ICS67．120．10CCSB4542Detectionofbovine,ovine,caprine,pig,chickenandduckderivedmaterialsinmeatsandmeatproductsoflivestockandpoultrybyqualitativepolymerasechainreactionIDB42/TXXXXX—XXXX前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語(yǔ)和定義 4原理 5試劑和材料 6儀器和設(shè)備 37分析步驟 38結(jié)果分析 59結(jié)果判定與表述 510PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果判定與表述 511檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施 512廢棄物處理 5附錄A（資料性）擴(kuò)增產(chǎn)物序列（來(lái)源NCBI） 7本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。本文件由湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。本文件起草單位：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、武漢市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心。本文件主要起草人：劉榜，王文君，付明，周翔，陶利文，劉祖紅，王小康，張慶德，阮征。本文件實(shí)施中的疑問(wèn)可咨詢(xún)湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳，聯(lián)系電話郵箱：hbsnab@126.com；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，聯(lián)系電話郵箱：liubang@。對(duì)本文件的有關(guān)修改意見(jiàn)及建議請(qǐng)反饋至華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，聯(lián)系電話郵箱：xys@。1畜禽肉及肉制品中牛羊豬雞鴨源性成分定性PCR檢測(cè)方法本文件規(guī)定了牛（普通牛、瘤牛、牦牛和水牛）、羊（綿羊和山羊）、豬（家豬和野豬）、雞、鴨源性成分的定性PCR檢測(cè)方法。本文件適用于牛（普通牛、瘤牛、牦牛和水牛）、羊（綿羊和山羊）、豬（家豬和野豬）、雞、鴨的肉及肉制品中源性成分的定性PCR檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求GB/T27403-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4原理根據(jù)牛、羊、豬、雞和鴨的物種特異性序列，設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)待檢樣品提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，依據(jù)擴(kuò)增特異性片段的結(jié)果，判斷待檢樣品中是否含有牛、羊、豬、雞和鴨源性成分。5試劑和材料5.1除另有規(guī)定外，試劑為分析純或生化試劑。實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T6682的要求。5.2瓊脂糖。5.3GelRed核酸染料。注：根據(jù)需要可選擇其他效果相當(dāng)?shù)暮怂崛玖献鳛楹怂犭娪镜娜旧珓?.410mol/L氫氧化鈉溶液：在160mL水中加入80.0g氫氧化鈉（NaOH），溶解后，冷卻至室溫，再加水定容至200mL。5.50.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液（pH8.0）：稱(chēng)取18.6g乙二銨四乙酸二鈉（EDTA-Na2），加入70mL水中，再加入適量氫氧化鈉溶液（5.4），加熱至完全溶解后，冷卻至室溫，用氫氧化鈉溶液（5.4）調(diào)pH至8.0，加水定容至100mL。在103.4kPa（121℃)條件下滅菌20min。25.61mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液（pH8.0）：稱(chēng)取121.1g三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中，用鹽酸（HCl）調(diào)pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃)條件下滅菌20min。5.75mol/L氯化鈉溶液：稱(chēng)取29.22g氯化鈉（NaCl）溶于80mL水中，加水定容至100mL。在103.4kPa蒸汽壓（121℃)條件下滅菌20min。5.810%十二烷基磺酸鈉溶液：稱(chēng)取10g十二烷基磺酸鈉（C12H25SO4Na，SDS），加入80mL水中，加熱至完全溶解后，冷卻至室溫，加水定容至100mL。在103.4kPa蒸汽壓（121℃)條件下滅菌20min。5.9DNA提取細(xì)胞裂解液：量取200mL乙二銨四乙酸二鈉溶液（5.5），200mL三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液（5.6），40mL氯化鈉溶液（5.7），200mL十二烷基磺酸鈉溶液（5.8），混合后用水定容至1000mL，室溫保存，備用。5.1020mg/mL蛋白酶K溶液：將200mg蛋白酶K（ProteinaseK）溶于9.5mL水中，輕搖至完全溶解后，加水定容至10mL。于-20℃保存?zhèn)溆谩?.11Tris-飽和酚。5.12氯仿：異戊醇(24:1)：將氯仿和異戊醇按照24:1的比例配制。5.13無(wú)水乙醇。5.1475%乙醇。5.15TE緩沖液（pH8.0）：分別量取10mL三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液（5.6）和2mL乙二銨四乙酸二鈉溶液（5.5）溶液，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃)條件下滅菌20min。5.1650×TAE緩沖液：稱(chēng)取242.2g三羥甲基氨基甲烷（Tris），先用500mL水加熱攪拌溶解后，加入100mL乙二銨四乙酸二鈉溶液（5.5），用冰乙酸調(diào)pH至8.0，然后加水定容到1000mL。使用時(shí)用水稀釋成1×TAE。5.17Taq酶。5.1810×PCR緩沖液。5.19dNTP混合液。5.206×DNA上樣緩沖液。5.21DNA分子量標(biāo)記：可清楚的區(qū)分100bp～1000bp的DNA片段。5.22物種特異性引物（表1）。5.23引物溶液：用TE緩沖液（5.15）或水分別將引物稀釋到10μmol/L。5.24PCR產(chǎn)物回收試劑盒。表1物種特異性引物信息牛羊豬雞鴨36儀器和設(shè)備6.1分析天平：感量不小于0.1mg。6.2PCR擴(kuò)增儀：升降溫速度＞1.5℃/s，孔間溫度差異＜1.0℃。6.3電泳槽、電泳儀等電泳裝置。6.4紫外透射儀。6.5紫外分光光度計(jì)。6.6凝膠成像系統(tǒng)或照相系統(tǒng)。6.7微量可調(diào)移液器：0.1μL～2.5μL，1μL～10μL，10μL～100μL，100μL～1000μL。6.8渦旋振蕩器。6.9高速冷凍離心機(jī)（最大離心力≥12000g）。6.10恒溫水浴鍋。7分析步驟7.1樣品制備采集一定量的畜禽肉或肉制品并勻漿，-20℃保存?zhèn)溆谩?.2DNA模板制備7.2.1試樣DNA提取試樣DNA提取步驟如下：a)稱(chēng)取上述勻漿樣品0.1g，剪碎或在液氮中充分研磨成粉末后轉(zhuǎn)移至2mL離心管中（不需要研磨的試樣直接加入）；b)向樣品加入1mL細(xì)胞裂解液（5.9），然后加入30μL蛋白酶K（5.10）溶液，混勻，56℃消化6h～10h至無(wú)明顯組織塊，4℃,12000g離心10min，取上清移至新的2mL離心管中；c)加入等體積的Tris-飽和酚（5.11），緩慢顛倒混勻10min，4℃,12000g離心10min，取上清液移至新的2mL離心管中；d)加入0.5倍體積的Tris-飽和酚（5.11）和0.5倍體積的氯仿：異戊醇（24:15.12緩慢顛倒混勻10min，4℃,12000g離心1e)取上清液移至新的2mL離心管中，加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1）（5.12），緩慢顛倒f)多次重復(fù)操作步驟e)，直到兩相中間不能看到明顯的變性蛋白質(zhì)為止，取上清液移至新的4mL離心管中；g)加入2倍體積-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇（5.13輕輕搖晃至絮狀沉淀析出，12000g離心5min~10min，倒掉上清液；h)加入1mL75%乙醇（5.14）洗滌沉淀，12000g離心3min，吸去上清液，重復(fù)1次～2次；i)室溫下放置使殘余乙醇完全揮發(fā)，加入30μL～50μLTE緩沖液（5.15）溶解DNA沉淀，-20℃保存DNA溶液。7.2.2DNA質(zhì)量評(píng)估使用紫外分光光度計(jì)對(duì)試樣DNA的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，檢測(cè)260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)260和A280，滿足以下要求則適宜進(jìn)行PCR擴(kuò)增：4a)DNA濃度為50ng/μL～1000ng/μL；b)A260/A280比值應(yīng)在1.8～2.0之間。7.3PCR反應(yīng)7.3.1試樣PCR反應(yīng)每個(gè)試樣PCR反應(yīng)設(shè)置3個(gè)平行。在PCR反應(yīng)管中按表2依次加入反應(yīng)試劑，混勻。也可采用經(jīng)驗(yàn)證的、等效的定性PCR反應(yīng)試劑盒配制反應(yīng)體系。將PCR反應(yīng)管放入離心機(jī)，2000g離心1min，取出后放入PCR儀。進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸15s，32次循環(huán)；72℃終延伸2min；4℃降溫2min。反應(yīng)結(jié)束后取出PCR管，對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。表2PCR檢測(cè)反應(yīng)體系27.3.2對(duì)照PCR反應(yīng)在試樣PCR反應(yīng)的同時(shí)，應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。分別以牛、羊、豬、雞和鴨的基因組DNA作為陽(yáng)性對(duì)照；以除上述目標(biāo)物種以外的常見(jiàn)動(dòng)物的基因組DNA作為陰性對(duì)照；以水作為空白對(duì)照。各對(duì)照PCR反應(yīng)體系中，除模板外，其余組分及PCR反應(yīng)條件與試樣PCR（7.3.1）相同。7.4PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)稱(chēng)量瓊脂糖（5.2）適量，加入1×TAE緩沖液（5.16）至終濃度為20mg/mL，加熱溶解，配制成瓊脂糖溶液。每100mL瓊脂糖溶液中加入5μLGelRed核酸染料（5.3），混勻，稍適冷卻后，將其倒入電泳板上，插上梳板，室溫下凝固成凝膠后，放入含1×TAE緩沖液（5.16）電泳槽中，垂直向上輕輕拔去梳板。取5μLPCR產(chǎn)物與1μL6×DNA上樣緩沖液（5.18），混合后加入凝膠點(diǎn)樣孔，同時(shí)在其中一個(gè)點(diǎn)樣孔中加入DNA分子量標(biāo)記（5.19），接通電源，在2V/cm～5V/cm條件下電泳檢測(cè)。7.5凝膠成像分析電泳結(jié)束后，取出瓊脂糖凝膠，置于凝膠成像儀上成像。根據(jù)DNA分子量標(biāo)記判斷擴(kuò)增目的條帶的片段大?。ū?），將電泳結(jié)果形成電子文件存檔。如需通過(guò)序列分析確認(rèn)PCR擴(kuò)增片段是否為目的DNA片段，按照7.6和7.7的規(guī)定執(zhí)行。57.6PCR產(chǎn)物回收按PCR產(chǎn)物回收試劑盒說(shuō)明書(shū)，回收PCR擴(kuò)增的DNA片段。7.7PCR產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證將回收的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，PCR擴(kuò)增引物作為測(cè)序引物，測(cè)序原理同Sanger測(cè)序法。將獲得的序列分別與牛源性成分的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列、羊源性成分的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列、豬源性成分的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列、雞源性成分的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列和鴨源性成分的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列(附錄A)進(jìn)行比對(duì)和結(jié)果判定。8結(jié)果分析陽(yáng)性對(duì)照的PCR反應(yīng)中可擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的DNA片段（牛、羊、豬、雞、鴨的片段大小分別為：223bp、237bp、154bp、252bp、222bp而陰性對(duì)照及空白對(duì)照中均未擴(kuò)增出預(yù)期DNA片段，表明PCR反應(yīng)體系正常工作，否則重新進(jìn)行檢測(cè)。9結(jié)果判定與表述9.1陽(yáng)性結(jié)果判定與表述試樣中X的特異性DNA序列得到擴(kuò)增且擴(kuò)增片段大小與預(yù)期片段大小一致，表明樣品中檢測(cè)出X源性成分，表述為“樣品中檢測(cè)出X源性成分，結(jié)果為陽(yáng)性”。9.2陰性結(jié)果判定與表述試樣中X的特異性DNA序列未得到擴(kuò)增或擴(kuò)增片段大小與預(yù)期片段大小不一致，表明樣品中未檢測(cè)出X源性成分，表述為“樣品中未檢測(cè)出X源性成分，結(jié)果為陰性”。注：3個(gè)PCR平行擴(kuò)增的結(jié)果不一致的，應(yīng)重復(fù)檢測(cè)。重復(fù)檢測(cè)結(jié)果仍不一致的，以多數(shù)10PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果判定與表述若測(cè)序結(jié)果與附錄A中對(duì)應(yīng)物種的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列的符合程度在95%以上（含95%則判斷為所擴(kuò)增片段為對(duì)應(yīng)物種DNA片段，即檢測(cè)到對(duì)應(yīng)物種源性成分；若符合程度在95%以下，則判斷為所擴(kuò)增片段不是對(duì)應(yīng)物種DNA片段，即沒(méi)有檢測(cè)到對(duì)應(yīng)物種源性成分。11檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403-2008中附錄D的規(guī)定執(zhí)行。12廢棄物處理檢測(cè)過(guò)程中的廢棄物，收集后按照GB/T19495.2規(guī)定的廢棄物處理要求進(jìn)行無(wú)害化處理。67（資料性）擴(kuò)增產(chǎn)物序列（來(lái)源NCBI）A.1牛源性成分的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列（223bp1CAGACAAAGGTCAGGAAGTAATCCCAGCGCTCATCCCCCCTGGGAAGCACCCAGGGCTTG61CCCCAAGATGTGGCCTCCAGTTCCCTGTCAAGACTGTAGCCCTACTAGGAGCTGCAGTCT121GGCCCCGAGGCCCCTGCTGGGTCTCAGCGGTCCCCTATCAGGGACCAGTGGGACCCTCTC181TGAAGGGGCTTCACCAACTCCCAGACCTGCTCTTCCCTCATCTA.2羊源性成分的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列（237bp1GCAAGAATGGCACCCAAGACACCAACAGCACCTAGCTCAAGAGAAACACCAGAGCTACCA61GTGGCACCTGTGCCACTCATGGAAAGAGCAGCACCCAGGGCTAGAGTGGCATCAGAGACA121CAAGCAGTACCCAGGCCTAGAGTGGCACCCATGCCACCTGTGTCACCGAGGACAAGAGCT181GCACAAGAGACACCAGCCACTCCTGTGACACGTGCGGCAAATGCGGCACACATGGCAA.3豬源性成分的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列（154bp1GCAATGCTCCAAGGACTTAGTGACTTTCCCCAATGTTTGTGAGTCTGGCAGGGTGCAAAT61TACATCTGCAGTCTTT