ICS65.020.30CCSB41DB42TechnicalproceduresofPCRdifferentialdiagnosisfordetectionofvirulentandavirulentswineerysipelas(Erysipelothrixrhu湖北省市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB42/TXXXXX—2020前言 12規(guī)范性引用文件 13術語與定義 14檢測原理 15檢測條件 16檢測方法 27結果判定 28注意事項 2附錄A（規(guī)范性附錄）試劑的配制 3DB42/TXXXXX—2020本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》給出的規(guī)則起草。本文件由華中農業(yè)大學提出。本文件由湖北省農業(yè)農村廳歸口管理。本文件起草單位：華中農業(yè)大學、武漢科前生物股份有限公司。本文件主要起草人：金梅林、吳超、朱偉峰、孫小美、范俊青、康超、徐高原。本文件實施應用中的疑問，可咨詢湖北省農業(yè)農村廳，聯(lián)系電話郵箱：hbsnab@126.com；華中農業(yè)大學，聯(lián)系電話郵箱：xys@。jml8328@126.com。DB42/TXXXXX—2020豬丹毒是一種重要的人畜共患病，由紅斑丹毒絲菌（俗稱豬丹毒桿菌）引起。豬丹毒可導致生豬從業(yè)人員中的特定人群感染和死亡，嚴重危害人類健康，同時給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。為此，制定了《豬丹毒（紅斑丹毒絲菌）PCR鑒別診斷技術規(guī)程》標準，建立了一種既可以鑒定紅斑丹毒絲菌臨床分離株又可以同時區(qū)分疫苗菌株和野生型菌株的雙重PCR方法，有利于該病的早發(fā)現(xiàn)、早報告、早處置，為防控節(jié)省時間，為豬丹毒的快速診斷、豬丹毒野生毒株與疫苗弱毒株的鑒別診斷提供了精確簡便的分子生物學方法，對當前防控豬丹毒具有重大意義。DB42/TXXXXX—20201豬丹毒（紅斑丹毒絲菌）PCR鑒別診斷技術規(guī)程本文件規(guī)定了豬丹毒（紅斑丹毒絲菌）PCR鑒別診斷技術的術語與定義、檢測原理、檢測條件、檢測方法、結果判定等。本文件適用于豬丹毒（紅斑丹毒絲菌）的鑒別診斷。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術語與定義下列術語和定義適用于本標準3.1雙重PCR法duplexPCR指在同一PCR反應體系里加入兩對引物，針對兩個DNA模板或者同一個DNA模板的兩個不同區(qū)域進行擴增，最多可同時擴增出兩條核酸片段的PCR反應。4檢測原理利用紅斑丹毒絲菌弱毒疫苗株G4T10和GC42與野毒株關于DNA聚合酶IV基因上的差異，設計豬丹毒疫苗株的特異性引物，結合豬丹毒桿菌的種特異性引物，建立起一種快速檢測豬丹毒菌株并同時區(qū)分豬丹毒弱毒疫苗株和野毒株的雙重PCR法。5檢測條件5.1實驗室實驗操作宜在室溫下進行。5.2儀器及耗材PCR儀、瓊脂糖凝膠電泳儀、組織研磨儀、凝膠成像系統(tǒng)、電磁爐、微量移液器（0.1μL-2.5μL、0.5μL-10μL、5μL-50μL、10μL-100μL、100μL-1mL）、離心機（12000rpm）、恒溫箱（37℃)、水浴鍋（55-60℃)、電子天平（0.01g-300g）離心管（0.2mL、1.5mL）5.3試劑2DB42/TXXXXX—2020DNA聚合酶EasyTaq、EasyTaq10×buffer、dNTPs、去離子水、DNAMarker（包含500bp，1000bp條帶）、陽性對照1、陽性對照2、陰性對照、蛋白酶K（100μg/mL）、GoldView核酸染料、溴酚藍上樣緩沖液、瓊脂糖凝膠（10g/L）、PBS緩沖液、TAE電泳緩沖液、引物。6檢測方法6.1樣品準備采集發(fā)病豬的心、肺、腎、肝、脾、腦及關節(jié)樣品組織，將0.5g樣品組織剪碎加入2mLPBS勻漿，勻漿操作時間30秒，共3次。于37℃培養(yǎng)5h，加蛋白酶K（100μg/mL）于55-60℃水浴1h。取1mL消化產(chǎn)物于離心管中，沸水中加熱5min并快速置于冰浴中5min，12000rpm離心2min，取上清即為樣品DNA。6.2PCR擴增以提取的樣品DNA為模板進行PCR反應。PCR反應體系（25μL引物vaccine-F20μmol/L1μL，引物vaccine-R20μmol/L1μL，ER120μmol/L1μL，ER220μmol/L1μL，dNTPs2μL，EasyTaq0.5μL，EasyTaq10×buffer2.5μL，去離子水15μL，樣本DNA1μL。PCR反應條件：1：94℃2min；2：94℃30sec；3：55℃30sec；4：72℃1min；5：72℃2min，其中2，3，4循環(huán)35次。6.3瓊脂糖凝膠電泳PCR反應擴增完成后，向產(chǎn)物中加入0.1%的溴酚藍上樣緩沖液。使用1倍TAE電泳緩沖液配制10g/L的瓊脂糖凝膠，凝膠中加入0.005%的GoldView染料進行染色。電泳完成后于凝膠成像系統(tǒng)下觀察。7結果判定陽性對照1擴增出453bp片段和937bp片段，陽性對照2擴增出937bp片段，陰性對照不能擴增出任何片段，判定為檢測結果成立，否則判定為檢測結果不成立。在試驗結果成立的前提下，同時擴增出453bp和937bp片段，判定為豬丹毒疫苗株；僅擴增出937bp片段，判定為豬丹毒野毒株。8注意事項采樣及檢測過程中應注意個人防護，戴口罩和手套、穿工作服；在無污染環(huán)境中操作，及時清理物品，用75%酒精對操作區(qū)域消毒處理；廢棄物經(jīng)高壓滅菌后按有關規(guī)定處理。DB42/TXXXXX—20203（規(guī)范性）試劑的配制A.1商品化試劑DNA聚合酶EasyTaq、EasyTaq10×buffer、dNTPs、去離子水、蛋白酶K、瓊脂糖、溴酚藍上樣緩沖液、GoldView染料，均為商品化試劑。A.2陽性對照和陰性對照陽性對照1：紅斑丹毒絲菌G4T10疫苗株全基因組DNA陽性對照2：紅斑丹毒絲菌1a型標準強毒C43-8株全基因組DNA陰性對照：去離子水。A.3PBS緩沖液氯化鈉（NaCl）8g，氯化鉀（KCl）0.2g，十二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）2.9g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2g，加水至1000mL，置2-8℃保存?zhèn)溆?。A.4TAE電泳緩沖液50倍TAE緩沖液制備：稱取Tris鹽242g，Na2EDTA.2H2O37.2g溶于約600mL的去離子水，充分攪拌溶解；加入57.1mL的醋酸，充分攪拌；加去離子水將溶液定容至1L后，室溫保存。A.5瓊脂糖凝膠（10g/L）稱取1g瓊脂糖，加入1倍的TAE電泳緩沖液100mL，微波爐中加熱至瓊脂糖完成溶解。A.6