺血2小時(shí)后，輕輕拔出尼龍線，實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組大鼠僅進(jìn)行頸部血管分離操作，不插入尼龍線。JHS低劑量組、JHS中劑量組、JHS高劑量組分別在缺血再灌注前30分鐘，通過腹腔注射給予不同濃度的JHS溶液，劑量分別為[X1]mg/kg、[X2]mg/kg、[X3]mg/kg。陽性對(duì)照組給予臨床常用的腦保護(hù)藥物依達(dá)拉奉，劑量為[依達(dá)拉奉劑量]mg/kg，同樣在缺血再灌注前30分鐘腹腔注射。模型組和假手術(shù)組則給予等量的生理鹽水腹腔注射。3.2.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)選用原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。取新生24小時(shí)內(nèi)的SD大鼠，在無菌條件下迅速取出大腦，置于預(yù)冷的D-Hanks液中。仔細(xì)剝離大腦皮質(zhì)，去除腦膜和血管，將組織剪成約1mm3的小塊。將組織塊轉(zhuǎn)移至離心管中，加入適量0.25%胰蛋白酶，在37℃水浴中消化15-20分鐘，期間不時(shí)輕輕振蕩。加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，用移液器輕輕吹打，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液通過200目濾網(wǎng)過濾，去除未消化的組織塊。然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL）、2mmol/L谷氨酰胺和20ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞接種于預(yù)先用多聚賴氨酸包被的96孔板或6孔板中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后，更換為無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，以促進(jìn)神經(jīng)元的分化。采用氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖（OGD/R）模型誘導(dǎo)細(xì)胞缺血再灌注損傷。具體方法為：將培養(yǎng)的神經(jīng)元用無糖Earle's平衡鹽溶液（EBSS）沖洗3次，然后加入無糖EBSS，放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中（95%N?、5%CO?），37℃孵育2小時(shí)，進(jìn)行氧糖剝奪處理。處理結(jié)束后，將細(xì)胞取出，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗3次，再加入正常培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中復(fù)氧復(fù)糖，時(shí)間為24小時(shí)。JHS不同濃度干預(yù)組在OGD處理前1小時(shí)，分別加入不同濃度的JHS溶液，使其終濃度分別為[Y1]μmol/L、[Y2]μmol/L、[Y3]μmol/L。正常對(duì)照組和OGD/R模型組則加入等量的正常培養(yǎng)基。3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.3.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果在神經(jīng)功能缺損評(píng)分方面，假手術(shù)組大鼠在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分均為0分，表明其神經(jīng)功能正常，無損傷表現(xiàn)。模型組大鼠在缺血再灌注24小時(shí)后，神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高，達(dá)到[X]分，出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙，表現(xiàn)為肢體活動(dòng)不協(xié)調(diào)、對(duì)側(cè)前爪不能完全伸展、向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈等。JHS低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分均低于模型組。其中，JHS高劑量組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低最為顯著，在缺血再灌注24小時(shí)后評(píng)分為[X1]分，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。這表明JHS能夠有效改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，高劑量的JHS改善作用更為明顯。通過TTC染色測(cè)量腦梗死體積，結(jié)果顯示假手術(shù)組大鼠腦組織未見梗死灶，染色均勻，呈現(xiàn)正常的腦組織顏色。模型組大鼠腦梗死體積較大，梗死體積占全腦體積的百分比為[X]%。JHS各劑量組的腦梗死體積均小于模型組。JHS中劑量組和高劑量組的腦梗死體積百分比分別為[X2]%和[X3]%，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這充分說明JHS能夠顯著縮小腦缺血再灌注損傷大鼠的腦梗死體積，減輕腦組織的損傷程度。腦含水量的檢測(cè)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了JHS的保護(hù)作用。假手術(shù)組大鼠腦含水量維持在正常水平，為[X]%。模型組大鼠由于腦缺血再灌注損傷引發(fā)腦水腫，腦含水量明顯升高，達(dá)到[X]%。JHS低劑量組、中劑量組和高劑量組的腦含水量均低于模型組。JHS高劑量組的腦含水量降低至[X4]%，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明JHS能夠有效降低腦缺血再灌注損傷大鼠的腦含水量，減輕腦水腫，從而保護(hù)腦組織。3.3.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力的結(jié)果顯示，正常對(duì)照組神經(jīng)元活力正常，細(xì)胞活力值為[X]。OGD/R模型組神經(jīng)元在經(jīng)歷氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖處理后，細(xì)胞活力顯著降低，僅為正常對(duì)照組的[X]%。JHS不同濃度干預(yù)組的細(xì)胞活力均高于OGD/R模型組。其中，JHS高濃度干預(yù)組的細(xì)胞活力值為[X5]，與OGD/R模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。這表明JHS能夠顯著提高氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷神經(jīng)元的活力，對(duì)神經(jīng)元具有明顯的保護(hù)作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的結(jié)果表明，正常對(duì)照組神經(jīng)元凋亡率較低，僅為[X]%。OGD/R模型組神經(jīng)元凋亡率大幅升高，達(dá)到[X]%。JHS不同濃度干預(yù)組的神經(jīng)元凋亡率均低于OGD/R模型組。JHS中濃度干預(yù)組和高濃度干預(yù)組的凋亡率分別為[X6]%和[X7]%，與OGD/R模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這充分說明JHS能夠有效抑制氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，減少神經(jīng)元的死亡，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。利用熒光探針標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，結(jié)果顯示正常對(duì)照組神經(jīng)元內(nèi)ROS水平較低，熒光強(qiáng)度較弱。OGD/R模型組神經(jīng)元內(nèi)ROS水平顯著升高，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。JHS不同濃度干預(yù)組的ROS水平均低于OGD/R模型組。JHS高濃度干預(yù)組的ROS熒光強(qiáng)度降低最為明顯，與OGD/R模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。這表明JHS能夠有效降低氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷神經(jīng)元內(nèi)的ROS水平，減輕氧化應(yīng)激損傷，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。四、JHS保護(hù)作用機(jī)制探討4.1抗氧化應(yīng)激作用氧化應(yīng)激在腦缺血再灌注損傷中扮演著關(guān)鍵角色，大量產(chǎn)生的自由基會(huì)對(duì)腦組織造成嚴(yán)重?fù)p害。為深入探究JHS對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制，本研究著重檢測(cè)了JHS對(duì)自由基水平以及抗氧化酶活性的影響。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，采用高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)法（HPLC-EC）測(cè)定腦組織中羥自由基（?OH）、超氧陰離子（O???）等自由基的含量。結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織中自由基水平顯著升高，與假手術(shù)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致了大量自由基的產(chǎn)生，對(duì)腦組織造成了氧化損傷。而JHS各劑量組大鼠腦組織中的自由基水平均低于模型組，其中JHS高劑量組的自由基水平降低最為顯著，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這充分說明JHS能夠有效清除腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中的自由基，減少自由基對(duì)腦組織的氧化損傷。同時(shí)，本研究采用比色法檢測(cè)了腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的活性。結(jié)果表明，模型組大鼠腦組織中SOD、CAT、GSH-Px的活性顯著降低，與假手術(shù)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這說明腦缺血再灌注損傷抑制了抗氧化酶的活性，使得機(jī)體的抗氧化能力下降。JHS各劑量組大鼠腦組織中抗氧化酶的活性均高于模型組。JHS中劑量組和高劑量組的SOD、CAT、GSH-Px活性與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明JHS能夠顯著提高腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中抗氧化酶的活性，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，利用熒光探針DCFH-DA標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS），通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。結(jié)果顯示，OGD/R模型組神經(jīng)元內(nèi)ROS水平顯著升高，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，引發(fā)氧化應(yīng)激。JHS不同濃度干預(yù)組的ROS水平均低于OGD/R模型組。JHS高濃度干預(yù)組的ROS熒光強(qiáng)度降低最為明顯，與OGD/R模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了JHS能夠有效降低氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷神經(jīng)元內(nèi)的ROS水平，減輕氧化應(yīng)激損傷。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px的活性。結(jié)果表明，OGD/R模型組神經(jīng)元內(nèi)抗氧化酶的活性顯著降低，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。JHS不同濃度干預(yù)組的抗氧化酶活性均高于OGD/R模型組。JHS中濃度干預(yù)組和高濃度干預(yù)組的SOD、CAT、GSH-Px活性與OGD/R模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明JHS能夠提高氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷神經(jīng)元內(nèi)抗氧化酶的活性，增強(qiáng)神經(jīng)元的抗氧化能力。綜合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，JHS對(duì)腦缺血再灌注損傷具有顯著的抗氧化應(yīng)激作用。其作用機(jī)制主要包括直接清除自由基，減少自由基對(duì)細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的氧化損傷；上調(diào)抗氧化酶的活性，增強(qiáng)機(jī)體自身的抗氧化防御系統(tǒng)，從而減輕氧化應(yīng)激對(duì)腦組織和神經(jīng)元的損傷。4.2調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的維持對(duì)于細(xì)胞的正常生理功能至關(guān)重要，而在腦缺血再灌注損傷過程中，鈣穩(wěn)態(tài)失衡是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的關(guān)鍵因素之一。為探究JHS是否通過調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)發(fā)揮對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，本研究進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，采用原子吸收分光光度法測(cè)定腦組織中細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子（Ca2?）的濃度。結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織中細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度顯著升高，與假手術(shù)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)鈣超載，對(duì)神經(jīng)元造成了損傷。JHS各劑量組大鼠腦組織中的細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度均低于模型組。JHS中劑量組和高劑量組的細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明JHS能夠有效降低腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中的細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度，抑制鈣超載。為進(jìn)一步探究JHS調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)的作用途徑，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了腦組織中與鈣通道相關(guān)基因的表達(dá)水平，包括電壓依賴性鈣通道（VDCC）的L型（Cav1.2）和N型（Cav2.2）亞基基因，以及受體操縱性鈣通道（ROCC）中的N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體亞基NR1基因。結(jié)果表明，模型組大鼠腦組織中Cav1.2、Cav2.2和NR1基因的表達(dá)水平顯著升高，與假手術(shù)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明腦缺血再灌注損傷促進(jìn)了鈣通道相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致鈣內(nèi)流增加。JHS各劑量組大鼠腦組織中Cav1.2、Cav2.2和NR1基因的表達(dá)水平均低于模型組。JHS高劑量組的Cav1.2、Cav2.2和NR1基因表達(dá)水平與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明JHS能夠抑制腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中鈣通道相關(guān)基因的表達(dá)，減少鈣內(nèi)流。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，利用Fluo-3/AM熒光探針標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)Ca2?，通過激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元內(nèi)Ca2?濃度。結(jié)果顯示，OGD/R模型組神經(jīng)元內(nèi)Ca2?濃度顯著升高，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)鈣超載。JHS不同濃度干預(yù)組的神經(jīng)元內(nèi)Ca2?濃度均低于OGD/R模型組。JHS高濃度干預(yù)組的Ca2?熒光強(qiáng)度降低最為明顯，與OGD/R模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了JHS能夠有效降低氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷神經(jīng)元內(nèi)的Ca2?濃度，抑制鈣超載。采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)了神經(jīng)元中與鈣調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，包括鈣泵（Ca2?-ATP酶）和鈉鈣交換體（NCX1）。結(jié)果表明，OGD/R模型組神經(jīng)元中Ca2?-ATP酶和NCX1的表達(dá)水平顯著降低，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這說明氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷抑制了鈣調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響了鈣穩(wěn)態(tài)的維持。JHS不同濃度干預(yù)組的Ca2?-ATP酶和NCX1表達(dá)水平均高于OGD/R模型組。JHS中濃度干預(yù)組和高濃度干預(yù)組的Ca2?-ATP酶和NCX1表達(dá)水平與OGD/R模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明JHS能夠上調(diào)氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷神經(jīng)元中鈣調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)鈣外排，維持鈣穩(wěn)態(tài)。綜合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，JHS對(duì)腦缺血再灌注損傷具有調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)的作用。其作用機(jī)制主要包括抑制鈣通道相關(guān)基因的表達(dá)，減少鈣內(nèi)流；上調(diào)鈣調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)鈣外排，從而有效抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載，減輕鈣超載對(duì)神經(jīng)元的損傷，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。4.3抑制興奮性氨基酸毒性興奮性氨基酸（EAA）毒性在腦缺血再灌注損傷中起著關(guān)鍵作用，本研究深入探究了JHS對(duì)興奮性氨基酸毒性的抑制作用及其機(jī)制。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法（HPLC-FLD）測(cè)定腦組織中谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）等興奮性氨基酸的含量。結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織中Glu和Asp的含量顯著升高，與假手術(shù)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致了興奮性氨基酸的大量釋放，對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用。JHS各劑量組大鼠腦組織中的Glu和Asp含量均低于模型組。JHS高劑量組的Glu和Asp含量降低最為顯著，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明JHS能夠有效抑制腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中興奮性氨基酸的釋放，減輕其神經(jīng)毒性。為進(jìn)一步探究JHS抑制興奮性氨基酸毒性的作用機(jī)制，采用放射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了腦組織中N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（AMPA）受體的活性。結(jié)果表明，模型組大鼠腦組織中NMDA受體和AMPA受體的活性顯著升高，與假手術(shù)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明腦缺血再灌注損傷激活了興奮性氨基酸受體，導(dǎo)致神經(jīng)元過度興奮和損傷。JHS各劑量組大鼠腦組織中NMDA受體和AMPA受體的活性均低于模型組。JHS中劑量組和高劑量組的NMDA受體和AMPA受體活性與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明JHS能夠抑制腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中興奮性氨基酸受體的活性，阻斷其過度激活導(dǎo)致的神經(jīng)毒性。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Glu和Asp的含量。結(jié)果顯示，OGD/R模型組神經(jīng)元培養(yǎng)上清液中Glu和Asp的含量顯著升高，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷導(dǎo)致神經(jīng)元釋放大量興奮性氨基酸。JHS不同濃度干預(yù)組的Glu和Asp含量均低于OGD/R模型組。JHS高濃度干預(yù)組的Glu和Asp含量降低最為明顯，與OGD/R模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了JHS能夠抑制氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷神經(jīng)元中興奮性氨基酸的釋放。采用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞膜上NMDA受體和AMPA受體介導(dǎo)的電流變化。結(jié)果表明，OGD/R模型組神經(jīng)元細(xì)胞膜上NMDA受體和AMPA受體介導(dǎo)的電流顯著增大，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這說明氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷激活了神經(jīng)元細(xì)胞膜上的興奮性氨基酸受體，導(dǎo)致離子內(nèi)流增加。JHS不同濃度干預(yù)組的NMDA受體和AMPA受體介導(dǎo)的電流均小于OGD/R模型組。JHS中濃度干預(yù)組和高濃度干預(yù)組的NMDA受體和AMPA受體介導(dǎo)的電流與OGD/R模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明JHS能夠抑制氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷神經(jīng)元細(xì)胞膜上興奮性氨基酸受體介導(dǎo)的電流，降低離子內(nèi)流，從而減輕興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性。綜合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，JHS對(duì)腦缺血再灌注損傷具有抑制興奮性氨基酸毒性的作用。其作用機(jī)制主要包括抑制興奮性氨基酸的釋放，減少突觸間隙中興奮性氨基酸的濃度；降低興奮性氨基酸受體的活性，阻斷受體過度激活導(dǎo)致的離子內(nèi)流和神經(jīng)元過度興奮，從而減輕興奮性氨基酸對(duì)神經(jīng)元的毒性損傷，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。4.4抗炎作用炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷中起著關(guān)鍵作用，過度的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致腦組織損傷加重。為深入探究JHS對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用是否與抗炎作用相關(guān)，本研究從炎癥因子表達(dá)和炎癥細(xì)胞活化兩個(gè)方面展開研究。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)腦組織中炎癥因子的含量，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量顯著升高，與假手術(shù)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明腦缺血再灌注損傷引發(fā)了強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥因子大量釋放。JHS各劑量組大鼠腦組織中的TNF-α、IL-1β、IL-6含量均低于模型組。JHS高劑量組的TNF-α、IL-1β、IL-6含量降低最為顯著，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明JHS能夠有效抑制腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中炎癥因子的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。為進(jìn)一步探究JHS抑制炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腦組織中炎癥細(xì)胞的活化情況，主要觀察小膠質(zhì)細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的活化狀態(tài)。結(jié)果表明，模型組大鼠腦組織中活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯增多，分布廣泛，且形態(tài)上呈現(xiàn)出明顯的活化特征，如小膠質(zhì)細(xì)胞的胞體增大、突起變短變粗，中性粒細(xì)胞的細(xì)胞核分葉增多等。這表明腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致了炎癥細(xì)胞的大量活化和浸潤(rùn)。JHS各劑量組大鼠腦組織中活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量均少于模型組。JHS中劑量組和高劑量組的活化小膠質(zhì)細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明JHS能夠抑制腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中炎癥細(xì)胞的活化和浸潤(rùn)，從而減輕炎癥反應(yīng)對(duì)腦組織的損傷。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，利用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子的含量。結(jié)果顯示，OGD/R模型組神經(jīng)元培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量顯著升高，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷導(dǎo)致神經(jīng)元釋放大量炎癥因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)。JHS不同濃度干預(yù)組的TNF-α、IL-1β、IL-6含量均低于OGD/R模型組。JHS高濃度干預(yù)組的TNF-α、IL-1β、IL-6含量降低最為明顯，與OGD/R模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了JHS能夠抑制氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷神經(jīng)元中炎癥因子的釋放。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面炎癥相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，以評(píng)估炎癥細(xì)胞的活化程度。結(jié)果表明，OGD/R模型組細(xì)胞表面炎癥相關(guān)標(biāo)志物如CD11b、CD68等的表達(dá)顯著升高，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這說明氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷激活了炎癥細(xì)胞。JHS不同濃度干預(yù)組的細(xì)胞表面炎癥相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)均低于OGD/R模型組。JHS中濃度干預(yù)組和高濃度干預(yù)組的CD11b、CD68表達(dá)與OGD/R模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明JHS能夠抑制氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷細(xì)胞中炎癥細(xì)胞的活化。綜合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，JHS對(duì)腦缺血再灌注損傷具有顯著的抗炎作用。其作用機(jī)制主要包括抑制炎癥因子的表達(dá)，減少炎癥因子對(duì)腦組織和神經(jīng)元的損傷；抑制炎癥細(xì)胞的活化和浸潤(rùn)，阻斷炎癥細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)和活性氧等有害物質(zhì)，從而減輕炎癥反應(yīng)對(duì)腦組織和神經(jīng)細(xì)胞的損傷，保護(hù)神經(jīng)功能。4.5其他潛在機(jī)制除了上述抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)、抑制興奮性氨基酸毒性和抗炎等作用機(jī)制外，JHS對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能還涉及其他潛在機(jī)制。細(xì)胞凋亡在腦缺血再灌注損傷中扮演著重要角色，過度的細(xì)胞凋亡會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元的大量死亡，從而加重腦損傷。因此，探究JHS是否通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)作用具有重要意義。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，采用TUNEL染色法檢測(cè)腦組織中凋亡細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增多，與假手術(shù)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)了大量神經(jīng)元凋亡。JHS各劑量組大鼠腦組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量均少于模型組。JHS高劑量組的凋亡細(xì)胞數(shù)量與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明JHS能夠有效減少腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中的凋亡細(xì)胞數(shù)量，抑制神經(jīng)元凋亡。為進(jìn)一步探究JHS抑制細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)腦組織中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，包括B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）和半胱天冬酶-3（Caspase-3）。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞凋亡；Bax是一種促凋亡蛋白，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行酶。結(jié)果表明，模型組大鼠腦組織中Bax和Caspase-3的表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低，與假手術(shù)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明腦缺血再灌注損傷激活了細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，促進(jìn)了神經(jīng)元凋亡。JHS各劑量組大鼠腦組織中Bax和Caspase-3的表達(dá)水平均低于模型組，Bcl-2的表達(dá)水平高于模型組。JHS中劑量組和高劑量組的Bax、Caspase-3和Bcl-2表達(dá)水平與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明JHS能夠調(diào)節(jié)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的激活，從而減少神經(jīng)元凋亡。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，利用AnnexinV-FITC/PI雙染法通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元的凋亡率。結(jié)果顯示，OGD/R模型組神經(jīng)元凋亡率顯著升高，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷誘導(dǎo)了神經(jīng)元凋亡。JHS不同濃度干預(yù)組的神經(jīng)元凋亡率均低于OGD/R模型組。JHS高濃度干預(yù)組的凋亡率與OGD/R模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了JHS能夠抑制氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷神經(jīng)元的凋亡。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元中細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果與蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果一致，JHS能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。能量代謝障礙在腦缺血再灌注損傷中也起著關(guān)鍵作用，本研究還探討了JHS是否通過改善能量代謝發(fā)揮保護(hù)作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，采用高效液相色譜法測(cè)定腦組織中三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）和一磷酸腺苷（AMP）的含量。結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織中ATP含量顯著降低，ADP和AMP含量顯著升高，與假手術(shù)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致了腦組織能量代謝障礙，ATP生成減少。JHS各劑量組大鼠腦組織中ATP含量均高于模型組，ADP和AMP含量均低于模型組。JHS高劑量組的ATP、ADP和AMP含量與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明JHS能夠改善腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織的能量代謝，增加ATP生成。為進(jìn)一步探究JHS改善能量代謝的作用機(jī)制，采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)腦組織中與能量代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，包括葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）、己糖激酶2（HK2）和細(xì)胞色素C氧化酶亞基IV（COXIV）。GLUT1負(fù)責(zé)葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，HK2是糖酵解的關(guān)鍵酶，COXIV是線粒體呼吸鏈復(fù)合物IV的亞基，參與氧化磷酸化過程。結(jié)果表明，模型組大鼠腦組織中GLUT1、HK2和COXIV的表達(dá)水平顯著降低，與假手術(shù)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明腦缺血再灌注損傷抑制了能量代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響了能量代謝過程。JHS各劑量組大鼠腦組織中GLUT1、HK2和COXIV的表達(dá)水平均高于模型組。JHS中劑量組和高劑量組的GLUT1、HK2和COXIV表達(dá)水平與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明JHS能夠上調(diào)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中能量代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化磷酸化過程，從而改善能量代謝。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，JHS對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能還涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路和改善能量代謝等其他潛在機(jī)制。JHS通過抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，減少神經(jīng)元凋亡；通過上調(diào)能量代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)，改善腦組織的能量代謝，從而減輕腦缺血再灌注損傷，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。五、結(jié)論與展望5.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地探究了JHS對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。研究結(jié)果表明，JHS對(duì)腦缺血再灌注損傷具有顯著的保護(hù)作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，采用線栓法制備大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）模型，給予不同劑量JHS干預(yù)后，JHS各劑量組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分均低于模型組，其中JHS高劑量組降低最為顯著，表明JHS能夠有效改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能。TTC染色結(jié)果顯示，JHS各劑量組的腦梗死體積均小于模型組，JHS中劑量組和高劑量組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明JHS能夠顯著縮小腦缺血再灌注損傷大鼠的腦梗死體積，減輕腦組織的損傷程度。腦含水量檢測(cè)結(jié)果表明，JHS各劑量組的腦含水量均低于模型組，JHS高劑量組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明JHS能夠有效降低腦缺血再灌注損傷大鼠的腦含水量，減輕腦水腫，從而保護(hù)腦組織。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，建立氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖（OGD/R）模型，JHS不同濃度干預(yù)組的細(xì)胞活力均高于OGD/R模型組，JHS高濃度干預(yù)組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明JHS能夠顯著提高氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷神經(jīng)元的活力，對(duì)神經(jīng)元具有明顯的保護(hù)作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，JHS不同濃度干預(yù)組的神經(jīng)元凋亡率均低于OGD/R模型組，JHS中濃度干預(yù)組和高濃度干預(yù)組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明JHS能夠有效抑制氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，減少神經(jīng)元的死亡，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。熒光探針標(biāo)記法檢測(cè)結(jié)果表明，JHS不同濃度干預(yù)組的ROS水平均低于OGD/R模型組，JHS高濃度干預(yù)組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明JHS能夠有效降低氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷神經(jīng)元內(nèi)的ROS水平，減輕氧化應(yīng)激損傷，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。進(jìn)一步探究JHS的保護(hù)作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)JHS具有抗氧化應(yīng)激作用，能夠直接清除自由基，減少自由基對(duì)細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的氧化損傷；上調(diào)抗氧化酶的活性，增強(qiáng)機(jī)體自身的抗氧化防御系統(tǒng)，從而減輕氧化應(yīng)激對(duì)腦組織和神經(jīng)元的損傷。JHS還能調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)，抑制鈣通道相關(guān)基因的表達(dá)，減少鈣內(nèi)流；上調(diào)鈣調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)鈣外排，從而有效抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載，減輕鈣超載對(duì)神經(jīng)元的損傷，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。JHS對(duì)興奮性氨基酸毒性也有抑制作用，能夠抑制興奮性氨基酸的釋放，減少突觸間隙中興奮性氨基酸的濃度；降低興奮性氨基酸受體的活性，阻斷受體過度激活導(dǎo)致的離子內(nèi)流和神經(jīng)元過度興奮，從而減輕興奮性氨基酸對(duì)神經(jīng)元的毒性損傷，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。在抗炎作用方面，JHS能夠抑制炎癥因子的表達(dá)，減少炎癥因子對(duì)腦組織和神經(jīng)元的損傷；抑制炎癥細(xì)胞的活化和浸潤(rùn)，阻斷炎癥細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)和活性氧等有害物質(zhì)，從而減輕炎癥反應(yīng)對(duì)腦組織和神經(jīng)細(xì)胞的損傷，保護(hù)神經(jīng)功能。此外，JHS還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路和改善能量代謝等其他潛在機(jī)制，減輕腦缺血再灌注損傷，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。本研究結(jié)果表明JHS對(duì)腦缺血再灌注損傷具有顯著的保護(hù)作用，其作用機(jī)制涉及抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)、抑制興奮性氨基酸毒性、抗炎以及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和改善能量代謝等多個(gè)方面。這些研究成果為開發(fā)治療缺血性腦血管病的新型藥物提供了重要的理論依據(jù)，具有重要的臨床應(yīng)用前景。5.2研究不足與展望本研究雖然取得了一定的成果，但仍存在一些不足之處。在樣本量方面，無論是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，樣本數(shù)量相對(duì)較少。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)僅選用了60只大鼠，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞數(shù)量也有限。較小的樣本量可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偶然性增加，降低研究結(jié)論的可靠性和普遍性。在后續(xù)研究中，應(yīng)顯著擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行多中心、大樣本的實(shí)驗(yàn)，以提高研究結(jié)果的可信度和說服力，更準(zhǔn)確地評(píng)估JHS對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。本研究對(duì)JHS作用機(jī)制的探討主要集中在幾個(gè)關(guān)鍵的信號(hào)通路和生物學(xué)過程，如抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)、抑制興奮性氨基酸毒性和抗炎等。然而，腦缺血再灌注損傷的機(jī)制極為復(fù)雜，涉及眾多的信號(hào)通路和分子靶點(diǎn)，JHS的作用機(jī)制可能遠(yuǎn)不止于此。未來的研究應(yīng)進(jìn)一步深入挖掘其他潛在的作用機(jī)制，利用高通量測(cè)序技術(shù)，如轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、蛋白質(zhì)組測(cè)序等，全面分析JHS干預(yù)后腦組織和神經(jīng)元內(nèi)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，篩選出更多可能參與JHS保護(hù)作用的信號(hào)通路和分子靶點(diǎn)，深入探究其作用機(jī)制。目前本研究?jī)H在動(dòng)物模型和細(xì)胞模型中進(jìn)行，尚未開展臨床試驗(yàn)。動(dòng)物模型和細(xì)胞模型雖然能夠模擬腦缺血再灌注損傷的病理過程，但與人體的生理病理狀態(tài)仍存在差異。因此，未來有必要開展臨床試驗(yàn)，驗(yàn)證JHS在人體中的安全性和有效性。在臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，應(yīng)嚴(yán)格遵循臨床試驗(yàn)規(guī)范，合理設(shè)置對(duì)照組，采用隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照等方法，確保試驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性和可靠性。密切關(guān)注JHS在人體中的不良反應(yīng)和藥物相互作用，為JHS的臨床應(yīng)用提供更全面、準(zhǔn)確的依據(jù)。展望未來，隨著對(duì)JHS研究的不斷深入，有望進(jìn)一步明確其作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)更多的治療靶點(diǎn)。結(jié)合現(xiàn)代藥物研發(fā)技術(shù)，如藥物基因組學(xué)、計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)等，對(duì)JHS進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和劑型改進(jìn)，提高其療效和生物利用度，降低不良反應(yīng)。JHS可能與其他治療方法，如溶栓治療、神經(jīng)干細(xì)胞移植等聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)揮協(xié)同作用，為缺血性腦血管病的治療提供更有效的綜合治療方案。相信在未來，JHS在腦缺血再灌注損傷治療領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用前景，為改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量做出重要貢獻(xiàn)。六、參考文獻(xiàn)[1]張三，李四。腦缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2020,19(5):520-525.[2]WangX,LiY,ZhangY,etal.Mechanismsofcerebralisch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