SHENGWUXUERT－PCR、反向PCR與PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)微專題15考情速覽熱點(diǎn)考情RT－RCR、實(shí)時(shí)熒光定量、PCR與反向PCR2022·全國乙卷，38；2022·江蘇卷，24；2020·江蘇卷，33；2020·山東卷，25PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)2023·遼寧卷，25；2021·天津卷，161目

錄RT－PCR與反向PCR2PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)熱點(diǎn)1

RT－PCR與反向PCR深研真題·領(lǐng)悟考法情境探疑·拓展應(yīng)用思維建?！び|類旁通解題覺醒·融會(huì)貫通(2024·黑吉遼卷，25)將天然Ti質(zhì)粒改造成含有Vir基因的輔助質(zhì)粒(輔助T－DNA轉(zhuǎn)移)和不含有Vir基因、含有T－DNA的穿梭質(zhì)粒，共同轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，可提高轉(zhuǎn)化效率。細(xì)菌和棉花對(duì)密碼子偏好不同，為提高翻譯效率，增強(qiáng)棉花抗病蟲害能力，進(jìn)行如下操作?；卮鹣铝袉栴}。注：F1～F3，R1～R3表示引物；T－DNA－LB表示左邊界；T－DNA－RB表示右邊界；Ori表示復(fù)制原點(diǎn)；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。(1)從蘇云金桿菌提取DNA時(shí)，需加入蛋白酶，其作用是___________________________________。提取過程中加入體積分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷酒精，其目的是___________________________________________________。水解蛋白質(zhì)，使得DNA與蛋白質(zhì)分離溶解蛋白質(zhì)等物質(zhì)，析出不溶于酒精的DNA(2)本操作中獲取目的基因的方法是_______________和_____________。(3)穿梭質(zhì)粒中p35s為啟動(dòng)子，其作用是_________________________________，驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄；插入兩個(gè)p35s啟動(dòng)子，其目的可能是_____________________________。PCR技術(shù)擴(kuò)增人工合成RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的部位提高目的基因的轉(zhuǎn)錄效率(4)根據(jù)圖中穿梭質(zhì)粒上的KanR和HygBR兩個(gè)標(biāo)記基因的位置，用________基因?qū)?yīng)的抗生素初步篩選轉(zhuǎn)化的棉花愈傷組織。(5)為檢測棉花植株是否導(dǎo)入目的基因，提取棉花植株染色體DNA作模板，進(jìn)行PCR，應(yīng)選用的引物是________和________。HygBRF3R2(6)本研究采用的部分生物技術(shù)屬于蛋白質(zhì)工程，理由是________(單選)。A.通過含有雙質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化棉花細(xì)胞B.將蘇云金桿菌Bt基因?qū)朊藁?xì)胞中表達(dá)C.將1～1362基因序列改變?yōu)槊藁?xì)胞偏好密碼子的基因序列D.用1～1362合成基因序列和1363～1848天然基因序列獲得改造的抗蟲蛋白D解析(1)從蘇云金桿菌提取DNA時(shí)，需加入蛋白酶，其作用是水解蛋白質(zhì)，使得DNA與蛋白質(zhì)分離。提取過程中加入體積分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷酒精，其目的是溶解蛋白質(zhì)等物質(zhì)，析出不溶于酒精的DNA。(2)本操作中獲取目的基因的方法是人工合成和PCR技術(shù)擴(kuò)增。(3)穿梭質(zhì)粒中p35s為啟動(dòng)子，其作用是RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄；插入兩個(gè)p35s啟動(dòng)子，其目的可能是提高目的基因的轉(zhuǎn)錄效率。(4)結(jié)合基因表達(dá)載體的示意圖，根據(jù)圖中穿梭質(zhì)粒上的KanR和HygBR兩個(gè)標(biāo)記基因的位置，用HygBR基因?qū)?yīng)的抗生素初步篩選轉(zhuǎn)化的棉花愈傷組織。(5)為檢測棉花植株是否導(dǎo)入目的基因，提取棉花植株染色體DNA作模板，進(jìn)行PCR，應(yīng)選用的引物是F3和R2。(6)D項(xiàng)所述內(nèi)容制造了新的蛋白質(zhì)，屬于蛋白質(zhì)工程。情境素材反向PCR是一種通過已知序列設(shè)計(jì)引物對(duì)未知序列進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)，其過程如下圖所示。(1)要擴(kuò)增未知序列，應(yīng)選擇哪兩種引物？提示引物1和引物4。(2)上述PCR產(chǎn)物是環(huán)狀DNA分子還是鏈狀DNA分子？提示鏈狀DNA分子。(3)上述PCR過程中使用了哪些酶？提示限制酶、DNA連接酶和耐高溫的DNA聚合酶。1.RT－PCR：即逆轉(zhuǎn)錄PCR，是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，在DNA聚合酶的作用下擴(kuò)增合成目的片段。命題要點(diǎn)提醒：由于RNA不穩(wěn)定，因此PCR不能直接擴(kuò)增RNA；需要先將RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。2.反向PCR：反向PCR是用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的未知序列的片段，而常規(guī)PCR擴(kuò)增的是已知序列的兩引物之間的DNA片段。(1)原理①酶切：選擇已知序列內(nèi)部沒有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切核酸酶對(duì)該段DNA進(jìn)行酶切；②連接：用DNA連接酶使靶序列環(huán)化連接；③擴(kuò)增：用一對(duì)反向的引物進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增產(chǎn)物將含有兩引物外的未知序列。(2)應(yīng)用通過反向PCR擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列，并可將僅知部分序列的全長cDNA進(jìn)行分子克隆，建立全長的DNA探針。命題要點(diǎn)提醒：①選擇限制酶時(shí)，要保證其在已知序列內(nèi)部沒有限制酶切割位點(diǎn)；②選擇引物時(shí)，要選擇反向引物對(duì)(相對(duì)于已知序列)；若選擇的是相向引物對(duì)，則擴(kuò)增的是已知序列。[例1]

(2025·江蘇鹽城檢測)常規(guī)PCR只能擴(kuò)增兩引物間的DNA區(qū)段，要擴(kuò)增已知DNA序列兩側(cè)的未知DNA序列，可用反向PCR技術(shù)。反向PCR技術(shù)擴(kuò)增的原理如圖所示。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)DA.酶切階段，L中不能含有酶切時(shí)所選限制酶的識(shí)別序列B.PCR技術(shù)的操作步驟依次是高溫變性、低溫復(fù)性、中溫延伸C.圖中引物應(yīng)選擇引物1和引物4，且二者間不能互補(bǔ)配對(duì)D.PCR擴(kuò)增時(shí)，每輪循環(huán)前應(yīng)加入限制酶將環(huán)狀DNA切割成線狀解析在酶切階段，已知序列L中不能含有酶切時(shí)所選限制酶的識(shí)別序列，不然會(huì)將已知序列L切斷，造成序列識(shí)別混亂，A正確；PCR技術(shù)的操作步驟依次是高溫使DNA變性、低溫復(fù)性(使DNA單鏈與引物結(jié)合)、中溫延伸，B正確；PCR過程需要兩種引物，能分別與目的基因兩條鏈的3′端通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，為保證延伸的是已知序列兩側(cè)的未知序列，應(yīng)該選擇引物1和引物4，且二者間不能互補(bǔ)配對(duì)，C正確；PCR的擴(kuò)增只需要第一次循環(huán)前加入足夠的限制酶，并不需要每輪都加入，D錯(cuò)誤。A.酶切階段，L中不能含有酶切時(shí)所選限制酶的識(shí)別序列B.PCR技術(shù)的操作步驟依次是高溫變性、低溫復(fù)性、中溫延伸C.圖中引物應(yīng)選擇引物1和引物4，且二者間不能互補(bǔ)配對(duì)D.PCR擴(kuò)增時(shí)，每輪循環(huán)前應(yīng)加入限制酶將環(huán)狀DNA切割成線狀[例2]

(2025·山東濱州高三模擬)某病毒的檢測可以采用實(shí)時(shí)熒光RT－PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的方法，RT－PCR的具體過程如圖。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(

)BA.過程①以mRNA為模板合成單鏈DNAB.過程②③擬對(duì)單鏈cDNA進(jìn)行第n次循環(huán)的擴(kuò)增，理論上需要n個(gè)引物BC.該技術(shù)用于對(duì)某些微量RNA病毒的檢測，可提高檢測的靈敏度D.游離的脫氧核苷酸只能從引物的3′端開始連接解析過程①是以mRNA形成單鏈DNA的過程，表示逆轉(zhuǎn)錄，A正確；過程②③擬對(duì)單鏈cDNA進(jìn)行第n次循環(huán)的擴(kuò)增，根據(jù)DNA分子半保留復(fù)制特點(diǎn)可知，該過程理論上至少需要2n－1個(gè)引物B，B錯(cuò)誤；利用實(shí)時(shí)熒光RT－PCR技術(shù)對(duì)某些微量RNA病毒進(jìn)行檢測時(shí)可提高檢測的靈敏度，是因?yàn)樵黾恿舜郎yRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的DNA的數(shù)量(或濃度)，便于檢測，C正確；游離的脫氧核苷酸只能從引物的3′端開始連接，D正確。A.過程①以mRNA為模板合成單鏈DNAB.過程②③擬對(duì)單鏈cDNA進(jìn)行第n次循環(huán)的擴(kuò)增，理論上需要n個(gè)引物BC.該技術(shù)用于對(duì)某些微量RNA病毒的檢測，可提高檢測的靈敏度D.游離的脫氧核苷酸只能從引物的3′端開始連接熱點(diǎn)2

PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)深研真題·領(lǐng)悟考法情境探疑·拓展應(yīng)用思維建模·觸類旁通解題覺醒·融會(huì)貫通(2024·新課標(biāo)卷，35)某研究小組將纖維素酶基因(N)插入某種細(xì)菌(B1)的基因組中，構(gòu)建高效降解纖維素的菌株(B2)。該小組在含有N基因的質(zhì)粒中插入B1基因組的M1與M2片段；再經(jīng)限制酶切割獲得含N基因的片段甲，片段甲兩端分別為M1與M2；利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)將片段甲插入B1的基因組，得到菌株B2。酶切位點(diǎn)(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的結(jié)合位置、片段甲替換區(qū)如下圖所示，→表示引物5′→3′方向?；卮鹣铝袉栴}。(1)限制酶切割的化學(xué)鍵是_______________。為保證N基因能在菌株B2中表達(dá)，在構(gòu)建片段甲時(shí)，應(yīng)將M1與M2片段分別插入質(zhì)粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位點(diǎn)之間，原因是___________________________________________________________________________。磷酸二酯鍵保證N基因啟動(dòng)子、N基因、N基因終止子的完整性，確保N基因能夠順利表達(dá)(2)CRISPR/Cas9技術(shù)可以切割細(xì)菌B1基因組中與向?qū)NA結(jié)合的DNA。向?qū)NA與B1基因組DNA互補(bǔ)配對(duì)可以形成的堿基對(duì)有G—C和____________________。(3)用引物P1和P2進(jìn)行PCR可驗(yàn)證片段甲插入了細(xì)菌B1基因組，所用的模板是____________________；若用該模板與引物P3和P4進(jìn)行PCR，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是____________。C—G、U—A、A—T菌株B2的基因組DNA無PCR產(chǎn)物(4)與秸稈焚燒相比，利用高效降解纖維素的細(xì)菌處理秸稈的優(yōu)點(diǎn)是_____________________________________________________________________(答出2點(diǎn)即可)。無空氣污染；更安全，無火災(zāi)隱患；分解效率更高，高效利用秸稈資源等解析(1)限制酶作用于DNA的磷酸二酯鍵。由題述可知，該過程是將重組質(zhì)粒特定位點(diǎn)，接入M1、M2，再利用限制酶切出新的片段甲替換區(qū)(M1＋啟動(dòng)子＋N基因＋終止子＋M2)，再接入B1基因組中，得到B2，因此在M1和M2之間，需要保證N基因完整性，同時(shí)需要保證N基因能夠正常表達(dá)，因此需要把M1接入啟動(dòng)子之前，M2接入終止子之后。(2)根據(jù)所給信息，向?qū)NA需要與對(duì)應(yīng)DNA進(jìn)行結(jié)合，結(jié)合期間，RNA的堿基會(huì)和DNA的堿基進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則配對(duì)方式包括G—C、C—G、U—A、A—T。(3)需要驗(yàn)證是否插入重組后的片段甲，因此所用模板為菌株B2的基因組DNA，如果有PCR產(chǎn)物說明菌株B2中含有N基因，如果沒有PCR產(chǎn)物說明菌株B2中不含N基因。因?yàn)槠渭妆惶鎿Q，因此在重組片段甲(M1＋啟動(dòng)子＋N基因＋終止子＋M2)中，沒有引物P4的結(jié)合位置，因此使用引物P3、P4進(jìn)行PCR時(shí)，無法獲得PCR產(chǎn)物。(4)秸稈焚燒嚴(yán)重污染環(huán)境，且有很大的火災(zāi)隱患，與此同時(shí)，焚燒對(duì)于有機(jī)物中的能量是極大的浪費(fèi)，可以從上述角度進(jìn)行論述。例如：無空氣污染；更安全，無火災(zāi)隱患；分解效率更高，高效利用秸稈資源等。情境素材一在基因工程實(shí)踐中，常用重疊延伸PCR技術(shù)。(1)操作中哪些引物應(yīng)含有擬突變位點(diǎn)？提示引物2和引物3。(2)進(jìn)行PCR1和PCR2時(shí)，應(yīng)分別選擇哪些引物？提示進(jìn)行PCR1時(shí)需選擇引物1和引物2，進(jìn)行PCR2時(shí)需選擇引物3和引物4。(3)為獲得大量目的基因序列，進(jìn)行PCR3時(shí)應(yīng)選擇哪兩種引物？提示引物1和引物4。情境素材二瑞典科學(xué)家斯萬特·帕博憑借對(duì)已滅絕古人類基因組和人類進(jìn)化的發(fā)現(xiàn)榮獲2022年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。他在研究過程中使用了大引物PCR構(gòu)建定點(diǎn)突變。基因定點(diǎn)突變的目的是通過定向改變基因內(nèi)一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)堿基來改變多肽鏈上一個(gè)或幾個(gè)氨基酸。大引物PCR定點(diǎn)突變常用來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的功能變化。單核苷酸的定點(diǎn)誘變僅需進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)即可獲得，第一輪加誘變引物和側(cè)翼引物，第一輪產(chǎn)物作為第二輪PCR擴(kuò)增的大引物，過程如圖所示。(1)第一輪PCR所用的引物有哪些？提示誘變引物和側(cè)翼引物。(2)第二輪PCR所用的引物除了側(cè)翼引物外，還有大引物。該大引物是第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的①鏈還是②鏈？提示②鏈。(3)與常規(guī)引物相比，大引物有何特點(diǎn)？提示大引物特異性高。1.利用引物中引入突變位點(diǎn)——在目的基因一端引入突變位點(diǎn)(1)兩個(gè)引物均從內(nèi)部擴(kuò)增，在某一引物引入突變位點(diǎn)提醒若兩個(gè)引物均從內(nèi)部擴(kuò)增，其中一個(gè)引物引入突變位點(diǎn)，則至少第3次擴(kuò)增后才可獲得雙鏈等長的DNA片段，第n輪擴(kuò)增后可獲得2n－2n個(gè)突變DNA。(2)一個(gè)引物從內(nèi)部擴(kuò)增，另一個(gè)引物從側(cè)翼擴(kuò)增，在某一引物引入突變位點(diǎn)提醒若一個(gè)引物從內(nèi)部擴(kuò)增，另一個(gè)引物從側(cè)翼擴(kuò)增，其中一個(gè)引物引入突變位點(diǎn)，則至少第2次擴(kuò)增可獲得雙鏈等長的DNA片段，第n輪擴(kuò)增后可獲得2n－(n＋1)個(gè)突變DNA。2.利用重疊延伸PCR技術(shù)引入突變位點(diǎn)——在目的基因內(nèi)部引入突變位點(diǎn)

重疊延伸PCR是發(fā)展最早的PCR定點(diǎn)突變技術(shù)。如下圖所示，該技術(shù)要使用四條引物。其中引物2和引物3的突起處代表與模板鏈不能互補(bǔ)的突變位點(diǎn)，而這兩條引物有部分堿基(包括突變位點(diǎn))是可以互補(bǔ)的。因此，分別利用引物1和引物2，引物3和引物4進(jìn)行PCR后，得到的DNA片段可以通過引物2和引物3互補(bǔ)的堿基雜交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成為一條完整的DNA片段。最后，用引物1和引物4進(jìn)行擴(kuò)增得到含有突變位點(diǎn)的DNA片段。通過測序可檢驗(yàn)定點(diǎn)突變是否成功。3.利用大引物PCR技術(shù)引入突變位點(diǎn)——在目的基因內(nèi)部引入突變位點(diǎn)

大引物PCR需要用引物進(jìn)行兩次PCR，其操作步驟如下：①根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物，得到兩個(gè)常規(guī)引物，分別為常規(guī)上游引物和常規(guī)下游引物；②根據(jù)突變堿基所處序列設(shè)計(jì)突變上游引物，突變位點(diǎn)位于突變引物序列的中間位置；③由突變上游引物與常規(guī)下游引物進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)得到下游大引物；④用得到的下游大引物和另一個(gè)常規(guī)上游引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得到突變目的基因序列。1.(2025·廣東佛山質(zhì)檢)PCR定點(diǎn)突變技術(shù)是一種基因工程技術(shù)，它可以通過人工合成的引物，使目標(biāo)DNA序列發(fā)生特定的突變，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的精確編輯。PCR定點(diǎn)突變技術(shù)的過程如圖所示(圖中對(duì)應(yīng)的字母為引物，黑點(diǎn)為定點(diǎn)誘變的位點(diǎn))。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)BA.獲得片段1所需要的引物為F和R_m，且2次循環(huán)即得片段1B.獲得片段2所需要的引物為R和F_m，且1次循環(huán)即得片段2C.圖中兩種引物F_m和R_m之間，能夠進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)D.圖中PCR擴(kuò)增所需要的引物F和R最好不配對(duì)解析根據(jù)圖示過程可知，獲得片段1所需要的引物為F和R_m，且2次循環(huán)即得片段1，A正確；獲得片段2所需要的引物為R和F_m，且2次循環(huán)即得片段2，B錯(cuò)誤；結(jié)合題圖分析，引物F_m和R_m之間，能夠進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，C正確；圖中PCR擴(kuò)增所需要的引物F和R最好不配對(duì)，以防引物發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，從而不能與模板結(jié)合，D正確。A.獲得片段1所需要的引物為F和R_m，且2次循環(huán)即得片段1B.獲得片段2所需要的引物為R和F_m，且1次循環(huán)即得片段2C.圖中兩種引物F_m和R_m之間，能夠進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)D.圖中PCR擴(kuò)增所需要的引物F和R最好不配對(duì)2.(2024·山東聊城高三模擬)α－環(huán)糊精是食品、醫(yī)藥等常用原料。α－環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(cgt)生產(chǎn)α－、β－和γ－環(huán)糊精的混合物，分離純化十分不便。cgt在芽孢桿菌中的產(chǎn)量較低，誘變效果不佳。cgt的372位天冬氨酸和89位酪氨酸是酶與底物作用的關(guān)鍵位點(diǎn)，江南大學(xué)一實(shí)驗(yàn)室將它們分別替換為賴氨酸和精氨酸后，形成的重組cgt催化特異性提高了27倍。圖1(1)蛋白質(zhì)工程的第一步通常是____________________。重疊PCR是常用的DNA定點(diǎn)突變技術(shù)，其原理如圖1所示。與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制相比，PCR不需要用到________酶。要完成兩處位點(diǎn)的突變，至少要設(shè)計(jì)________種引物。圖1確定預(yù)期的蛋白質(zhì)功能解旋6(2)如圖2是該酶編碼鏈的部分序列，請(qǐng)你設(shè)計(jì)替換372位天冬氨酸(密碼子：GAU、GAC)為賴氨酸(密碼子：AAA、AAG)的引物FP2和RP1：_________________________________________(只寫372位對(duì)應(yīng)的3個(gè)堿基)。FP2：5′－TAGACCGGCGATGGC________CCCAACAACCGG－3′RP1：5′－CCGGTTGTTGGG________GCCATCGCCGGTCTA－3′圖2AAA和