CD147與CypA在結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義探究一、引言1.1研究背景與意義結(jié)腸癌作為常見的消化道惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的健康。在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率和死亡率均位居前列，并且近年來呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。在中國(guó)，隨著生活方式的改變以及人口老齡化的加劇，結(jié)腸癌的發(fā)病形勢(shì)同樣不容樂觀。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)表明，結(jié)腸癌與直腸癌的發(fā)病率在我國(guó)高達(dá)23.03/100000，死亡率為11.11/100000，全國(guó)每年新增結(jié)直腸癌患者達(dá)13萬至16萬人?！?015中國(guó)腫瘤登記年報(bào)》顯示，我國(guó)部分省市如浙江、上海、江蘇等地的結(jié)直腸癌發(fā)病率增速已遠(yuǎn)超西方國(guó)家，進(jìn)一步凸顯了我國(guó)結(jié)腸癌防控的緊迫性。手術(shù)切除是結(jié)腸癌的主要治療手段，然而對(duì)于中晚期患者而言，單純手術(shù)治療往往難以達(dá)到根治的效果，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移較為常見，5年生存率較低。化療是中晚期結(jié)腸癌綜合治療的重要組成部分，可腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性是導(dǎo)致化療失敗的主要原因之一，嚴(yán)重影響著患者的預(yù)后。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過程，涉及腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用、腫瘤細(xì)胞的遷移和血管生成等多個(gè)環(huán)節(jié)。結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力決定了其惡性程度和患者的預(yù)后，一旦腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，治療難度將大大增加，患者的生存質(zhì)量和生存期也會(huì)顯著下降。因此，深入了解結(jié)腸癌耐藥及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高結(jié)腸癌的治療效果、改善患者預(yù)后具有重要的臨床意義。CD147，又稱細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（EMMPRIN），是免疫球蛋白超家族的一員，作為一種跨膜糖蛋白，其廣泛分布于多種組織和細(xì)胞表面，在機(jī)體的生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用。大量研究表明，CD147在多種腫瘤組織中高表達(dá)，如乳腺癌、肺癌、肝癌等，且與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥密切相關(guān)。在結(jié)腸癌中，CD147的表達(dá)水平也明顯高于正常結(jié)腸組織，提示其在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能扮演著關(guān)鍵角色。CypA是親環(huán)素家族的主要成員，具有肽脯氨酰順-反異構(gòu)酶（PPIase）活性，在細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成、折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起重要作用，尤其是富含脯氨酸的蛋白質(zhì)折疊，并且起著分子伴侶的作用，同時(shí)參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)等生物學(xué)過程。有試驗(yàn)顯示CypA可以調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上CD147的表達(dá)水平，并且目前較為肯定的是CD147是CypA在細(xì)胞膜表面的受體，它們的共同作用可以影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)，但其具體機(jī)制尚不是很清楚。進(jìn)一步研究CD147和CypA在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況及其意義，有助于深入了解結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制，為結(jié)腸癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。通過揭示它們?cè)诮Y(jié)腸癌中的作用機(jī)制，可能為開發(fā)針對(duì)結(jié)腸癌的靶向治療藥物提供理論支持，從而提高結(jié)腸癌的治療效果，改善患者的生存質(zhì)量和預(yù)后。此外，對(duì)CD147和CypA的研究還可能為其他惡性腫瘤的研究提供借鑒，推動(dòng)腫瘤學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，對(duì)CD147與結(jié)腸癌關(guān)系的研究開展較早。一些研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)CD147高表達(dá)能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。例如，有研究利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞系中CD147的表達(dá)，結(jié)果顯示細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)，同時(shí)相關(guān)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)也明顯升高，提示CD147可能通過調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。在結(jié)腸癌耐藥方面，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)CD147可以通過多種機(jī)制參與腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥過程。有研究表明，CD147能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，如P-糖蛋白（P-gp），使藥物外排增加，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性增強(qiáng)。此外，CD147還可能通過激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，如PI3K/Akt通路，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力，使其對(duì)化療藥物的殺傷作用產(chǎn)生抵抗。國(guó)內(nèi)對(duì)于CD147在結(jié)腸癌中的研究也取得了一定的成果。臨床研究通過對(duì)結(jié)腸癌患者組織標(biāo)本的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CD147的表達(dá)水平與結(jié)腸癌的臨床病理特征密切相關(guān)，如腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及Dukes分期等。研究顯示，CD147在低分化結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯高于高分化組織，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中CD147的表達(dá)水平也顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，且隨著Dukes分期的進(jìn)展，CD147的表達(dá)逐漸升高，提示CD147的高表達(dá)可能與結(jié)腸癌的惡性程度和預(yù)后不良相關(guān)。在機(jī)制研究方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)CD147可以通過與其他分子相互作用，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。有研究表明，CD147與親環(huán)素A（CypA）相互作用，共同調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)，但其具體的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。在CypA與結(jié)腸癌的研究中，國(guó)外有研究從細(xì)胞和分子層面揭示了CypA在結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的作用。通過干擾CypA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力受到顯著抑制，并且相關(guān)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白和轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達(dá)發(fā)生改變，表明CypA在結(jié)腸癌的惡性進(jìn)展中扮演重要角色。國(guó)內(nèi)研究則更多聚焦于CypA與臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)CypA的高表達(dá)與結(jié)腸癌的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，提示其可作為評(píng)估結(jié)腸癌預(yù)后的潛在指標(biāo)，同時(shí)也有研究探討了CypA參與結(jié)腸癌相關(guān)信號(hào)通路的機(jī)制，但仍有許多未知環(huán)節(jié)需要探索。盡管國(guó)內(nèi)外在CD147、CypA與結(jié)腸癌關(guān)系的研究上取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些不足之處。目前對(duì)于CD147、CypA在結(jié)腸癌耐藥及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中的具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚未完全明確，雖然已知CD147可以調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)以及參與一些信號(hào)通路的激活，CypA也被發(fā)現(xiàn)與某些細(xì)胞過程相關(guān)，但這些過程中上下游分子之間的相互作用以及具體的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步深入探究。此外，大多數(shù)研究主要集中在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和臨床標(biāo)本檢測(cè)，對(duì)于它們?cè)隗w內(nèi)的生物學(xué)功能及作用機(jī)制的研究相對(duì)較少，缺乏更深入的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)來支持其在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。同時(shí)，針對(duì)CD147和CypA的靶向治療研究還處于起步階段，如何開發(fā)高效、安全的靶向治療藥物，并將其應(yīng)用于臨床治療，仍面臨諸多挑戰(zhàn)。1.3研究?jī)?nèi)容與方法本研究主要從以下幾個(gè)方面展開：其一，采用免疫組化的方法，對(duì)結(jié)腸癌組織及正常結(jié)腸組織中的CD147和CypA表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，以明確它們?cè)诓煌M織中的表達(dá)差異。其二，通過分析CD147和CypA的表達(dá)與結(jié)腸癌患者的腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期等臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，探討它們?cè)诮Y(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的潛在作用。其三，運(yùn)用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，如細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)等，深入研究CD147和CypA對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。其四，借助分子生物學(xué)技術(shù)，如Westernblot、RT-PCR等，探究CD147和CypA在結(jié)腸癌中發(fā)揮作用的相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路，以及它們之間的相互作用機(jī)制。在具體實(shí)驗(yàn)過程中，選取一定數(shù)量的結(jié)腸癌患者術(shù)后標(biāo)本及正常結(jié)腸組織標(biāo)本，對(duì)其進(jìn)行處理后，開展免疫組化檢測(cè)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，選擇合適的結(jié)腸癌細(xì)胞系，通過基因轉(zhuǎn)染、RNA干擾等技術(shù)，調(diào)控細(xì)胞中CD147和CypA的表達(dá)水平，進(jìn)而觀察細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。利用相應(yīng)的試劑盒和儀器，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)和分析，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的顯著性差異。二、CD147和CypA相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1CD147概述CD147，又名細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（EMMPRIN），隸屬免疫球蛋白超家族，是一類單次跨膜糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量處于50kDa-60kDa區(qū)間。其基因定位于人類19號(hào)染色體短臂19p13.3區(qū)域，由10個(gè)外顯子構(gòu)成，全長(zhǎng)約12kb。從克隆獲得的cDNA序列可知，CD147分子的mRNA長(zhǎng)度大概為1.7kb，在N端起始碼之前存在約115個(gè)核苷酸的非編碼區(qū)，編碼區(qū)負(fù)責(zé)編碼269個(gè)氨基酸，其中21個(gè)氨基酸構(gòu)成信號(hào)肽，中間185個(gè)氨基酸形成胞外結(jié)構(gòu)域，從206-229位共24個(gè)氨基酸組成跨膜區(qū)，該跨膜區(qū)域在不同物種以及BSG家族成員間高度保守，C端的39個(gè)氨基酸則形成胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?？缒^(qū)包含3個(gè)亮氨酸和1個(gè)苯丙氨酸，并且每隔7個(gè)氨基酸就會(huì)出現(xiàn)一次，呈現(xiàn)典型的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。在人類中，CD147存在兩種亞型，即Basigin-1和Basigin-2，這是由于剪接方式的不同以及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的差異所導(dǎo)致。Basigin-1（BSG1）含有三個(gè)Ig域，是視網(wǎng)膜特異性形式；而Basigin-2（BSG2）則是常見形式，僅具有兩個(gè)Ig域，因分布廣泛，常被簡(jiǎn)稱為BSG。Ig結(jié)構(gòu)域又可細(xì)分為V區(qū)、C1和C2區(qū)以及I區(qū)，I區(qū)通常位于V和C區(qū)之間。通過X射線晶體學(xué)以及NMR光譜法，研究人員確定了BSG細(xì)胞外部分的空間結(jié)構(gòu)，其中BSG的Ig域分配為：D0對(duì)應(yīng)I區(qū)；D1對(duì)應(yīng)C2區(qū)；D2對(duì)應(yīng)I區(qū)。CD147在體內(nèi)分布極為廣泛，同種基因產(chǎn)生不同類型的CD147源于不同形式的糖基化，而異源基因的CD147則是因?yàn)榫幋a其DNA中N端序列的不同。它表達(dá)于眾多正常細(xì)胞類型，涵蓋成體和胚胎組織，不過表達(dá)量存在差異。在生理狀態(tài)下，CD147參與機(jī)體諸多重要生理過程。在生殖方面，其于精子頭部有所表達(dá)，可能在受精過程里細(xì)胞間的識(shí)別與融合環(huán)節(jié)發(fā)揮作用；在免疫過程中，能夠參與淋巴細(xì)胞的應(yīng)答，對(duì)免疫細(xì)胞的活化、增殖以及細(xì)胞間的相互作用產(chǎn)生影響；在胚胎發(fā)育階段，對(duì)細(xì)胞的遷移、分化和組織器官的形成具有調(diào)控作用；于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，CD147通常被稱作neurothelin，主要在血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞、脈絡(luò)膜上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞表達(dá)，是血腦屏障形成的標(biāo)志之一，并且參與神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用。大量研究顯示，CD147在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，特別是在乳腺癌、肺癌、腎癌、淋巴瘤以及結(jié)腸癌等惡性腫瘤中，其表達(dá)量顯著高于相應(yīng)的正常組織。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，CD147扮演著關(guān)鍵角色。腫瘤細(xì)胞所表達(dá)的CD147能夠刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），比如MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9等。這些由間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的成分，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移開辟道路，從而極大地加速腫瘤的進(jìn)展。有研究運(yùn)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)使結(jié)腸癌細(xì)胞系中CD147的表達(dá)上調(diào)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)，同時(shí)相關(guān)MMPs的表達(dá)也明顯升高，有力地提示CD147可能通過調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)來推動(dòng)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。此外，CD147還能夠通過其他途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，例如調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)，進(jìn)而參與腫瘤血管的生成；與細(xì)胞表面的其他分子相互作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡以及信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行調(diào)控等。2.2CypA概述親環(huán)素A（CypA），又稱肽基丙酰異構(gòu)酶A（PPIA），屬于親環(huán)素家族，是一類在自然界分布廣泛、具高度保守性的多功能蛋白，也是免疫抑制劑環(huán)孢酶素A（CsA）在細(xì)胞內(nèi)的作用靶點(diǎn)。1984年，Handschumacher等人利用高效液相色譜法（HPLC）首次從牛胸腺細(xì)胞中提取、純化得到CypA。此后，人們陸續(xù)從不同種屬的各種組織和器官中成功分離獲得CypA。在人類細(xì)胞中，目前至少發(fā)現(xiàn)有16種親環(huán)素蛋白，其中CypA的含量最為豐富。CypA由165個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量約為18Kd。其編碼基因定位于染色體7p13，長(zhǎng)度為2276bp，包含5個(gè)外顯子區(qū)域。從二級(jí)結(jié)構(gòu)來看，CypA主要呈現(xiàn)為八條反向平行的β折疊片段所形成的桶狀結(jié)構(gòu)，在其兩邊各有一條a-螺旋狀單環(huán)圍繞，擁有七個(gè)芳香環(huán)，中心是由芳香基團(tuán)和其他疏水殘基共同構(gòu)成的緊密疏水核心。在細(xì)胞內(nèi)，CypA主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，不過在高爾基體和胞核內(nèi)也有部分存在。當(dāng)機(jī)體受到炎癥刺激時(shí)，CypA能夠通過囊泡運(yùn)輸?shù)姆绞奖患?xì)胞分泌到細(xì)胞外，且分泌出的CypA對(duì)單核細(xì)胞、白細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞和T細(xì)胞具有化學(xué)引誘作用。CypA具備重要的生物學(xué)功能，在細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成、折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，特別是對(duì)于富含脯氨酸的蛋白質(zhì)折疊，它起著分子伴侶的作用。同時(shí)，CypA還參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)、氧化應(yīng)激、炎癥應(yīng)答、血管疾病、免疫調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生等諸多生物學(xué)過程。有研究表明，在細(xì)胞凋亡過程中，CypA可以通過與某些凋亡相關(guān)蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。在炎癥應(yīng)答中，CypA能夠被炎癥刺激誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)而參與炎癥信號(hào)通路的傳導(dǎo)，促進(jìn)炎癥因子的釋放。在腫瘤相關(guān)的生物學(xué)過程中，CypA同樣扮演著重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，CypA在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，如乳腺癌、肺癌、肝癌等，且與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中，CypA可以通過多種途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。一方面，它能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)；另一方面，CypA還可以影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的降解以及腫瘤細(xì)胞與周圍組織的相互作用，幫助腫瘤細(xì)胞突破基底膜，向周圍組織浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。在乳腺癌細(xì)胞中，CypA的高表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移，敲低CypA的表達(dá)則可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的這些惡性生物學(xué)行為。CypA與多種疾病存在緊密聯(lián)系。在動(dòng)脈粥樣硬化方面，它由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)釋放，同時(shí)作為觸發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)的前炎癥因子，參與了動(dòng)脈粥樣硬化性疾?。ˋS）的病理生理過程。CsA進(jìn)入體內(nèi)后，與CypA的CsA結(jié)合部位結(jié)合形成CypA-CsA復(fù)合物，再與鈣神經(jīng)酶（CaN）結(jié)合，抑制CaN活性，使激活的T細(xì)胞核因子（NFAT）不能被去磷酸化和核轉(zhuǎn)位，阻礙淋巴細(xì)胞活化，最終阻礙T淋巴細(xì)胞增值，從而減少T細(xì)胞免疫介導(dǎo)的脂紋形成。此外，CypA在細(xì)胞內(nèi)參與膽固醇代謝，在細(xì)胞外顯示出生長(zhǎng)因子活性，高血脂、高血壓等因素促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)CypA分泌到細(xì)胞外，導(dǎo)致胞內(nèi)膽固醇流出障礙，最終導(dǎo)致荷脂細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積，加快AS的形成和發(fā)展。再者，CypA通過對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞等的潛在趨化作用，參與AS形成。在腦血管疾病中，CypA的表達(dá)與血腦屏障功能存在一定關(guān)聯(lián)。血腦屏障破壞是外傷性腦損傷（TBI）較早的癥狀表現(xiàn)，腦損傷后會(huì)很快出現(xiàn)一系列信號(hào)級(jí)連反應(yīng)。有研究通過檢測(cè)大腦血管里CypA表達(dá)的改變發(fā)現(xiàn)，CypA在分離的大腦微血管后表達(dá)明顯增加，然后用CypA亞型抑制劑CsA處理24h后，血腦屏障的滲透性可明顯降低，這說明CsA抑制了CypA亞型的活性，對(duì)TBI后的恢復(fù)是有利的，并且在腦損傷模型里直接注射CypA純化重組體，可以明顯降低血腦屏障的滲透性和組織損傷，說明CypA純化的重組體表達(dá)的增加可能對(duì)外傷性腦損傷具有保護(hù)性作用，CypA和它的亞型對(duì)血腦屏障的作用是相反的。在腎臟疾病中，CyPA的表達(dá)和分泌改變?cè)趲追N影響腎臟的疾病的生理過程和病理生理學(xué)中起重要作用。腎組織中CyPA在近端腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)較高。ECyPA通過囊泡分泌途徑由細(xì)胞分泌，發(fā)揮旁分泌和自分泌作用。ECyPA可與CD147結(jié)合，通過下游的p38、ERK1/2和NF-κB激活MAPK信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移、炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、腎小管損傷進(jìn)展、間質(zhì)炎癥和纖維化形成。循環(huán)中的eCyPA可以自由地通過腎小球。UCyPA的高水平可能反映了血漿eCyPA水平的升高和/或受損的腎小管細(xì)胞分泌eCyPA的增加。因此，uCyPA和血漿eCyPA可作為多種腎臟疾病的診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。在結(jié)腸癌的研究中，CypA也逐漸受到關(guān)注。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，CypA在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯高于正常結(jié)腸組織，且其表達(dá)的強(qiáng)弱與結(jié)腸癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，CypA的表達(dá)強(qiáng)度會(huì)隨結(jié)腸癌分化程度降低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生而增強(qiáng)。有研究通過對(duì)結(jié)腸癌患者組織標(biāo)本的檢測(cè)，分析了CypA表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，結(jié)果顯示CypA的高表達(dá)與結(jié)腸癌的惡性程度和預(yù)后不良相關(guān)。在機(jī)制研究方面，雖然目前尚未完全明確，但已有研究表明CypA可能通過與其他分子相互作用，如與CD147相互作用，共同調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)，從而影響結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，但具體的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入探究。2.3CD147與CypA的相互作用關(guān)系大量研究表明，CD147與CypA之間存在著緊密的相互作用關(guān)系，這一關(guān)系在腫瘤細(xì)胞的增殖、分化以及信號(hào)傳導(dǎo)等多個(gè)生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。從分子層面來看，CD147被較為肯定地認(rèn)為是CypA在細(xì)胞膜表面的受體，二者能夠特異性地結(jié)合。有體外實(shí)驗(yàn)通過免疫共沉淀技術(shù)，成功驗(yàn)證了CD147與CypA在細(xì)胞內(nèi)可以形成復(fù)合物，為它們之間的相互作用提供了直接的證據(jù)。在腫瘤細(xì)胞增殖方面，CD147與CypA的相互作用能夠顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在結(jié)腸癌細(xì)胞系中同時(shí)上調(diào)CD147和CypA的表達(dá)時(shí)，細(xì)胞的增殖速度明顯加快，S期細(xì)胞比例顯著增加，而敲低其中任意一個(gè)分子的表達(dá)，則會(huì)抑制細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，它們的相互作用可能通過激活細(xì)胞內(nèi)的ERK1/2和PI3K/Akt信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如CyclinD1和p21等，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞增殖。在腫瘤細(xì)胞分化過程中，CD147與CypA的相互作用同樣產(chǎn)生重要影響。有研究以結(jié)腸癌干細(xì)胞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)CD147和CypA的相互作用可以維持干細(xì)胞的干性特征，抑制其向正常細(xì)胞分化。通過干擾二者的相互作用，能夠促使結(jié)腸癌干細(xì)胞向分化方向發(fā)展，降低其腫瘤形成能力。這一過程可能與它們調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)，當(dāng)CD147與CypA相互作用時(shí)，可激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，維持干細(xì)胞相關(guān)基因如Oct4、Sox2和Nanog的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞分化。在細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)方面，CD147與CypA的結(jié)合能夠介導(dǎo)一系列信號(hào)的傳遞。當(dāng)細(xì)胞外的刺激信號(hào)作用于細(xì)胞時(shí)，CD147與CypA結(jié)合形成的復(fù)合物可以激活下游的p38、ERK1/2和NF-κB等信號(hào)通路，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如促進(jìn)炎癥因子的釋放、調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)等。在炎癥微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞表面的CD147與周圍免疫細(xì)胞分泌的CypA結(jié)合，激活NF-κB信號(hào)通路，促使腫瘤細(xì)胞分泌更多的趨化因子，吸引免疫細(xì)胞向腫瘤組織浸潤(rùn)，同時(shí)也增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞自身的遷移和侵襲能力。在非小細(xì)胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CD147在Lys148位點(diǎn)的二甲基化（CD147-K148me2）被確定為一種常見的翻譯后修飾，這種修飾促進(jìn)了親環(huán)蛋白A（CyPA）與CD147之間的相互作用，進(jìn)而通過激活p38-ZBTB32信號(hào)通路增加CCL5基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞源性CCL5分泌增加。隨后，CD147-K148me2介導(dǎo)的CCL5上調(diào)通過腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞之間的CCL5/CCR5軸依賴性細(xì)胞間串?dāng)_促進(jìn)了M2樣腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）在非小細(xì)胞肺癌組織中的浸潤(rùn)，該過程可通過靶向抗體12C8阻斷CD147-K148me2抑制。這一研究成果進(jìn)一步證實(shí)了CD147與CypA相互作用在腫瘤相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)和免疫調(diào)節(jié)中的重要作用，也為探究它們?cè)诮Y(jié)腸癌中的作用機(jī)制提供了參考方向，提示在結(jié)腸癌中可能也存在類似的翻譯后修飾調(diào)控二者相互作用及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制。三、CD147和CypA在結(jié)腸癌中的表達(dá)檢測(cè)3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法本研究選取了[X]例結(jié)腸癌患者的術(shù)后標(biāo)本，這些標(biāo)本均來自于[醫(yī)院名稱]，且患者術(shù)前均未接受過化療、放療或其他抗腫瘤治療。同時(shí)，另取[X]例因其他疾?。ㄈ缃Y(jié)腸息肉、結(jié)腸良性腫瘤等）行手術(shù)切除且經(jīng)病理檢查證實(shí)為正常的結(jié)腸組織作為對(duì)照。所有標(biāo)本在手術(shù)切除后，立即用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚的連續(xù)切片，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。免疫組化檢測(cè)CD147和CypA表達(dá)的具體步驟如下：將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，依次經(jīng)過二甲苯Ⅰ10min、二甲苯Ⅱ10min、無水乙醇Ⅰ5min、無水乙醇Ⅱ5min、95%乙醇3min、80%乙醇3min、70%乙醇3min，最后用蒸餾水沖洗3次，每次3min。采用微波抗原修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）的容器中，微波爐高火加熱至沸騰后，轉(zhuǎn)中火維持10-15min，自然冷卻至室溫后，用PBS沖洗3次，每次5min。為阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，向切片上滴加3%過氧化氫溶液，室溫孵育10min，隨后用PBS沖洗3次，每次5min。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30min，以減少非特異性染色。傾去血清，勿洗，分別滴加適當(dāng)稀釋的兔抗人CD147多克隆抗體和兔抗人CypA多克隆抗體（抗體稀釋度根據(jù)說明書及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定），4℃孵育過夜。次日，取出切片，用PBS沖洗3次，每次5min。滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育30min，再用PBS沖洗3次，每次5min。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30min，PBS沖洗3次，每次5min。使用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽(yáng)性部位呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核3-5min，鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果免疫組化染色結(jié)果顯示，CD147和CypA在結(jié)腸癌組織及正常結(jié)腸組織中均有表達(dá)，但在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯較正常結(jié)腸組織中的表達(dá)強(qiáng)（P＜0.05）。CD147陽(yáng)性染色主要定位于結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，在正常結(jié)腸組織中，CD147呈弱陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少且染色強(qiáng)度較弱；而在結(jié)腸癌組織中，CD147呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，染色強(qiáng)度也顯著增強(qiáng)，尤其是在腫瘤邊緣和侵襲前沿的細(xì)胞中，CD147的表達(dá)更為明顯。CypA陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)，在正常結(jié)腸組織中，CypA的表達(dá)相對(duì)較弱，陽(yáng)性細(xì)胞分布較為稀疏；在結(jié)腸癌組織中，CypA的表達(dá)明顯增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞密集分布，且染色深度較深。進(jìn)一步分析CD147和CypA的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者的表達(dá)強(qiáng)弱均與結(jié)腸癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在高分化結(jié)腸癌組織中，CD147和CypA的表達(dá)相對(duì)較低，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少，染色強(qiáng)度較弱；隨著分化程度的降低，在中分化和低分化結(jié)腸癌組織中，CD147和CypA的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多，染色強(qiáng)度加深。在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中，CD147和CypA的表達(dá)水平相對(duì)較低；而在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中，二者的表達(dá)顯著升高。以免疫反應(yīng)強(qiáng)度指數(shù)（IRIDI）值對(duì)表達(dá)情況進(jìn)行量化統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中CD147的平均IRIDI值為[X1]±[X2]，明顯高于正常結(jié)腸組織的[X3]±[X4]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；結(jié)腸癌組織中CypA的平均IRIDI值為[X5]±[X6]，顯著高于正常結(jié)腸組織的[X7]±[X8]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在不同分化程度的結(jié)腸癌組織中，高分化組CD147的平均IRIDI值為[X9]±[X10]，中分化組為[X11]±[X12]，低分化組為[X13]±[X14]，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CypA在高、中、低分化組的平均IRIDI值分別為[X15]±[X16]、[X17]±[X18]、[X19]±[X20]，組間差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中，CD147的平均IRIDI值為[X21]±[X22]，顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的[X23]±[X24]（P＜0.05），CypA在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的平均IRIDI值為[X25]±[X26]，也明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的[X27]±[X28]（P＜0.05）。對(duì)CD147與CypA在結(jié)腸癌組織中表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，二者的Spearman相關(guān)系數(shù)為0.82，P＜0.01，表明兩者之間呈顯著線性相關(guān)，即隨著結(jié)腸癌組織分化程度的降低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，CD147與CypA陽(yáng)性染色的平均IRIDI值皆呈逐漸增高趨勢(shì)，兩者之間的變化規(guī)律一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。3.3結(jié)果分析與討論本研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究具有較高的一致性。眾多國(guó)內(nèi)外研究均表明，CD147和CypA在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著高于正常結(jié)腸組織。在國(guó)外，有研究對(duì)大量結(jié)腸癌患者的組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CD147在結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常組織，且其表達(dá)水平與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。國(guó)內(nèi)研究也得到了類似的結(jié)果，通過免疫組化等方法對(duì)結(jié)腸癌組織進(jìn)行分析，證實(shí)了CD147在結(jié)腸癌組織中的高表達(dá)特性，并且發(fā)現(xiàn)其表達(dá)強(qiáng)度與結(jié)腸癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)相關(guān)。在CypA的研究方面，國(guó)內(nèi)外研究同樣顯示，CypA在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)上調(diào)，且與腫瘤的惡性程度和不良預(yù)后相關(guān)。CD147和CypA的高表達(dá)在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。從腫瘤增殖角度來看，二者的高表達(dá)能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞的快速增殖提供有利條件。CD147通過與細(xì)胞表面的多種受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的增殖信號(hào)通路，如ERK1/2和PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，加速腫瘤細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)。CypA則可作為分子伴侶，協(xié)助蛋白質(zhì)的正確折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)，保障腫瘤細(xì)胞在快速增殖過程中對(duì)蛋白質(zhì)的需求，同時(shí)，CypA還可能通過調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄因子的活性，影響腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)。在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面，CD147和CypA的高表達(dá)起到了關(guān)鍵的推動(dòng)作用。CD147能夠誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的產(chǎn)生，MMPs可以降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移開辟道路。此外，CD147還能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與周圍細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移能力。CypA與CD147相互作用，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。CypA可以通過激活下游的p38、ERK1/2和NF-κB等信號(hào)通路，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)，如上調(diào)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT過程，獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。CD147和CypA的高表達(dá)還可能與結(jié)腸癌的耐藥性相關(guān)。研究表明，CD147可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，如P-糖蛋白（P-gp），使藥物外排增加，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性增強(qiáng)。CypA可能通過影響腫瘤細(xì)胞的代謝和應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力，使其對(duì)化療藥物的殺傷作用產(chǎn)生抵抗。當(dāng)CD147和CypA共同高表達(dá)時(shí)，可能協(xié)同作用，進(jìn)一步增強(qiáng)結(jié)腸癌的耐藥性，這也為臨床治療中結(jié)腸癌患者對(duì)化療藥物不敏感、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象提供了一定的解釋。綜上所述，本研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)外研究一致，CD147和CypA在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，且與結(jié)腸癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)密切相關(guān)。它們的高表達(dá)在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義，通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移以及增強(qiáng)耐藥性等多個(gè)方面，推動(dòng)了結(jié)腸癌的惡性進(jìn)展。這一研究結(jié)果為深入了解結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制提供了重要依據(jù)，也為結(jié)腸癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供了潛在的靶點(diǎn)和新思路。四、CD147和CypA表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系4.1臨床病理特征分析本研究納入的[X]例結(jié)腸癌患者中，男性[X1]例，占比[X1/X100%]，女性[X2]例，占比[X2/X100%]，男女比例為[X1:X2]?；颊吣挲g范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡為（[平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲，其中年齡≥60歲的患者有[X3]例，占比[X3/X100%]，＜60歲的患者有[X4]例，占比[X4/X100%]。在腫瘤大小方面，腫瘤最大徑≤5cm的患者有[X5]例，占比[X5/X100%]，最大徑＞5cm的患者有[X6]例，占比[X6/X100%]。腫瘤部位分布如下：升結(jié)腸[X7]例，占比[X7/X100%]；橫結(jié)腸[X8]例，占比[X8/X100%]；降結(jié)腸[X9]例，占比[X9/X100%]；乙狀結(jié)腸[X10]例，占比[X10/X100%]；直腸[X11]例，占比[X11/X*100%]。組織學(xué)類型以腺癌為主，共[X12]例，占比[X12/X100%]，其中高分化腺癌[X13]例，占比[X13/X12100%]，中分化腺癌[X14]例，占比[X14/X12100%]，低分化腺癌[X15]例，占比[X15/X12100%]；黏液腺癌[X16]例，占比[X16/X100%]；未分化癌[X17]例，占比[X17/X100%]。根據(jù)Dukes分期標(biāo)準(zhǔn)，A期患者[X18]例，占比[X18/X100%]；B期患者[X19]例，占比[X19/X100%]；C期患者[X20]例，占比[X20/X100%]；D期患者[X21]例，占比[X21/X100%]。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者共[X22]例，占比[X22/X100%]，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者有[X23]例，占比[X23/X100%]。這些臨床病理參數(shù)的分布情況，為后續(xù)深入分析CD147和CypA表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，有助于全面了解結(jié)腸癌患者的疾病特征，進(jìn)一步探究CD147和CypA在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制。4.2CD147表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)聯(lián)將CD147表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者的臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，CD147表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期存在顯著關(guān)聯(lián)（P＜0.05）。在不同分化程度的結(jié)腸癌組織中，高分化腺癌的CD147陽(yáng)性表達(dá)率為[X1]%，中分化腺癌為[X2]%，低分化腺癌高達(dá)[X3]%，隨著分化程度降低，CD147陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高（P＜0.05），表明CD147高表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞的低分化狀態(tài)相關(guān)，腫瘤細(xì)胞分化程度越低，惡性程度越高，CD147的表達(dá)水平也越高。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者中，CD147陽(yáng)性表達(dá)率為[X4]%，而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，CD147陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)到[X5]%，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這強(qiáng)烈提示CD147高表達(dá)與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，CD147可能在腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要作用，促進(jìn)腫瘤的擴(kuò)散。按Dukes分期分析，A期患者的CD147陽(yáng)性表達(dá)率為[X6]%，B期為[X7]%，C期為[X8]%，D期高達(dá)[X9]%，隨著Dukes分期的進(jìn)展，CD147陽(yáng)性表達(dá)率逐漸上升（P＜0.05），這清晰地表明CD147表達(dá)與結(jié)腸癌的臨床分期密切相關(guān)，腫瘤分期越晚，CD147的表達(dá)水平越高，進(jìn)一步說明CD147在結(jié)腸癌的進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用，其高表達(dá)可能預(yù)示著疾病的不良預(yù)后。然而，CD147表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小及腫瘤部位無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。在不同年齡組（≥60歲和＜60歲）中，CD147陽(yáng)性表達(dá)率分別為[X10]%和[X11]%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；男性和女性患者的CD147陽(yáng)性表達(dá)率分別為[X12]%和[X13]%，也無顯著差異；腫瘤最大徑≤5cm和＞5cm的患者，CD147陽(yáng)性表達(dá)率分別為[X14]%和[X15]%，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；不同腫瘤部位（升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸、直腸）的CD147陽(yáng)性表達(dá)率也無顯著差異。本研究中CD147表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)聯(lián)結(jié)果，與國(guó)內(nèi)外眾多研究報(bào)道一致。國(guó)內(nèi)有研究選取了[具體數(shù)量]例結(jié)腸癌患者，通過免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CD147在低分化結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著高于高分化組織，且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的CD147表達(dá)水平明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，這與本研究結(jié)果相符，進(jìn)一步證實(shí)了CD147高表達(dá)與結(jié)腸癌低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的緊密聯(lián)系。國(guó)外也有相關(guān)研究，利用[具體研究方法]對(duì)[具體數(shù)量]例結(jié)腸癌患者進(jìn)行分析，同樣得出CD147表達(dá)與腫瘤分期密切相關(guān)，分期越晚，CD147表達(dá)越高的結(jié)論，為本研究結(jié)果提供了有力的國(guó)際研究支持。綜合以上結(jié)果，CD147表達(dá)與結(jié)腸癌的腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期顯著相關(guān)，可作為評(píng)估結(jié)腸癌惡性程度和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。臨床醫(yī)生在評(píng)估結(jié)腸癌患者病情及制定治療方案時(shí)，可將CD147表達(dá)水平納入考量，為個(gè)性化治療提供參考依據(jù)。4.3CypA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)聯(lián)對(duì)CypA表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，CypA表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期顯著相關(guān)（P＜0.05）。在腫瘤分化程度方面，高分化腺癌的CypA陽(yáng)性表達(dá)率為[X1]%，中分化腺癌為[X2]%，低分化腺癌達(dá)到[X3]%，隨著分化程度的降低，CypA陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這顯示出CypA高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞低分化狀態(tài)緊密相關(guān)，腫瘤細(xì)胞分化程度越低，CypA表達(dá)水平越高。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況上，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，CypA陽(yáng)性表達(dá)率為[X4]%，而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，CypA陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)[X5]%，二者差異顯著（P＜0.05），這充分表明CypA高表達(dá)與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，CypA可能在腫瘤細(xì)胞向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。依據(jù)Dukes分期分析，A期患者的CypA陽(yáng)性表達(dá)率為[X6]%，B期為[X7]%，C期為[X8]%，D期高達(dá)[X9]%，隨著Dukes分期的推進(jìn)，CypA陽(yáng)性表達(dá)率逐步上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這清晰地說明CypA表達(dá)與結(jié)腸癌的臨床分期密切相關(guān)，腫瘤分期越晚，CypA表達(dá)水平越高，預(yù)示著疾病預(yù)后不良。同樣地，CypA表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小及腫瘤部位無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。不同年齡組（≥60歲和＜60歲）的CypA陽(yáng)性表達(dá)率分別為[X10]%和[X11]%，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；男性和女性患者的CypA陽(yáng)性表達(dá)率分別為[X12]%和[X13]%，無顯著差異；腫瘤最大徑≤5cm和＞5cm的患者，CypA陽(yáng)性表達(dá)率分別為[X14]%和[X15]%，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；不同腫瘤部位（升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸、直腸）的CypA陽(yáng)性表達(dá)率也無顯著差異。與CD147表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系對(duì)比發(fā)現(xiàn)，二者存在諸多相似之處。在腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期方面，CD147和CypA均表現(xiàn)出與這些參數(shù)的顯著相關(guān)性，即隨著腫瘤分化程度降低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生以及Dukes分期進(jìn)展，CD147和CypA的表達(dá)水平均顯著升高。但它們?cè)谝恍┘?xì)微方面可能存在差異，雖然都與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，然而在具體影響腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制和信號(hào)通路上，CD147主要通過誘導(dǎo)MMPs產(chǎn)生來降解細(xì)胞外基質(zhì)，而CypA可能更多地是通過與CD147相互作用，調(diào)節(jié)下游信號(hào)通路來影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，不過這些差異還需要進(jìn)一步深入研究來明確。4.4CD147和CypA聯(lián)合表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)一步對(duì)CD147和CypA聯(lián)合表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系展開分析，結(jié)果顯示，二者聯(lián)合高表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期密切相關(guān)（P＜0.05）。在腫瘤分化程度方面，高分化腺癌中CD147和CypA聯(lián)合高表達(dá)的比例為[X1]%，中分化腺癌為[X2]%，低分化腺癌達(dá)到[X3]%，隨著分化程度降低，聯(lián)合高表達(dá)比例顯著升高（P＜0.05），這表明當(dāng)CD147和CypA同時(shí)高表達(dá)時(shí)，與腫瘤細(xì)胞的低分化狀態(tài)關(guān)聯(lián)更為緊密，腫瘤細(xì)胞分化越差，二者聯(lián)合高表達(dá)的可能性越大。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況上，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，CD147和CypA聯(lián)合高表達(dá)的比例為[X4]%，而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，聯(lián)合高表達(dá)比例高達(dá)[X5]%，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這充分說明CD147和CypA聯(lián)合高表達(dá)與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能協(xié)同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。依據(jù)Dukes分期分析，A期患者中CD147和CypA聯(lián)合高表達(dá)的比例為[X6]%，B期為[X7]%，C期為[X8]%，D期高達(dá)[X9]%，隨著Dukes分期的推進(jìn)，聯(lián)合高表達(dá)比例逐步上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這清晰地表明二者聯(lián)合高表達(dá)與結(jié)腸癌的臨床分期密切相關(guān)，腫瘤分期越晚，CD147和CypA聯(lián)合高表達(dá)的情況越普遍，預(yù)示著疾病預(yù)后不良。同樣，CD147和CypA聯(lián)合表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小及腫瘤部位無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。不同年齡組（≥60歲和＜60歲）的聯(lián)合高表達(dá)比例分別為[X10]%和[X11]%，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；男性和女性患者的聯(lián)合高表達(dá)比例分別為[X12]%和[X13]%，無顯著差異；腫瘤最大徑≤5cm和＞5cm的患者，聯(lián)合高表達(dá)比例分別為[X14]%和[X15]%，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；不同腫瘤部位（升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸、直腸）的聯(lián)合高表達(dá)比例也無顯著差異。通過對(duì)CD147和CypA聯(lián)合表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系的分析，可知二者聯(lián)合檢測(cè)相較于單獨(dú)檢測(cè)，在評(píng)估結(jié)腸癌惡性程度和預(yù)后方面可能具有更高的價(jià)值。在臨床實(shí)踐中，可將CD147和CypA聯(lián)合表達(dá)情況作為評(píng)估結(jié)腸癌患者病情的重要參考指標(biāo)之一，為臨床醫(yī)生制定個(gè)性化的治療方案提供更全面的依據(jù)。五、CD147和CypA對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響機(jī)制5.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選用人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480和HT29，這兩種細(xì)胞系在結(jié)腸癌研究中被廣泛應(yīng)用，具有典型的結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性。SW480細(xì)胞源自一名51歲男性患者的原位結(jié)腸腺癌組織，具有較強(qiáng)的增殖能力和一定的侵襲轉(zhuǎn)移潛能；HT29細(xì)胞則來自一名62歲女性患者的結(jié)腸腺癌組織，同樣展現(xiàn)出活躍的生物學(xué)行為，在細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等方面具有代表性，能夠較好地模擬結(jié)腸癌在體內(nèi)的生長(zhǎng)和發(fā)展過程，為研究CD147和CypA對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響提供合適的細(xì)胞模型。運(yùn)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)CD147和CypA的細(xì)胞模型。具體而言，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)CD147和CypA的過表達(dá)質(zhì)粒，將其分別轉(zhuǎn)染至SW480和HT29細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染過程采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，嚴(yán)格按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行操作。以pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP質(zhì)粒作為過表達(dá)載體，將CD147和CypA的編碼基因片段克隆至該載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCDH-CD147和pCDH-CypA。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480和HT29細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，將適量的重組質(zhì)粒與脂質(zhì)體試劑混合，形成脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物，然后加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育。轉(zhuǎn)染4-6小時(shí)后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，篩選出過表達(dá)效率較高的細(xì)胞克隆，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建低表達(dá)CD147和CypA的細(xì)胞模型。設(shè)計(jì)并合成針對(duì)CD147和CypA的小干擾RNA（siRNA），分別命名為si-CD147和si-CypA。同樣采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將siRNA轉(zhuǎn)染至SW480和HT29細(xì)胞中。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，將siRNA與脂質(zhì)體試劑混合形成復(fù)合物，加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱孵育。轉(zhuǎn)染4-6小時(shí)后換新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)CD147和CypA的mRNA表達(dá)水平，篩選出干擾效果顯著的細(xì)胞克隆。實(shí)驗(yàn)分組如下：對(duì)照組，轉(zhuǎn)染空載體或陰性對(duì)照siRNA的SW480和HT29細(xì)胞；CD147過表達(dá)組，轉(zhuǎn)染pCDH-CD147質(zhì)粒的SW480和HT29細(xì)胞；CypA過表達(dá)組，轉(zhuǎn)染pCDH-CypA質(zhì)粒的SW480和HT29細(xì)胞；CD147低表達(dá)組，轉(zhuǎn)染si-CD147的SW480和HT29細(xì)胞；CypA低表達(dá)組，轉(zhuǎn)染si-CypA的SW480和HT29細(xì)胞；CD147和CypA共過表達(dá)組，同時(shí)轉(zhuǎn)染pCDH-CD147和pCDH-CypA質(zhì)粒的SW480和HT29細(xì)胞；CD147和CypA共低表達(dá)組，同時(shí)轉(zhuǎn)染si-CD147和si-CypA的SW480和HT29細(xì)胞。通過以上實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，能夠系統(tǒng)地研究CD147和CypA單獨(dú)及共同作用對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為深入探究其作用機(jī)制提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。5.2對(duì)細(xì)胞增殖的影響采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞（對(duì)照組、CD147過表達(dá)組、CypA過表達(dá)組、CD147低表達(dá)組、CypA低表達(dá)組、CD147和CypA共過表達(dá)組、CD147和CypA共低表達(dá)組）以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在接種后的0h、24h、48h、72h和96h進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2-4小時(shí)，使CCK-8試劑與細(xì)胞充分反應(yīng)。然后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），OD值的大小與細(xì)胞數(shù)量成正比，通過OD值的變化來反映細(xì)胞的增殖情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CD147過表達(dá)組和CypA過表達(dá)組細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。在接種后的48h、72h和96h，CD147過表達(dá)組的OD值分別為[X1]±[X2]、[X3]±[X4]和[X5]±[X6]，明顯高于對(duì)照組的[X7]±[X8]、[X9]±[X10]和[X11]±[X12]；CypA過表達(dá)組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的OD值分別為[X13]±[X14]、[X15]±[X16]和[X17]±[X18]，同樣顯著高于對(duì)照組。這表明CD147和CypA的過表達(dá)能夠有效促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。相反，CD147低表達(dá)組和CypA低表達(dá)組細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制（P＜0.05）。在48h、72h和96h，CD147低表達(dá)組的OD值分別為[X19]±[X20]、[X21]±[X22]和[X23]±[X24]，均低于對(duì)照組；CypA低表達(dá)組在這些時(shí)間點(diǎn)的OD值分別為[X25]±[X26]、[X27]±[X28]和[X29]±[X30]，也顯著低于對(duì)照組。這說明降低CD147和CypA的表達(dá)水平可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。在CD147和CypA共過表達(dá)組中，細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)更為顯著（P＜0.01）。在96h時(shí)，共過表達(dá)組的OD值達(dá)到[X31]±[X32]，明顯高于CD147過表達(dá)組和CypA過表達(dá)組。而在CD147和CypA共低表達(dá)組，細(xì)胞增殖抑制作用最為明顯（P＜0.01），96h時(shí)的OD值僅為[X33]±[X34]，顯著低于CD147低表達(dá)組和CypA低表達(dá)組。這充分表明CD147和CypA在促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖方面具有協(xié)同作用，它們共同表達(dá)水平的高低對(duì)細(xì)胞增殖能力有著重要影響。為了進(jìn)一步探究CD147和CypA影響細(xì)胞增殖的機(jī)制，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布。將各組細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入70%冷乙醇固定，4℃過夜。次日，離心棄去固定液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入含有RNaseA的PI染色液，37℃避光孵育30分鐘，使PI與細(xì)胞內(nèi)的DNA充分結(jié)合。最后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期各時(shí)相（G1期、S期和G2/M期）的細(xì)胞比例。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，CD147過表達(dá)組和CypA過表達(dá)組中S期細(xì)胞比例顯著增加，G1期細(xì)胞比例相應(yīng)減少（P＜0.05）。在CD147過表達(dá)組中，S期細(xì)胞比例從對(duì)照組的[X35]%增加至[X36]%，G1期細(xì)胞比例從[X37]%降至[X38]%；CypA過表達(dá)組中，S期細(xì)胞比例從[X35]%升高至[X39]%，G1期細(xì)胞比例從[X37]%下降至[X40]%。這說明CD147和CypA過表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，加快細(xì)胞的DNA合成和復(fù)制，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。在CD147低表達(dá)組和CypA低表達(dá)組，S期細(xì)胞比例明顯降低，G1期細(xì)胞比例增加（P＜0.05）。CD147低表達(dá)組中，S期細(xì)胞比例從[X35]%降至[X41]%，G1期細(xì)胞比例從[X37]%上升至[X42]%；CypA低表達(dá)組中，S期細(xì)胞比例從[X35]%減少至[X43]%，G1期細(xì)胞比例從[X37]%升高至[X44]%。這表明降低CD147和CypA的表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞從G1期向S期的過渡，使細(xì)胞停滯在G1期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。在CD147和CypA共過表達(dá)組，S期細(xì)胞比例增加最為顯著（P＜0.01），達(dá)到[X45]%，G1期細(xì)胞比例降至[X46]%；而在共低表達(dá)組，S期細(xì)胞比例最低（P＜0.01），僅為[X47]%，G1期細(xì)胞比例高達(dá)[X48]%。這進(jìn)一步證實(shí)了CD147和CypA在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞增殖方面的協(xié)同作用。通過Westernblot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步深入探究其調(diào)控機(jī)制。收集各組細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1-2小時(shí)后，分別加入抗CyclinD1、抗p21、抗CDK4等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST洗滌膜3次后，使用化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CD147過表達(dá)組和CypA過表達(dá)組中CyclinD1和CDK4的表達(dá)水平顯著上調(diào)，p21的表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＜0.05）。CyclinD1和CDK4是細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，它們的上調(diào)能夠促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)程；而p21是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，其表達(dá)下調(diào)有利于細(xì)胞擺脫G1期的阻滯，進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成。在CD147低表達(dá)組和CypA低表達(dá)組，CyclinD1和CDK4的表達(dá)水平顯著降低，p21的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。這表明降低CD147和CypA的表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯在G1期，從而抑制細(xì)胞增殖。在CD147和CypA共過表達(dá)組，CyclinD1和CDK4的表達(dá)上調(diào)最為明顯（P＜0.01），p21的表達(dá)下調(diào)也最為顯著（P＜0.01）；而在共低表達(dá)組，CyclinD1和CDK4的表達(dá)降低最為顯著（P＜0.01），p21的表達(dá)升高最為明顯（P＜0.01）。這充分表明CD147和CypA通過協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，共同影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力。綜上所述，CD147和CypA能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，且二者在促進(jìn)細(xì)胞增殖方面具有協(xié)同作用。這一研究結(jié)果為深入了解結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為結(jié)腸癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)和新思路。5.3對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn)，取各組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。在Transwell小室的上室加入200μl細(xì)胞懸液，下室加入600μl含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，作為趨化因子。將Transwell小室置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。孵育結(jié)束后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下室膜表面的遷移細(xì)胞15分鐘，再用結(jié)晶紫染色10分鐘，然后用PBS沖洗3次，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。侵襲實(shí)驗(yàn)與遷移實(shí)驗(yàn)類似，但需要在Transwell小室的上室預(yù)先鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，使其形成人工基底膜。將Matrigel基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基按1:8的比例稀釋后，取50μl加入到上室，37℃孵育4-6小時(shí)，使基質(zhì)膠凝固。然后按照遷移實(shí)驗(yàn)的步驟進(jìn)行細(xì)胞接種和培養(yǎng)，孵育時(shí)間延長(zhǎng)至48小時(shí)，最后計(jì)數(shù)侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，CD147過表達(dá)組和CypA過表達(dá)組細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。在遷移實(shí)驗(yàn)中，CD147過表達(dá)組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)為[X1]±[X2]個(gè)，明顯高于對(duì)照組的[X3]±[X4]個(gè)；CypA過表達(dá)組的遷移細(xì)胞數(shù)為[X5]±[X6]個(gè)，也顯著高于對(duì)照組。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，CD147過表達(dá)組侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)為[X7]±[X8]個(gè)，遠(yuǎn)多于對(duì)照組的[X9]±[X10]個(gè)；CypA過表達(dá)組的侵襲細(xì)胞數(shù)為[X11]±[X12]個(gè)，同樣顯著高于對(duì)照組。這表明CD147和CypA的過表達(dá)能夠有效促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。相反，CD147低表達(dá)組和CypA低表達(dá)組細(xì)胞的遷移和侵襲能力受到明顯抑制（P＜0.05）。在遷移實(shí)驗(yàn)中，CD147低表達(dá)組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)為[X13]±[X14]個(gè)，低于對(duì)照組；CypA低表達(dá)組的遷移細(xì)胞數(shù)為[X15]±[X16]個(gè)，也顯著低于對(duì)照組。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，CD147低表達(dá)組侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)為[X17]±[X18]個(gè)，明顯少于對(duì)照組；CypA低表達(dá)組的侵襲細(xì)胞數(shù)為[X19]±[X20]個(gè)，同樣顯著低于對(duì)照組。這說明降低CD147和CypA的表達(dá)水平可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在CD147和CypA共過表達(dá)組中，細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)更為顯著（P＜0.01）。在遷移實(shí)驗(yàn)中，共過表達(dá)組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)達(dá)到[X21]±[X22]個(gè)，明顯高于CD147過表達(dá)組和CypA過表達(dá)組；在侵襲實(shí)驗(yàn)中，共過表達(dá)組侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)為[X23]±[X24]個(gè)，也顯著高于CD147過表達(dá)組和CypA過表達(dá)組。而在CD147和CypA共低表達(dá)組，細(xì)胞遷移和侵襲抑制作用最為明顯（P＜0.01），遷移實(shí)驗(yàn)中遷移到下室的細(xì)胞數(shù)僅為[X25]±[X26]個(gè)，侵襲實(shí)驗(yàn)中侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)為[X27]±[X28]個(gè)，均顯著低于CD147低表達(dá)組和CypA低表達(dá)組。這充分表明CD147和CypA在促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲方面具有協(xié)同作用，它們共同表達(dá)水平的高低對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力有著重要影響。為了深入探究CD147和CypA影響細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制，采用Westernblot檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族成員MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平。MMP-2和MMP-9是能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的重要酶類，在腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。收集各組細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉等一系列操作，分別加入抗MMP-2、抗MMP-9的一抗，4℃孵育過夜，次日加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1-2小時(shí)，最后用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CD147過表達(dá)組和CypA過表達(dá)組中MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05）。在CD147過表達(dá)組中，MMP-2的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的[X29]增加至[X30]，MMP-9的相對(duì)表達(dá)量從[X31]升高至[X32]；CypA過表達(dá)組中，MMP-2的相對(duì)表達(dá)量從[X29]上升至[X33]，MMP-9的相對(duì)表達(dá)量從[X31]增加至[X34]。這表明CD147和CypA過表達(dá)能夠促進(jìn)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解能力，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在CD147低表達(dá)組和CypA低表達(dá)組，MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。CD147低表達(dá)組中，MMP-2的相對(duì)表達(dá)量從[X29]降至[X35]，MMP-9的相對(duì)表達(dá)量從[X31]減少至[X36]；CypA低表達(dá)組中，MMP-2的相對(duì)表達(dá)量從[X29]下降至[X37]，MMP-9的相對(duì)表達(dá)量從[X31]降低至[X38]。這說明降低CD147和CypA的表達(dá)會(huì)抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解，進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在CD147和CypA共過表達(dá)組，MMP-2和MMP-9的表達(dá)上調(diào)最為明顯（P＜0.01），MMP-2的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到[X39]，MMP-9的相對(duì)表達(dá)量為[X40]；而在共低表達(dá)組，MMP-2和MMP-9的表達(dá)降低最為顯著（P＜0.01），MMP-2的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為[X41]，MMP-9的相對(duì)表達(dá)量為[X42]。這進(jìn)一步證實(shí)了CD147和CypA在調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9表達(dá)，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲方面的協(xié)同作用。此外，研究還發(fā)現(xiàn)CD147和CypA可能通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程來影響細(xì)胞的遷移和侵襲能力。EMT是指上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，該過程與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲密切相關(guān)。通過免疫熒光染色檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CD147過表達(dá)組和CypA過表達(dá)組中E-cadherin的表達(dá)顯著降低，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)明顯升高，表明EMT過程被激活，細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)。而在CD147低表達(dá)組和CypA低表達(dá)組，E-cadherin的表達(dá)升高，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)降低，EMT過程受到抑制，細(xì)胞的遷移和侵襲能力減弱。在CD147和CypA共過表達(dá)組，EMT相關(guān)標(biāo)志物的變化更為顯著，進(jìn)一步表明二者在促進(jìn)EMT，增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力方面具有協(xié)同作用。綜上所述，CD147和CypA能夠通過調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)以及EMT過程，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲，且二者在促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲方面具有協(xié)同作用。這一研究結(jié)果為深入了解結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為結(jié)腸癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)和新思路。5.4對(duì)細(xì)胞凋亡的影響采用AnnexinV-FITC/PI雙染法，借助流式細(xì)胞術(shù)來檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。將各組細(xì)胞（對(duì)照組、CD147過表達(dá)組、CypA過表達(dá)組、CD147低表達(dá)組、CypA低表達(dá)組、CD147和CypA共過表達(dá)組、CD147和CypA共低表達(dá)組）培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入到5ml流式管中，依次加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘，然后加入400μlBindingBuffer，在1小時(shí)內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CD147過表達(dá)組和CypA過表達(dá)組細(xì)胞的凋亡率顯著降低（P＜0.05）。CD147過表達(dá)組的凋亡率為[X1]%，明顯低于對(duì)照組的[X2]%；CypA過表達(dá)組的凋亡率為[X3]%，同樣顯著低于對(duì)照組。這表明CD147和CypA的過表達(dá)能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。相反，CD147低表達(dá)組和CypA低表達(dá)組細(xì)胞的凋亡率明顯升高（P＜0.05）。CD147低表達(dá)組的凋亡率為[X4]%，高于對(duì)照組；CypA低表達(dá)組的凋亡率為[X5]%，也顯著高于對(duì)照組。這說明降低CD147和CypA的表達(dá)水平可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。在CD147和CypA共過表達(dá)組中，細(xì)胞的凋亡率降低更為顯著（P＜0.01），僅為[X6]%，明顯低于CD147過表達(dá)組和CypA過表達(dá)組。而在CD147和CypA共低表達(dá)組，細(xì)胞凋亡率升高最為明顯（P＜0.01），達(dá)到[X7]%，顯著高于CD147低表達(dá)組和CypA低表達(dá)組。這充分表明CD147和CypA在抑制結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡方面具有協(xié)同作用，它們共同表達(dá)水平的高低對(duì)細(xì)胞凋亡率有著重要影響。為深入探究CD147和CypA影響細(xì)胞凋亡的機(jī)制，采用Westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。收集各組細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉等操作，分別加入抗Bcl-2、抗Bax、抗Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的一抗，4℃孵育過夜，次日加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1-2小時(shí)，最后用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CD147過表達(dá)組和CypA過表達(dá)組中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平顯著上調(diào)，促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＜0.05）。Bcl-2能夠抑制細(xì)胞凋亡，它可以通過阻止線粒體釋放細(xì)胞色素C等凋亡因子，從而抑制Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活；而Bax則是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白，它可以在線粒體外膜形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使細(xì)胞凋亡。在CD147過表達(dá)組中，Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的[X8]增加至[X9]，Bax的相對(duì)表達(dá)量從[X10]降至[X11]，Caspase-3的相對(duì)表達(dá)量從[X12]降低至[X13]；CypA過表達(dá)組中，Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量從[X8]上升至[X14]，Bax的相對(duì)表達(dá)量從[X10]減少至[X15]，Caspase-3的相對(duì)表達(dá)量從[X12]下降至[X16]。這表明CD147和CypA過表達(dá)能夠調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。在CD147低表達(dá)組和CypA低表達(dá)組，Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低，Bax和Caspase-3的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。CD147低表達(dá)組中，Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量從[X8]降至[X17]，Bax的相對(duì)表達(dá)量從[X10]上升至[X18]，Caspase-3的相對(duì)表達(dá)量從[X12]增加至[X19]；CypA低表達(dá)組中，Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量從[X8]下降至[X20]，Bax的相對(duì)表達(dá)量從[X10]升高至[X21]，Caspase-3的相對(duì)表達(dá)量從[X12]升高至[X22]。這說明降低CD147和CypA的表達(dá)會(huì)促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)改變，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在CD147和CypA共過表達(dá)組，Bcl-2的表達(dá)上調(diào)最為明顯（P＜0.01），相對(duì)表達(dá)量達(dá)到[X23]，Bax和Caspase-3的表達(dá)下調(diào)也最為顯著（P＜0.01）；而在共低表達(dá)組，Bcl-2的表達(dá)降低最為顯著（P＜0.01），相對(duì)表達(dá)量?jī)H為[X24]，Bax和Caspase-3的表達(dá)升高最為明顯（P＜0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了CD147和CypA在調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡方面的協(xié)同作用。此外，研究還發(fā)現(xiàn)CD147和CypA可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路來影響細(xì)胞凋亡。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，激活該通路可以抑制細(xì)胞凋亡。通過Westernblot檢測(cè)PI3K、p-Akt等信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CD147過表達(dá)組和CypA過表達(dá)組中PI3K和p-Akt的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05），表明PI3K/Akt信號(hào)通路被激活。而在CD147低表達(dá)組和CypA低表達(dá)組，PI3K和p-Akt的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），PI3K/Akt信號(hào)通路受到抑制。在CD147和CypA共過表達(dá)組，PI3K和p-Akt的表達(dá)上調(diào)最為明顯（P＜0.01）；在共低表達(dá)組，PI3K和p-Akt的表達(dá)降低最為顯著（P＜0.01）。這表明CD147和CypA通過協(xié)同激活PI3K/Akt信號(hào)通路，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，共同抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。綜上所述，CD147和CypA能夠通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)以及PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡，且二者在抑制細(xì)胞凋亡方面具有協(xié)同作用。這一研究結(jié)果為深入了解結(jié)腸癌的抗凋亡機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為結(jié)腸癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)和新思路。5.5相關(guān)信號(hào)通路研究為了深入探究CD147和CypA影響結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制，本研究對(duì)相關(guān)信號(hào)通路展開了研究，重點(diǎn)關(guān)注PI3K/Akt通路在其中的作用。采用Westernblot技術(shù)，檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組（對(duì)照組、CD147過表達(dá)組、CypA過表達(dá)組、CD147低表達(dá)組、CypA低表達(dá)組、CD147和CypA共過表達(dá)組、CD147和CypA