天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶化活性濃度參考ReferenceprocedureforthemeasurementofcatalyticactivityconcentrationofaspartateaminotransferaseWS/T617—WS/TWS/T617— 前 附錄A（資料性附錄）試劑詳細(xì)信息 附錄B（資料性附錄）測(cè)定酶儲(chǔ)存溶液中LD化活性濃 附錄C（資料性附錄）測(cè)定酶儲(chǔ)存溶液中MD化活性濃 附錄D（資料性附錄）不同溫度下溶液的pH 附錄E（資料性附錄）ASTIFCC37℃參考測(cè)量程序與30℃參考測(cè)量程序的比 WS/TWS/T617—ISO15193laboratoryanalytical注：analyticalanalyticalmatrix(ofamaterialreferencemeasurementprocedurereferenceproceduresensitivityofameasuringanalyticalanalyticalinfluencedetectionlimit；limitof2LODAST：天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AspartateGUM：測(cè)量不確定度表達(dá)指南（GuidetotheexpressionofUncertaintyinIFCC：國(guó)際臨床化學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(huì)（InternationalFederationofClinicalChemistryandLaboratoryMedicine）LD：乳酸脫氫酶(LactateDehydrogenase)MD：蘋(píng)果酸脫氫酶(MalateP-5-P：5′-磷酸吡哆醛（Pyridoxal-5-Phosphoricacid）QUAM：化學(xué)測(cè)量中不確定度的評(píng)定(QuantifyingUncertaintyInAnalyticalMeasurement)SOP：標(biāo)準(zhǔn)操作程序(StandardOperationProcedure)表1LαβI,牛血清白蛋白，F(xiàn)raction5P-5-（電導(dǎo)率＜2μS·cm-pH6～7，硅酸鹽﹤0.1mg·L-2試劑系統(tǒng)名 通用 CAS，CARN特定合格要求（如有類(lèi)似的高純度水（電導(dǎo)率＜2μS·cm-1，pH6～7，硅酸鹽＜0.1mg·L-1)。稱(chēng)量1.17gTris、4.02g天門(mén)冬氨酸（游離酸）、0.052g80mL4.2mL～4.4mL5.00mol·L-1——混合液的pH值應(yīng)比pH靶值低（約0.3pH～0.9372mol·L-1pH100mL8.00mmol·L-12℃～835mol·L-1代替2mol·L-1氫氧化鈉溶液可減少所需用量,精確調(diào)整pH值時(shí)需用2mol·L-1氫氧化鈉溶液。稱(chēng)量1.17gTris、0.052g280mL371mol·L-1pH100mLTris96.92mmol·L-18.00mmol·L-12℃～8℃3稱(chēng)量16.7mgP-5-P16.7mgP-5-P6mL210mL稱(chēng)量16.1mgNADH2.00mL2稱(chēng)量1.20g牛血清白蛋白、0.90g280mL100mL——用6.3.6中的酶試劑稀釋液稀釋LD儲(chǔ)存液,使LD化活性濃度在37℃時(shí)為3.78mkat·L-1（226.8Vdiluent=VLDSTOCK×(LDSTOCK- 示例1：見(jiàn)附錄BVdiluent=VMDSTOCK×(MDSTOCK-151.2)/151.2Vdiluent——稀釋MD儲(chǔ)存液所需酶試劑稀釋液體積，單位為毫升VMDSTOCK——MD儲(chǔ)存液體積，單位為毫升 示例2：見(jiàn)附錄C最終配制的溶液中LD化活性濃度在37℃時(shí)為1.89mkat·L-1(113.4kU·L-1)、MD化活性濃度在37℃時(shí)為1.26mkat·L-1 (75.6kU·L-1)。該溶液2℃～8℃穩(wěn)定性為2d。分別移取10.000mL溶液1、0.200mL溶液3、0.200mL溶液4、0.100mL溶液5，將上述溶液充分混勻，避光保存。此溶液在2℃～8℃穩(wěn)定性為1d。稱(chēng)量0.326gα6mL10mL37oCpHpHpHpHpH12pHDD.1D.2pHpH3pHIFCC波長(zhǎng)準(zhǔn)確度帶寬光徑pHpH37.0±0.15□電源□接地□電腦□打印機(jī)□是否24攪拌裝置：□清潔□轉(zhuǎn)速每日開(kāi)機(jī)性能檢查：□波長(zhǎng)正確 □波長(zhǎng)重復(fù) □帶寬測(cè) □噪音測(cè)分光光度計(jì)：□無(wú)明顯振動(dòng)□及時(shí)待機(jī)□無(wú)線電干擾輔助儀器：□更換進(jìn)、出水管67891011pH溫度探頭：□與pH電極：□與pH磁力攪拌器：□電源□接地□轉(zhuǎn)速pH標(biāo)準(zhǔn)溶液：更換電極內(nèi)液和電極外液進(jìn)行電極激活；采用pH12AST每 420700.5%。驗(yàn)室樣品若為凍干粉或干粉，應(yīng)使用質(zhì)量與雙蒸水類(lèi)似的高純度水（電導(dǎo)率＜2μS·cm-1，pH6～7，硅酸鹽＜0.1mg·L-1）溶解；若為冷凍液體如冰凍血清等，應(yīng)按SOP文件在嚴(yán)格控制的條件下融解。13AST339nm±1≤210.00mm±0.0130090180讀數(shù)（測(cè)量點(diǎn)mL2.0000.20037℃0.20090s180s

↓達(dá)↓達(dá)在比色杯內(nèi)加入2.000mL加入分析樣品0.200mL孵育300s加入啟動(dòng)試劑0.200mL↓等待90s↓180s圖1AST三羥甲基氨基甲烷80mmol·L-L240mmol·L-0.18mmol·L-P-5-0.1mmol·L-10μkat·L-1(600U·L-15μkat·L-1(900U·L-α12mmol·L-a擴(kuò)展不確定度（k=2）注1：試劑空白的反應(yīng)呈非線性動(dòng)力學(xué)，試劑空白吸光度的絕對(duì)變化值如大于0.002min-1采用9g?L-1（154mmol?L-1）氯化鈉溶液代替起始試劑溶液測(cè)量分析樣品空白率。按上述步驟進(jìn)行AST總化活性的1%，則警告有關(guān)物質(zhì)不適宜作校準(zhǔn)用。析樣品吸光度變化率。按式（3）計(jì)算AST化活性濃度：bAST＝F× F——系數(shù)，等于1905339nm，ε（NADH）=630·mol-1IFCCIRMM ——經(jīng)過(guò)試劑空白率校正后的分析樣品吸光度變化率，單位為每秒（s-1）酶化活性常用單位為kat·L-1，使用時(shí)常出現(xiàn)多位小數(shù)，目前常以μkat·L-1或nkat·L-1表示，C1VR1VR2VSA106

u u uu u u/

%u %u對(duì)值%u分子u分子/(VR1VR2VS)，分母項(xiàng)相對(duì)不確定度%u分母%u %u定度

DGKL的——方法線性的不確定度：方法線性引起的不確定度，可自行進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，也可引用DGKL表16 u u2 u222

k

本參考程序的測(cè)量結(jié)果的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度在濃度4.07μkat·L-1(244U·L-1)時(shí)宜小于2.0%。選擇2個(gè)濃度水平的質(zhì)控物質(zhì)，每天測(cè)量2次（2次間隔不少于2h），每次測(cè)量均做雙份，連續(xù)測(cè)量20d，按CLSIEP5-A3文件進(jìn)行評(píng)價(jià)。應(yīng)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室測(cè)量條件評(píng)估本參考程序的重復(fù)性、期間精密度。為檢測(cè)限。結(jié)合比對(duì)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)，本參考程序測(cè)量的檢出限為0.13μkat·L-1(7.8U·L-1)。參考CLSIEP6-A文件，設(shè)定實(shí)驗(yàn)室的重復(fù)性和線性的允許誤差范圍分別為1%和5%，選擇覆蓋IFCCμkat·L-1(247.7U·L-1)。pHpHASTCO2pH12pHWS/TWS/T617—

附錄表A.1特定合格要求(如有77-86-L56-84-α表A.1試劑原料詳細(xì)信息（續(xù)特定合格要求(如有V一水5P-5-WS/TWS/T617———10.000mL——0.200mL——0.200mL——0.100mL2℃～8℃穩(wěn)定性為1d——0.0990g（36.00mmol·L-1）6mL25mL36.00mmol·L-12℃～81dLD——將經(jīng)以上稀釋的0.050mL溶液加入到10.000mL酶試劑稀釋液中，充分混勻；第二表B.1LD三羥甲基氨基甲烷80mmol·L-L240mmol·L-0.18mmol·L-P-5-0.1mmol·L-3mmol·L-0.0833B.2LD339nm±1≤210.00mm±0.01303090讀數(shù)（測(cè)定點(diǎn)a擴(kuò)展不確定度（k=2）在比色杯中加入2.000mL反應(yīng)液，平衡到37℃。加入0.200mL按照B.1.2.3制備的LD溶試劑溶液，充分混勻，等待30s后，再連續(xù)監(jiān)測(cè)90s的吸光度。 F——系數(shù)，等于1905[339nm，ε339（NADH）=630·mol-1]；Fdilution——LD儲(chǔ)存液的稀釋因子，本例中為40401；附錄——10.000mL——0.200mL——0.200mL——0.100mL此溶液置2℃～8℃穩(wěn)定期為1d——0.0317g（4.8mmol·L-1）40mL50mL。此溶液置MD——取0.050mLMD貯存溶液至10.000mL——取經(jīng)以上稀釋的0.050mL溶液加至10.000mL酶試劑稀釋液中，并充分混勻；第二三羥甲基氨基甲烷80mmol·L-L240mmol·L-0.18mmol·L-P-5-0.1mmol·L-0.4mmol·L-0.833a擴(kuò)展不確定度（k=2）C.2MD339nm±1≤210.00mm±0.01303090讀數(shù)（測(cè)定點(diǎn)a擴(kuò)展不確定度（k=2）在比色杯中加入2.000mL反應(yīng)液，平衡到37℃。加入0.2000mL按照C.1.2.3制備的MD溶液充分混勻，孵育30s。孵育結(jié)束時(shí)，比色杯中溶液溫度應(yīng)達(dá)到37℃。再加入0.2000mL起始試劑溶液，充分混勻，等待30s后，再連續(xù)監(jiān)測(cè)90s的吸光度。采用9g·L-1（154mmol·L-1）NaCl溶液代替被稀釋的MD原液測(cè)定試劑空白，按上述方計(jì)算與AST化濃度的計(jì)算相同，此結(jié)果是稀釋后的最后溶液中的化MD濃度。按 （C. 1905339nmε339（NADH）=630·mol-1]；Fdilution——MD儲(chǔ)存液的稀釋因子，本例中為40401；附錄D.11pHD.22pHASTIFCC3730表E.1測(cè)量溫度分別為37℃和303730最適pH值為最適pH值為與溫度有關(guān)的最適pH值的變化和緩沖液的pKpH30060037300sAST90底物轉(zhuǎn)化速率的動(dòng)力學(xué)研究顯示延遲相時(shí)間達(dá)90180300MD和LD15μKat.L-1（900U.L-MD10μKat.L-1（600U.L-LD10