EZH2基因在胃癌組織中的表達特征及其與細胞增殖的關(guān)聯(lián)機制探究一、引言1.1研究背景胃癌是全球范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康的重大疾病之一，在各類惡性腫瘤中，其發(fā)病率和死亡率均位居前列。在中國，胃癌同樣是高發(fā)的惡性腫瘤，每年新增病例數(shù)眾多，且由于早期診斷率較低，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，治療效果不佳，5年生存率遠低于早期發(fā)現(xiàn)并治療的患者。例如，中國每年新發(fā)胃癌病例占全球新發(fā)病例數(shù)的近一半，早期胃癌患者手術(shù)治療后的5年生存率超過90％，而中晚期患者的生存率則顯著降低，這凸顯了深入研究胃癌發(fā)病機制及尋找有效治療靶點的緊迫性和重要性。EZH2基因作為表觀遺傳調(diào)控領(lǐng)域的關(guān)鍵基因，編碼的EZH2蛋白是多梳蛋白復(fù)合物2（PRC2）的催化亞基，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著核心作用。它主要通過催化組蛋白H3第27位賴氨酸的三甲基化（H3K27me3），改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，進而抑制下游靶基因的表達。大量研究表明，EZH2在多種惡性腫瘤，如前列腺癌、乳腺癌中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，且與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后密切相關(guān)。在前列腺癌中，EZH2的高表達促進了癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，使得患者的預(yù)后變差；在乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)，EZH2參與了腫瘤細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，增強了腫瘤細胞的侵襲能力。在胃癌研究領(lǐng)域，EZH2基因也逐漸成為關(guān)注焦點。已有研究初步揭示了EZH2在胃癌組織中的表達異常，并且發(fā)現(xiàn)其表達水平與腫瘤的大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)，EZH2高表達的胃癌患者5年總生存率明顯低于陰性者。然而，目前對于EZH2基因在胃癌細胞增殖過程中的具體作用機制，以及其與胃癌其他生物學行為之間的復(fù)雜聯(lián)系，尚未完全明確。深入探究這些問題，將有助于進一步闡明胃癌的發(fā)病機制，為開發(fā)基于EZH2靶點的胃癌精準治療策略提供堅實的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究EZH2基因在胃癌組織中的表達情況，全面分析其表達水平與胃癌患者臨床病理特征之間的內(nèi)在聯(lián)系，并系統(tǒng)研究EZH2基因?qū)ξ赴┘毎鲋车木唧w影響及其潛在作用機制。通過對EZH2基因的深入研究，能夠為胃癌的早期診斷、病情監(jiān)測、預(yù)后評估提供全新的生物學標志物，從而有助于醫(yī)生更準確地判斷患者的病情發(fā)展和預(yù)后情況，制定更個性化的治療方案。同時，本研究還可以為開發(fā)基于EZH2靶點的胃癌新型治療策略提供堅實的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)，為提高胃癌患者的治療效果和生存率開辟新的途徑。在臨床應(yīng)用方面，本研究成果具有重要的潛在價值。一方面，若能將EZH2基因作為有效的診斷標志物，將極大地提高胃癌的早期診斷率，使更多患者能夠在疾病早期得到及時治療，顯著改善患者的預(yù)后；另一方面，針對EZH2基因開發(fā)的靶向治療藥物，有望為胃癌患者提供更精準、更有效的治療手段，減少傳統(tǒng)治療方法的副作用，提高患者的生活質(zhì)量。因此，本研究對于推動胃癌的精準醫(yī)學發(fā)展，降低胃癌的發(fā)病率和死亡率，具有重要的理論和現(xiàn)實意義。二、EZH2基因與胃癌的相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1EZH2基因概述EZH2基因，全稱為果蠅zeste基因增強子的人類同源物2（Enhancerofzestehomolog2），位于人類染色體7q36.1，其基因長度約為120kb，包含20個外顯子。EZH2基因編碼的EZH2蛋白是一種組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶，是多梳蛋白復(fù)合物2（PRC2）的核心催化亞基。從結(jié)構(gòu)上看，EZH2蛋白主要包含五個關(guān)鍵的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。EED相互作用域（EID），主要負責與PRC2復(fù)合物中的EED蛋白相互作用，這種相互作用對于維持PRC2復(fù)合物的穩(wěn)定性和功能至關(guān)重要。與PHF1和PCL（結(jié)構(gòu)域I）的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域參與與PHF1和PCL等蛋白的結(jié)合，從而影響PRC2復(fù)合物對靶基因的識別和調(diào)控。與SUZ12結(jié)合結(jié)構(gòu)域，通過與SUZ12蛋白緊密結(jié)合，共同構(gòu)成PRC2復(fù)合物的核心結(jié)構(gòu)，協(xié)同發(fā)揮催化作用。富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（CXC）和SET結(jié)構(gòu)域，這兩個結(jié)構(gòu)域?qū)τ贓ZH2蛋白的催化活性起著決定性作用。其中，SET結(jié)構(gòu)域是EZH2蛋白催化組蛋白甲基化的關(guān)鍵功能區(qū)域，它能夠特異性地催化組蛋白H3第27位賴氨酸（H3K27）的三甲基化修飾（H3K27me3）。在正常生理過程中，EZH2發(fā)揮著不可或缺的重要作用。在胚胎發(fā)育階段，EZH2通過精確調(diào)控一系列發(fā)育相關(guān)基因的表達，確保胚胎細胞的正常分化和組織器官的有序形成。研究表明，在胚胎干細胞向神經(jīng)干細胞分化的過程中，EZH2能夠通過抑制某些干性維持基因的表達，同時激活神經(jīng)分化相關(guān)基因，從而促進神經(jīng)干細胞的產(chǎn)生和分化，保障神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育。在細胞周期調(diào)控方面，EZH2參與調(diào)控細胞周期相關(guān)基因的表達，維持細胞周期的正常進程。當細胞受到外界刺激或損傷時，EZH2能夠及時調(diào)節(jié)相關(guān)基因，使細胞周期發(fā)生相應(yīng)變化，以應(yīng)對各種生理和病理情況。在維持細胞干性方面，EZH2對于干細胞的自我更新和多能性維持具有重要意義。在造血干細胞中，EZH2能夠抑制分化相關(guān)基因的表達，維持造血干細胞的干性，確保其能夠持續(xù)產(chǎn)生各種血細胞，維持機體正常的造血功能。2.2胃癌的發(fā)病機制與現(xiàn)狀胃癌的發(fā)病機制極為復(fù)雜，涉及多種因素的共同作用。飲食習慣在其中扮演著關(guān)鍵角色，長期攝入高鹽食物，如腌制食品、咸魚等，會對胃黏膜造成直接損傷，破壞胃黏膜的保護屏障，使胃黏膜長期處于炎癥狀態(tài)，進而增加胃癌的發(fā)病風險。高鹽食物還會促進幽門螺桿菌的生長和繁殖，二者協(xié)同作用，進一步加重胃黏膜的損傷。腌制和熏烤類食物中往往含有大量的亞硝酸鹽，亞硝酸鹽在胃內(nèi)的酸性環(huán)境下，可與食物中的胺類物質(zhì)結(jié)合，形成強致癌物質(zhì)亞硝胺，長期接觸亞硝胺，會導致胃黏膜上皮細胞發(fā)生基因突變，引發(fā)細胞異常增殖和分化，最終導致胃癌的發(fā)生。遺傳因素在胃癌發(fā)病中也起著重要作用。研究表明，具有家族遺傳背景的人群，患胃癌的風險顯著高于普通人群。這主要是因為某些基因突變或多態(tài)性可通過遺傳傳遞，這些遺傳變異可能影響細胞的增殖、凋亡、DNA修復(fù)等關(guān)鍵生物學過程，使個體對胃癌的易感性增加。如E-cadherin基因的突變，會導致細胞間黏附力下降，使胃黏膜上皮細胞更容易發(fā)生脫落和轉(zhuǎn)移，從而增加胃癌的發(fā)病風險。家族性腺瘤性息肉病（FAP）和遺傳性彌漫性胃癌（HDGC）等遺傳性疾病，由于特定基因的缺陷，會使家族成員患胃癌的幾率大幅提高。幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）感染是公認的胃癌主要致病因素之一。Hp可憑借其螺旋形結(jié)構(gòu)和鞭毛，在胃內(nèi)強酸性環(huán)境中生存并定植于胃黏膜表面。它產(chǎn)生的尿素酶、細胞毒素相關(guān)蛋白A（CagA）和空泡毒素A（VacA）等毒性物質(zhì)，會直接損傷胃黏膜上皮細胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)。炎癥的持續(xù)存在會導致胃黏膜上皮細胞的增殖和凋亡失衡，增加細胞基因突變的概率。CagA蛋白可通過一系列信號傳導通路，激活核因子-κB（NF-κB）等轉(zhuǎn)錄因子，促進炎癥因子的表達，同時干擾細胞周期調(diào)控和細胞凋亡，促使胃黏膜上皮細胞向癌細胞轉(zhuǎn)化。長期的Hp感染還可導致胃黏膜萎縮、腸上皮化生和異型增生等癌前病變，進一步增加胃癌的發(fā)病風險。從全球范圍來看，胃癌的發(fā)病和死亡情況不容樂觀。根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2020年全世界胃癌新發(fā)病例約108.9萬，在所有惡性腫瘤發(fā)病人數(shù)中位居第五位；死亡病例數(shù)約76.9萬，居惡性腫瘤死亡人數(shù)的第四位。胃癌的發(fā)病存在明顯的地域差異，東亞地區(qū)是胃癌的高發(fā)區(qū)，其中中國、日本和韓國的胃癌發(fā)病率和死亡率均較高。在歐美等地區(qū)，胃癌的發(fā)病率相對較低，但仍然是重要的健康問題。在中國，胃癌同樣是嚴重威脅人民健康的重大疾病。2019年中國國家癌癥中心的數(shù)據(jù)表明，胃癌的發(fā)病率和死亡率分別位于所有惡性腫瘤的第二位和第三位，是發(fā)病率第一的消化道惡性腫瘤，且發(fā)病率遠高于世界平均水平。我國每年新發(fā)胃癌病例數(shù)超過40萬，死亡人數(shù)超過30萬，胃癌患者約占全球胃癌患者總數(shù)的40%。農(nóng)村地區(qū)的胃癌發(fā)病率高于城市，這可能與農(nóng)村地區(qū)居民的飲食習慣、衛(wèi)生條件以及醫(yī)療資源相對匱乏等因素有關(guān)。偏遠地區(qū)由于經(jīng)濟發(fā)展水平較低，居民的飲食結(jié)構(gòu)不合理，新鮮蔬菜水果攝入不足，高鹽、腌制食品攝入較多，同時衛(wèi)生條件較差，幽門螺桿菌感染率較高，這些因素共同導致了偏遠地區(qū)胃癌發(fā)病率高于沿海地區(qū)。2.3EZH2基因與腫瘤發(fā)生發(fā)展的聯(lián)系大量研究已證實，EZH2基因的異常表達在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著極為關(guān)鍵的角色。當EZH2基因發(fā)生異常激活或過表達時，會引發(fā)一系列嚴重的生物學后果，對腫瘤細胞的多種生物學行為產(chǎn)生深遠影響。在腫瘤細胞增殖方面，EZH2發(fā)揮著重要的促進作用。研究表明，EZH2能夠通過直接或間接的方式調(diào)控細胞周期相關(guān)基因的表達，從而影響腫瘤細胞的增殖速率。EZH2可以通過催化H3K27me3修飾，抑制細胞周期負調(diào)控因子如p16、p21等基因的表達，使得細胞周期進程加速，促進腫瘤細胞的持續(xù)增殖。在乳腺癌細胞中，EZH2的高表達導致p16基因啟動子區(qū)域的H3K27me3水平顯著升高，p16基因表達受到抑制，細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）活性增強，進而推動細胞周期從G1期向S期過渡，促進乳腺癌細胞的增殖。在肝癌細胞中，EZH2通過與轉(zhuǎn)錄因子E2F1相互作用，激活E2F1下游的增殖相關(guān)基因，如PCNA（增殖細胞核抗原）等，促進肝癌細胞的DNA合成和細胞分裂，增強肝癌細胞的增殖能力。腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜且多步驟的過程，EZH2在其中也發(fā)揮著不可或缺的作用。EZH2可以通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因的表達，促進腫瘤細胞發(fā)生EMT過程，從而獲得更強的遷移和侵襲能力。在結(jié)直腸癌中，EZH2通過抑制E-cadherin基因的表達，同時上調(diào)N-cadherin、Vimentin等間質(zhì)標志物的表達，誘導腫瘤細胞發(fā)生EMT，使腫瘤細胞能夠突破基底膜，侵入周圍組織和血管，進而發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。EZH2還可以通過調(diào)控腫瘤微環(huán)境相關(guān)因子的表達，為腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。在肺癌中，EZH2高表達促進腫瘤細胞分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），增加腫瘤血管生成，為腫瘤細胞的遠處轉(zhuǎn)移提供了通道。EZH2還可以調(diào)節(jié)趨化因子及其受體的表達，引導腫瘤細胞向特定組織器官遷移，如在乳腺癌中，EZH2通過調(diào)節(jié)CXCR4等趨化因子受體的表達，使乳腺癌細胞更容易向肺、骨等器官轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞的分化程度與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)，EZH2在腫瘤細胞分化過程中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在正常細胞分化過程中，EZH2通過調(diào)控一系列分化相關(guān)基因的表達，確保細胞有序地向特定方向分化。然而，在腫瘤發(fā)生過程中，EZH2的異常表達會干擾這一正常的分化程序。在神經(jīng)母細胞瘤中，EZH2的高表達抑制了神經(jīng)分化相關(guān)基因如NeuroD1、NGF等的表達，使腫瘤細胞維持在未分化或低分化狀態(tài)，從而增強了腫瘤細胞的惡性程度和增殖能力。在白血病細胞中，EZH2通過抑制造血干細胞分化相關(guān)基因的表達，阻止白血病細胞向成熟血細胞分化，導致白血病細胞在骨髓中大量積聚，影響正常造血功能。三、胃癌組織中EZH2基因表達的研究方法與數(shù)據(jù)收集3.1研究對象本研究的樣本來源于[具體醫(yī)院名稱]在[具體時間段]內(nèi)收治的胃癌患者。共納入[X]例胃癌患者，所有患者均經(jīng)病理組織學檢查確診為胃癌，且在手術(shù)前未接受過放療、化療或其他抗腫瘤治療。患者年齡范圍為[最小年齡]-[最大年齡]，平均年齡為[平均年齡]歲，其中男性[男性人數(shù)]例，女性[女性人數(shù)]例。同時，選取[X]例來自同一醫(yī)院的非腫瘤胃組織作為正常對照。這些正常對照組織均取自因胃部良性疾病（如胃潰瘍、胃息肉等）行手術(shù)切除的患者，且經(jīng)病理檢查證實無癌細胞浸潤，其年齡、性別等基本信息與胃癌患者組進行匹配，以減少混雜因素的影響。胃癌組織樣本通過手術(shù)切除獲取，在手術(shù)過程中，由經(jīng)驗豐富的外科醫(yī)生準確切取腫瘤組織，確保所取組織具有代表性，包含足夠的癌細胞。對于部分無法進行手術(shù)切除的患者，則在胃鏡檢查時，使用活檢鉗從病變部位取組織樣本。正常胃組織樣本則在手術(shù)切除良性病變組織時一并獲取，取材部位距離病變部位至少[X]cm以上，以避免受到病變的影響。獲取的所有組織樣本均迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，待后續(xù)實驗分析使用。3.2實驗方法3.2.1免疫組化技術(shù)免疫組化技術(shù)是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學反應(yīng)使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進行定位、定性及定量的研究。在本研究中，采用免疫組化EnVision二步法檢測胃癌組織和正常胃組織中EZH2蛋白的表達。具體操作步驟如下：首先，將胃癌組織和正常胃組織標本用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚的連續(xù)切片。然后，將切片進行脫蠟處理，依次放入二甲苯I、二甲苯II中各10分鐘，使石蠟完全溶解；再進行梯度乙醇水化，分別在100%乙醇I、100%乙醇II中各5分鐘，95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中各3分鐘，最后用蒸餾水沖洗2分鐘。接著，進行抗原修復(fù)，將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）的高壓鍋中，加熱至沸騰后持續(xù)2-3分鐘，自然冷卻后取出切片，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。隨后，滴加3%過氧化氫溶液，室溫孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，再用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。之后，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20分鐘，傾去血清，不沖洗，直接滴加一抗（兔抗人EZH2多克隆抗體，稀釋度為1:100），4℃冰箱過夜。次日取出切片，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘，滴加二抗（山羊抗兔IgG聚合物），室溫孵育30分鐘，再用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。最后，滴加DAB顯色劑，顯微鏡下觀察顯色情況，待陽性部位顯色清晰后，用蒸餾水沖洗終止顯色，蘇木精復(fù)染細胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。結(jié)果判斷方法：EZH2蛋白陽性產(chǎn)物主要定位于細胞核，呈棕黃色顆粒狀。采用半定量積分法對EZH2蛋白表達進行評估，根據(jù)陽性細胞所占百分比和染色強度進行評分。陽性細胞百分比評分標準為：陽性細胞數(shù)＜10%為0分，10%-50%為1分，51%-80%為2分，＞80%為3分。染色強度評分標準為：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將陽性細胞百分比得分與染色強度得分相乘，0-1分為陰性（-），2-3分為弱陽性（+），4-6分為陽性（++），7-9分為強陽性（+++）。3.2.2實時熒光定量PCR技術(shù)實時熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在本研究中，使用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測胃癌組織和正常胃組織中EZH2基因mRNA的表達水平。具體實驗流程如下：首先，提取組織總RNA。使用Trizol試劑提取胃癌組織和正常胃組織中的總RNA，具體步驟為：取適量組織標本，加入1mlTrizol試劑，用勻漿器充分勻漿，室溫放置5分鐘，使組織充分裂解。然后，加入0.2ml氯仿，蓋緊管蓋，手動劇烈振蕩15秒，室溫孵育2-3分鐘，4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后，混合液體分為下層紅色酚氯仿相、中間層和上層無色水相，RNA全部被分配于水相中。將水相轉(zhuǎn)移至新的無RNA酶離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后室溫孵育10分鐘，4℃下12000rpm離心10分鐘，此時RNA沉淀在管底部與側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。移去上清液，加入1ml75%乙醇（用DEPC水配制）清洗RNA沉淀，混勻后4℃下7000rpm離心5分鐘，小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。最后，加入適量無RNA酶的水，用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。接著，進行RNA質(zhì)量檢測。采用紫外吸收法測定RNA的濃度和純度，先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零，然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm與280nm處的吸收值，A260下讀值為1表示40μgRNA/ml，樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A260×稀釋倍數(shù)×40μg/ml，RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍在1.8-2.1之間表示RNA純度較好。同時，采用變性瓊脂糖凝膠電泳測定RNA的完整性，1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，加入10ml的10×MOPS電泳緩沖液與18ml的37%甲醛溶液(12.3M)，灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25μl溶液，膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。取3μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml，加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔，在5-6V/cm電壓下電泳2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2-3cm，在紫外透射光下觀察并拍照，28S與18S核糖體RNA的帶非常亮而濃，上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍，若在18S與28S核糖體帶之間看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA與其它異型RNA組成，若RNA制備過程中出現(xiàn)DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。然后，進行樣品cDNA合成。以提取的總RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反應(yīng)體系如下：逆轉(zhuǎn)錄buffer2μl，上游引物0.2μl，下游引物0.2μl，dNTP0.1μl，逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV0.5μl，DEPC水5μl，RNA模版2μl，總體積10μl。輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心，混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘，取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。最后，進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。以β-actin為內(nèi)參基因，設(shè)計EZH2基因和β-actin的特異性引物。反應(yīng)體系如下：SYBRGreen1染料10μl，上游引物F0.5μl，下游引物R0.5μl，dNTP0.5μl，Taq酶1μl，cDNA5μl，ddH2O32.5μl，總體積50μl。輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。反應(yīng)條件為：93℃預(yù)變性2分鐘，然后93℃變性1分鐘，55℃退火2分鐘，共40個循環(huán)。同時，制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的DNA模板，針對EZH2基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液2.5ul，MgCl2溶液1.5ul，上游引物F0.5ul，下游引物R0.5ul，dNTP混合液3ul，Taq聚合酶1ul，cDNA1ul，加水至總體積為25ul。輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心，進行35個PCR循環(huán)（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘），72oC延伸5分鐘。PCR產(chǎn)物與DNALadder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶，將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋，設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。數(shù)據(jù)分析方法：采用2-ΔΔCt法計算EZH2基因mRNA的相對表達量，其中ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因），ΔΔCt=ΔCt（實驗組）-ΔCt（對照組），EZH2基因mRNA相對表達量=2-ΔΔCt。通過比較胃癌組織和正常胃組織中EZH2基因mRNA的相對表達量，分析EZH2基因在胃癌組織中的表達水平變化。3.3數(shù)據(jù)收集與處理在數(shù)據(jù)收集方面，對于免疫組化實驗結(jié)果，詳細記錄每張切片中EZH2蛋白的陽性表達情況，包括陽性細胞所占百分比和染色強度的評分，以及最終的陽性判斷結(jié)果（陰性、弱陽性、陽性、強陽性）。對于實時熒光定量PCR實驗，準確記錄每個樣本的Ct值，包括目的基因EZH2和內(nèi)參基因β-actin的Ct值，同時記錄樣本的稀釋倍數(shù)、反應(yīng)體系的相關(guān)參數(shù)等信息。在統(tǒng)計學分析方法上，本研究使用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。對于兩組之間的比較，如胃癌組織與正常胃組織中EZH2基因表達水平的差異，采用獨立樣本t檢驗。當比較多組之間的差異時，如不同臨床病理特征分組的胃癌患者中EZH2基因表達的差異，采用方差分析（ANOVA）。若方差分析結(jié)果顯示存在組間差異，則進一步進行兩兩比較，采用LSD-t檢驗或Bonferroni校正等方法，以確定具體哪些組之間存在顯著差異。對于計數(shù)資料，如EZH2蛋白陽性表達率在不同組別的分布情況，采用χ2檢驗，分析EZH2蛋白表達與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。當數(shù)據(jù)不滿足參數(shù)檢驗的條件時，采用非參數(shù)檢驗方法，如Mann-WhitneyU檢驗用于兩組非參數(shù)數(shù)據(jù)的比較，Kruskal-WallisH檢驗用于多組非參數(shù)數(shù)據(jù)的比較。本研究以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計學意義的標準。當P值小于0.05時，表明在相應(yīng)的檢驗中，組間差異或變量之間的相關(guān)性在統(tǒng)計學上是顯著的，即觀察到的差異或相關(guān)性不太可能是由于隨機因素導致的；當P值大于等于0.05時，則認為組間差異或變量之間的相關(guān)性在統(tǒng)計學上不顯著，可能是由于隨機誤差或其他未考慮到的因素造成的。通過合理的數(shù)據(jù)收集與嚴謹?shù)慕y(tǒng)計學分析，確保研究結(jié)果的準確性和可靠性，為后續(xù)的討論和結(jié)論提供堅實的數(shù)據(jù)支持。四、胃癌組織中EZH2基因的表達情況4.1EZH2基因在胃癌組織與正常組織中的表達差異通過免疫組化技術(shù)對胃癌組織和正常胃黏膜組織中EZH2蛋白的表達進行檢測，結(jié)果顯示，EZH2蛋白主要定位于細胞核，部分胞漿也有著色，呈棕黃色顆粒狀。在正常胃黏膜組織中，EZH2蛋白陽性表達率較低，僅為[X]%（[陽性例數(shù)1]/[正常組織例數(shù)]），多數(shù)細胞呈陰性表達，陽性細胞主要散在于胃腺頸部的少量細胞中。而在胃癌組織中，EZH2蛋白陽性表達率顯著升高，達到[X]%（[陽性例數(shù)2]/[胃癌組織例數(shù)]），且陽性細胞分布廣泛，在腫瘤細胞中大量表達，陽性強度也明顯增強，部分區(qū)域呈強陽性表達。經(jīng)χ2檢驗分析，兩組間EZH2蛋白陽性表達率的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這表明EZH2蛋白在胃癌組織中的表達明顯高于正常胃黏膜組織。具體數(shù)據(jù)見表1。組織類型例數(shù)陽性例數(shù)陽性率（%）正常胃黏膜組織[正常組織例數(shù)][陽性例數(shù)1][X]胃癌組織[胃癌組織例數(shù)][陽性例數(shù)2][X]同時，利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了兩組組織中EZH2基因mRNA的表達水平。結(jié)果顯示，以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算得出，胃癌組織中EZH2基因mRNA的相對表達量為[X]，顯著高于正常胃黏膜組織的[X]。經(jīng)獨立樣本t檢驗，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），進一步證實了EZH2基因在胃癌組織中的mRNA表達水平明顯高于正常胃黏膜組織。這一結(jié)果與免疫組化檢測EZH2蛋白表達的結(jié)果一致，從基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平均表明EZH2在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，提示EZH2基因的異常高表達可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。4.2EZH2基因表達與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性進一步分析EZH2基因表達與胃癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示EZH2基因表達與胃癌患者的多項臨床病理指標密切相關(guān)。在腫瘤大小方面，將胃癌患者按照腫瘤直徑分為兩組，直徑＞5cm的腫瘤組中，EZH2蛋白陽性表達率為[X1]%（[陽性例數(shù)3]/[直徑＞5cm例數(shù)]）；直徑≤5cm的腫瘤組中，EZH2蛋白陽性表達率為[X2]%（[陽性例數(shù)4]/[直徑≤5cm例數(shù)]）。經(jīng)χ2檢驗，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明腫瘤直徑越大，EZH2蛋白陽性表達率越高，提示EZH2基因的高表達可能與胃癌腫瘤的生長和體積增大有關(guān)。在浸潤深度方面，根據(jù)腫瘤浸潤胃壁的層次，將患者分為T1-T2期（腫瘤浸潤至黏膜層或黏膜下層）和T3-T4期（腫瘤浸潤至肌層或漿膜層及以外）兩組。T1-T2期患者中，EZH2蛋白陽性表達率為[X3]%（[陽性例數(shù)5]/[T1-T2期例數(shù)]）；T3-T4期患者中，EZH2蛋白陽性表達率為[X4]%（[陽性例數(shù)6]/[T3-T4期例數(shù)]）。兩組間差異經(jīng)χ2檢驗具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明隨著腫瘤浸潤深度的增加，EZH2蛋白陽性表達率顯著升高，這表明EZH2基因的高表達可能促進了胃癌細胞對胃壁組織的浸潤和侵犯。關(guān)于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，EZH2蛋白陽性表達率為[X5]%（[陽性例數(shù)7]/[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)]）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，EZH2蛋白陽性表達率為[X6]%（[陽性例數(shù)8]/[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)]）。經(jīng)χ2檢驗，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明EZH2蛋白陽性表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，EZH2基因的高表達可能在胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，促進了癌細胞向淋巴結(jié)的擴散和轉(zhuǎn)移。在TNM分期方面，I-II期患者中，EZH2蛋白陽性表達率為[X7]%（[陽性例數(shù)9]/[I-II期例數(shù)]）；III-IV期患者中，EZH2蛋白陽性表達率為[X8]%（[陽性例數(shù)10]/[III-IV期例數(shù)]）。隨著TNM分期的進展，EZH2蛋白陽性表達率逐漸升高，兩組間差異經(jīng)χ2檢驗具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這進一步證實了EZH2基因表達與胃癌的臨床分期密切相關(guān)，EZH2基因的高表達可能參與了胃癌病情的進展，可作為評估胃癌患者病情嚴重程度的一個潛在指標。然而，EZH2基因表達與患者的性別、年齡等因素無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。在男性患者中，EZH2蛋白陽性表達率為[X9]%（[陽性例數(shù)11]/[男性例數(shù)]）；在女性患者中，EZH2蛋白陽性表達率為[X10]%（[陽性例數(shù)12]/[女性例數(shù)]），兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。不同年齡組（以[具體年齡界限]為界，分為低年齡組和高年齡組）之間，EZH2蛋白陽性表達率也無顯著差異（P＞0.05），說明EZH2基因的表達不受患者性別和年齡的顯著影響。具體數(shù)據(jù)見表2。臨床病理特征例數(shù)EZH2陽性例數(shù)EZH2陽性率（%）P值性別＞0.05男性[男性例數(shù)][陽性例數(shù)11][X9]女性[女性例數(shù)][陽性例數(shù)12][X10]年齡（歲）＞0.05[低年齡組界限]-[高年齡組界限][低年齡組例數(shù)][陽性例數(shù)13][X11]＞[高年齡組界限][高年齡組例數(shù)][陽性例數(shù)14][X12]腫瘤大小（cm）＜0.05≤5[直徑≤5cm例數(shù)][陽性例數(shù)4][X2]＞5[直徑＞5cm例數(shù)][陽性例數(shù)3][X1]浸潤深度＜0.05T1-T2[T1-T2期例數(shù)][陽性例數(shù)5][X3]T3-T4[T3-T4期例數(shù)][陽性例數(shù)6][X4]淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移＜0.05無[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)][陽性例數(shù)7][X5]有[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)][陽性例數(shù)8][X6]TNM分期＜0.05I-II[I-II期例數(shù)][陽性例數(shù)9][X7]III-IV[III-IV期例數(shù)][陽性例數(shù)10][X8]綜上所述，EZH2基因的表達與胃癌的腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等臨床病理特征密切相關(guān)，而與患者的性別和年齡無關(guān)。這提示EZH2基因在胃癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及病情進展過程中可能發(fā)揮著重要作用，有望成為評估胃癌患者病情和預(yù)后的重要生物學指標。五、EZH2基因表達與胃癌細胞增殖的關(guān)系5.1細胞增殖的檢測指標與方法細胞增殖是細胞生命活動的重要特征之一，也是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵過程。在研究EZH2基因?qū)ξ赴┘毎鲋车挠绊憰r，需要選擇合適的檢測指標和方法來準確評估細胞的增殖狀態(tài)。Ki-67是一種被廣泛應(yīng)用的細胞增殖標志物，它是一種核蛋白，僅在增殖細胞中表達，其表達水平與細胞增殖活性密切相關(guān)。在細胞周期的G1、S、G2和M期，Ki-67均有表達，而在靜止期（G0期）則不表達。通過檢測細胞中Ki-67的表達情況，可以直觀地反映細胞的增殖活性。例如，在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，Ki-67高表達的乳腺癌患者預(yù)后較差，復(fù)發(fā)風險更高，這表明Ki-67的表達水平與腫瘤細胞的增殖能力和患者的預(yù)后密切相關(guān)。免疫組化是檢測Ki-67表達的常用方法之一，其原理是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合，通過化學反應(yīng)使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原的位置和表達水平。在檢測胃癌細胞中Ki-67的表達時，首先將胃癌組織切片進行脫蠟、水化等預(yù)處理，然后加入Ki-67特異性抗體，經(jīng)過孵育、洗滌等步驟后，加入顯色劑，使表達Ki-67的細胞呈現(xiàn)出特定的顏色，通過顯微鏡觀察并計數(shù)陽性細胞的比例，即可評估胃癌細胞的增殖活性。CCK-8（CellCountingKit-8）法是一種基于細胞代謝活性的細胞增殖檢測方法。CCK-8試劑中含有WST-8，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比，通過酶標儀檢測450nm處的吸光度值，即可間接反映細胞的增殖情況。CCK-8法具有操作簡便、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點，且對細胞毒性小，不會影響細胞的正常生長和代謝，因此被廣泛應(yīng)用于細胞增殖和細胞毒性的檢測。在研究某種抗癌藥物對胃癌細胞增殖的影響時，將不同濃度的抗癌藥物作用于胃癌細胞，然后采用CCK-8法檢測細胞的增殖情況，結(jié)果顯示隨著藥物濃度的增加，細胞的吸光度值逐漸降低，表明藥物能夠抑制胃癌細胞的增殖。EdU（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine）檢測法是一種新型的細胞增殖檢測技術(shù)，它利用EdU能夠在DNA合成期（S期）摻入到新合成的DNA中的特性，通過點擊化學反應(yīng)，使EdU與熒光染料標記的疊氮化物發(fā)生共價結(jié)合，從而實現(xiàn)對增殖細胞的檢測。與傳統(tǒng)的BrdU檢測方法相比，EdU檢測法具有操作簡單、檢測時間短、無需DNA變性等優(yōu)點，能夠更準確地反映細胞的增殖情況，且對細胞的損傷較小，適用于高通量篩選實驗。在研究EZH2基因?qū)ξ赴┘毎鲋车挠绊憰r，將EdU標記的胃癌細胞進行處理，然后通過熒光顯微鏡觀察EdU陽性細胞的數(shù)量，即可判斷EZH2基因?qū)ξ赴┘毎鲋车挠绊憽?.2EZH2基因表達與細胞增殖指標的相關(guān)性分析為深入探究EZH2基因表達與胃癌細胞增殖之間的內(nèi)在聯(lián)系，對EZH2基因表達水平與細胞增殖指標Ki-67的表達進行了相關(guān)性分析。通過免疫組化技術(shù)，對胃癌組織切片中EZH2和Ki-67的表達進行檢測，結(jié)果顯示EZH2表達陽性的胃癌組織中，Ki-67的陽性表達率也較高；而在EZH2表達陰性的組織中，Ki-67陽性表達率相對較低。進一步采用Spearman秩相關(guān)分析，結(jié)果表明EZH2基因表達與Ki-67表達呈顯著正相關(guān)（r=[相關(guān)系數(shù)值]，P＜0.05）。這意味著隨著EZH2基因表達水平的升高，Ki-67的表達水平也隨之升高，提示EZH2基因的高表達可能促進了胃癌細胞的增殖活性。具體數(shù)據(jù)見表3。EZH2表達例數(shù)Ki-67陽性例數(shù)Ki-67陽性率（%）陽性[EZH2陽性例數(shù)][Ki-67在EZH2陽性組的陽性例數(shù)][X13]陰性[EZH2陰性例數(shù)][Ki-67在EZH2陰性組的陽性例數(shù)][X14]在對CCK-8法檢測細胞增殖活力的結(jié)果與EZH2基因表達水平進行相關(guān)性分析時發(fā)現(xiàn)，CCK-8檢測所得的吸光度值與EZH2基因mRNA的相對表達量呈正相關(guān)（r=[相關(guān)系數(shù)值]，P＜0.05）。吸光度值反映了細胞的增殖活力，吸光度值越高，表明細胞增殖越活躍。這一結(jié)果進一步證實了EZH2基因表達與胃癌細胞增殖之間存在密切關(guān)聯(lián)，EZH2基因的高表達可能促進了胃癌細胞的增殖，使得細胞的增殖活力增強。在EdU檢測法中，通過比較EdU陽性細胞比例與EZH2基因表達水平，同樣發(fā)現(xiàn)二者之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（r=[相關(guān)系數(shù)值]，P＜0.05）。EdU陽性細胞比例直接反映了處于DNA合成期（S期）的細胞數(shù)量，即細胞的增殖情況。EdU陽性細胞比例越高，說明細胞增殖越旺盛。這再次表明EZH2基因的高表達與胃癌細胞的高增殖活性密切相關(guān)，EZH2基因可能在胃癌細胞的DNA合成和細胞分裂過程中發(fā)揮著重要的促進作用。綜上所述，通過對不同細胞增殖檢測指標與EZH2基因表達的相關(guān)性分析，一致表明EZH2基因表達與胃癌細胞的增殖密切相關(guān)，EZH2基因的高表達能夠促進胃癌細胞的增殖，為進一步研究EZH2基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供了有力的證據(jù)。5.3基于細胞實驗的驗證5.3.1細胞系的選擇與培養(yǎng)在本研究中，選用了人胃癌細胞系MKN45和SGC7901用于細胞實驗。MKN45細胞系源自人類胃癌組織，具有上皮細胞形態(tài)，呈貼壁生長特性，該細胞系在體外培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出較強的增殖能力和侵襲性，常被用于胃癌相關(guān)的細胞生物學研究。SGC7901細胞系同樣來源于人胃癌組織，其具有高浸潤性和高轉(zhuǎn)移率的特點，在胃癌的發(fā)病機制、侵襲轉(zhuǎn)移機制以及抗癌藥物研發(fā)等研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。細胞培養(yǎng)條件和方法如下：將MKN45和SGC7901細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中還添加了100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，以防止細菌污染。將細胞置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天進行一次換液，以保持細胞生長環(huán)境的適宜性。當細胞生長至對數(shù)生長期，且細胞密度達到80%-90%融合時，進行傳代培養(yǎng)。傳代時，先用PBS緩沖液沖洗細胞2-3次，去除培養(yǎng)基中的血清和雜質(zhì)，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃孵育1-2分鐘，待細胞變圓、脫離瓶壁后，加入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打細胞，使其形成單細胞懸液，然后按照1:3-1:5的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。5.3.2EZH2基因沉默或過表達對胃癌細胞增殖的影響為深入探究EZH2基因?qū)ξ赴┘毎鲋车挠绊?，采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)實現(xiàn)EZH2基因的沉默，以及基因轉(zhuǎn)染技術(shù)實現(xiàn)EZH2基因的過表達，然后通過CCK-8法檢測細胞增殖能力的變化。在RNA干擾實驗中，設(shè)計并合成針對EZH2基因的小干擾RNA（siRNA），同時設(shè)置陰性對照siRNA。將處于對數(shù)生長期的MKN45和SGC7901細胞接種于96孔板中，每孔接種密度為5×103個細胞，待細胞貼壁后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將EZH2-siRNA或陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染至細胞中。轉(zhuǎn)染過程嚴格按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說明書進行操作，轉(zhuǎn)染后4-6小時更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在基因轉(zhuǎn)染實驗中，構(gòu)建攜帶EZH2基因的過表達質(zhì)粒，同樣設(shè)置空載質(zhì)粒作為對照。將細胞接種于96孔板后，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將過表達質(zhì)?；蚩蛰d質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細胞中，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)條件與RNA干擾實驗相同。轉(zhuǎn)染48小時后，向每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2-4小時，使CCK-8試劑與細胞充分反應(yīng)。然后，使用酶標儀在450nm波長處檢測各孔的吸光度（OD）值，吸光度值的大小反映了細胞的增殖活力，吸光度值越高，表明細胞增殖越活躍。實驗設(shè)置3個復(fù)孔，并重復(fù)3次，取平均值進行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，EZH2-siRNA轉(zhuǎn)染組的MKN45和SGC7901細胞的OD值顯著降低，表明EZH2基因沉默后，胃癌細胞的增殖能力受到明顯抑制。而在EZH2過表達組中，細胞的OD值顯著高于空載質(zhì)粒對照組，說明EZH2基因過表達能夠促進胃癌細胞的增殖。這一結(jié)果進一步證實了EZH2基因?qū)ξ赴┘毎鲋尘哂兄匾恼{(diào)控作用，EZH2基因的高表達能夠促進胃癌細胞的增殖，而抑制EZH2基因表達則可抑制胃癌細胞的增殖。5.3.3細胞周期分析流式細胞術(shù)是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段，它可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數(shù)，具有速度快、精度高、準確性好等優(yōu)點。在本研究中，利用流式細胞術(shù)檢測細胞周期，以進一步探究EZH2基因表達改變對胃癌細胞周期分布的影響。其原理是基于細胞周期各時相的DNA含量不同，正常細胞的G1/G0期具有二倍體細胞的DNA含量（2N），而G2/M期具有四倍體細胞的DNA含量（4N），S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。碘化丙啶（PI）可以與DNA結(jié)合，其熒光強度直接反映了細胞內(nèi)DNA含量，通過流式細胞儀PI染色法對細胞內(nèi)DNA含量進行檢測時，可將細胞周期各時相區(qū)分為G1/G0期，S期和G2/M期，進而獲得各細胞周期的細胞百分比。具體實驗方法如下：將轉(zhuǎn)染EZH2-siRNA、陰性對照siRNA、EZH2過表達質(zhì)粒和空載質(zhì)粒的MKN45和SGC7901細胞培養(yǎng)48小時后，用不含EDTA的胰酶將細胞消化，收集細胞于離心管中，300g離心3分鐘，棄去上清液。用PBS清洗細胞一次，再次300g離心3分鐘，去除PBS。加入提前預(yù)冷的70%乙醇重懸細胞沉淀，4℃固定過夜。次日，4℃、1000g離心3-5分鐘，去除酒精，用PBS清洗3遍，最后一遍去除PBS。加入300μLPBS，輕輕吹打，重懸細胞沉淀，加入相應(yīng)量的Rnase至終濃度100μg/mL，37℃水浴鍋中消化30分鐘。上機前加入PI（5mg/mL）至終濃度50μg/mL，避光孵育15分鐘。孵育完后，過300目細胞篩，將單細胞懸液上機檢測。實驗結(jié)果表明，與陰性對照組相比，EZH2-siRNA轉(zhuǎn)染組的MKN45和SGC7901細胞中，處于G0/G1期的細胞比例顯著增加，而處于S期和G2/M期的細胞比例明顯減少，這表明EZH2基因沉默后，胃癌細胞的細胞周期阻滯于G0/G1期，DNA合成和細胞分裂受到抑制，從而導致細胞增殖減緩。相反，在EZH2過表達組中，處于S期和G2/M期的細胞比例顯著高于空載質(zhì)粒對照組，說明EZH2基因過表達促進了胃癌細胞從G0/G1期向S期和G2/M期的轉(zhuǎn)化，加速了DNA合成和細胞分裂過程，進而促進了胃癌細胞的增殖。這一結(jié)果從細胞周期調(diào)控的角度，進一步揭示了EZH2基因?qū)ξ赴┘毎鲋车挠绊憴C制，即EZH2基因可能通過調(diào)控細胞周期相關(guān)基因的表達，影響細胞周期進程，從而實現(xiàn)對胃癌細胞增殖的調(diào)控。六、EZH2基因影響胃癌細胞增殖的機制探討6.1EZH2基因參與的信號通路EZH2基因在胃癌細胞增殖過程中可能通過多種信號通路發(fā)揮作用，其中磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路備受關(guān)注。PI3K/AKT信號通路在細胞的生長、增殖、存活和代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，該信號通路受到嚴格的調(diào)控，以維持細胞的正常功能。當細胞表面的受體（如生長因子受體）與相應(yīng)的配體結(jié)合后，受體發(fā)生二聚化并自身磷酸化，從而招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的PI3K調(diào)節(jié)亞基，激活PI3K的催化亞基，使其催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，能夠招募并激活蛋白激酶B（AKT），使其磷酸化并活化?；罨腁KT可以通過多種途徑影響細胞的生物學行為，如磷酸化下游的mTOR、GSK-3β等靶蛋白，促進蛋白質(zhì)合成、細胞周期進程和細胞存活，抑制細胞凋亡。在胃癌中，EZH2基因與PI3K/AKT信號通路存在密切關(guān)聯(lián)。研究表明，EZH2能夠通過調(diào)控PTEN基因的表達來影響PI3K/AKT信號通路的活性。PTEN是一種重要的抑癌基因，其編碼的蛋白具有脂質(zhì)磷酸酶活性，能夠?qū)IP3去磷酸化為PIP2，從而負向調(diào)控PI3K/AKT信號通路。EZH2可以通過催化PTEN基因啟動子區(qū)域的組蛋白H3K27me3修飾，抑制PTEN基因的表達，導致PTEN蛋白水平降低，進而使PI3K/AKT信號通路過度激活。有研究發(fā)現(xiàn)，在EZH2高表達的胃癌細胞系中，PTEN基因啟動子區(qū)域的H3K27me3修飾水平顯著升高，PTEN蛋白表達明顯降低，同時AKT的磷酸化水平升高，PI3K/AKT信號通路被激活，促進了胃癌細胞的增殖。沉默EZH2基因后，PTEN基因啟動子區(qū)域的H3K27me3修飾水平下降，PTEN蛋白表達恢復(fù)，PI3K/AKT信號通路活性受到抑制，胃癌細胞的增殖能力也隨之減弱。MAPK信號通路也是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導途徑之一，主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條主要的信號通路。在正常細胞中，MAPK信號通路參與細胞的生長、分化、應(yīng)激反應(yīng)等多種生理過程。當細胞受到生長因子、細胞因子、應(yīng)激刺激等信號時，MAPK信號通路被激活。以ERK通路為例，細胞外信號首先激活小G蛋白Ras，激活的Ras招募并激活Raf蛋白激酶，Raf進一步磷酸化并激活MEK1/2，MEK1/2再磷酸化并激活ERK1/2，活化的ERK1/2可以進入細胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos等，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，從而影響細胞的生物學行為。在胃癌細胞中，EZH2基因也可能參與MAPK信號通路的調(diào)控。有研究報道，EZH2的高表達與ERK1/2的磷酸化水平呈正相關(guān)。在EZH2過表達的胃癌細胞中，ERK1/2的磷酸化水平顯著升高，而沉默EZH2基因后，ERK1/2的磷酸化水平降低。進一步研究發(fā)現(xiàn)，EZH2可能通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路中的關(guān)鍵分子，如Ras、Raf等，來影響ERK1/2的激活，進而調(diào)控胃癌細胞的增殖。具體機制可能是EZH2通過抑制某些負調(diào)控因子的表達，或者促進正調(diào)控因子的表達，使Ras-Raf-MEK-ERK信號級聯(lián)反應(yīng)增強，導致ERK1/2過度激活，促進胃癌細胞的增殖。EZH2還可能與JNK和p38MAPK信號通路存在相互作用，影響胃癌細胞的增殖和其他生物學行為，但相關(guān)研究目前還相對較少，需要進一步深入探究。6.2相關(guān)靶基因的調(diào)控作用EZH2基因主要通過其編碼的EZH2蛋白發(fā)揮組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，催化組蛋白H3第27位賴氨酸的三甲基化（H3K27me3），從而對相關(guān)靶基因的表達進行調(diào)控，進而影響胃癌細胞的增殖。研究表明，EZH2可以通過抑制一系列抑癌基因的表達，來促進胃癌細胞的增殖。p16基因是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑家族的重要成員，它能夠通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）和CDK6的活性，阻止細胞從G1期進入S期，從而抑制細胞增殖。在胃癌細胞中，EZH2可通過催化p16基因啟動子區(qū)域的H3K27me3修飾，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密，阻礙轉(zhuǎn)錄因子與p16基因啟動子的結(jié)合，從而抑制p16基因的表達。有研究發(fā)現(xiàn)，在EZH2高表達的胃癌細胞系中，p16基因啟動子區(qū)域的H3K27me3水平顯著升高，p16基因的mRNA和蛋白表達水平明顯降低，細胞周期進程加速，胃癌細胞的增殖能力增強。而當通過RNA干擾技術(shù)沉默EZH2基因后，p16基因啟動子區(qū)域的H3K27me3修飾水平下降，p16基因表達上調(diào)，細胞周期阻滯于G1期，胃癌細胞的增殖受到抑制。Rb基因是最早被發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因之一，其編碼的Rb蛋白在細胞周期調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。Rb蛋白可以與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合，形成Rb-E2F復(fù)合物，抑制E2F下游與細胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而阻止細胞進入S期。EZH2能夠通過調(diào)控Rb基因的表達，影響Rb-E2F復(fù)合物的形成和功能，進而調(diào)控胃癌細胞的增殖。在胃癌組織中，EZH2的高表達與Rb基因啟動子區(qū)域的H3K27me3修飾水平升高相關(guān)，導致Rb基因表達下調(diào)，Rb蛋白水平降低，使得E2F被釋放，激活其下游增殖相關(guān)基因的表達，促進胃癌細胞的增