免疫微環(huán)境視角下銀屑病“血熱證”的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制探秘一、引言1.1研究背景與意義1.1.1研究背景銀屑病作為一種常見的慢性炎癥性皮膚病，全球發(fā)病率約為2%-3%，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。在中國，銀屑病患病率約為0.47%，患者人數(shù)超過700萬，且近六成患者病情已發(fā)展至中重度。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳、免疫、環(huán)境等多個(gè)因素，其中免疫微環(huán)境的異常在銀屑病的發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用。免疫微環(huán)境是指免疫細(xì)胞、免疫分子以及細(xì)胞外基質(zhì)等共同構(gòu)成的局部微環(huán)境，它對(duì)免疫細(xì)胞的活化、增殖、分化和功能發(fā)揮具有重要調(diào)節(jié)作用。在銀屑病患者中，免疫微環(huán)境發(fā)生顯著改變，表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞的異?；罨约岸喾N細(xì)胞因子、趨化因子的過度表達(dá)，這些變化導(dǎo)致皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化異常，最終形成銀屑病的典型皮損。中醫(yī)將銀屑病分為多種證型，其中“血熱證”是銀屑病最常見的證型之一，約占銀屑病患者的30%-50%?！把獰嶙C”患者常表現(xiàn)為皮膚紅斑、鱗屑增多、瘙癢劇烈等癥狀，伴有口干舌燥、心煩易怒、大便秘結(jié)、小便黃赤等全身癥狀。中醫(yī)認(rèn)為，“血熱證”的發(fā)生是由于外感邪氣、情志內(nèi)傷、飲食不節(jié)等因素導(dǎo)致體內(nèi)血熱內(nèi)盛，熱邪熏蒸肌膚所致。然而，目前對(duì)于“血熱證”的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制尚不完全清楚，缺乏深入的研究。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，從細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)角度深入研究銀屑病“血熱證”的發(fā)病機(jī)制已成為可能。通過研究免疫微環(huán)境對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的影響，可以揭示“血熱證”的細(xì)胞生物學(xué)本質(zhì)，為銀屑病的中醫(yī)辨證論治提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也有助于開發(fā)新的治療方法和藥物。因此，本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.1.2研究意義從理論意義來看，深入探究免疫微環(huán)境對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的影響，有助于揭示銀屑病“血熱證”的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制，完善對(duì)銀屑病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。傳統(tǒng)中醫(yī)對(duì)銀屑病“血熱證”的認(rèn)識(shí)主要基于宏觀的臨床表現(xiàn)和中醫(yī)理論，缺乏微觀層面的科學(xué)闡釋。本研究將現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究方法與中醫(yī)理論相結(jié)合，從細(xì)胞和分子水平探討“血熱證”的發(fā)病機(jī)制，為中醫(yī)理論的現(xiàn)代化提供科學(xué)依據(jù)，促進(jìn)中西醫(yī)結(jié)合在銀屑病研究領(lǐng)域的發(fā)展。此外，研究免疫微環(huán)境與角質(zhì)形成細(xì)胞之間的相互作用，還可以豐富皮膚免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的理論知識(shí)，為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供新的思路和方法。在臨床應(yīng)用價(jià)值方面，明確銀屑病“血熱證”的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制，有助于制定更加精準(zhǔn)的治療策略。目前，銀屑病的治療方法眾多，但療效參差不齊，且存在一定的不良反應(yīng)。通過了解“血熱證”的發(fā)病機(jī)制，可以針對(duì)關(guān)鍵的病理環(huán)節(jié)進(jìn)行靶向治療，提高治療的有效性和安全性。例如，根據(jù)免疫微環(huán)境中異常表達(dá)的細(xì)胞因子和信號(hào)通路，研發(fā)特異性的抑制劑或調(diào)節(jié)劑，有望為銀屑病患者提供更加有效的治療手段。此外，本研究結(jié)果還可以為中醫(yī)藥治療銀屑病提供科學(xué)依據(jù)，優(yōu)化中藥方劑的配伍和應(yīng)用，提高中醫(yī)藥治療銀屑病的臨床療效。同時(shí)，對(duì)于銀屑病的早期診斷和病情監(jiān)測也具有重要意義，通過檢測免疫微環(huán)境中的相關(guān)指標(biāo)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)銀屑病“血熱證”的早期診斷和病情評(píng)估，及時(shí)調(diào)整治療方案，改善患者的預(yù)后。1.2研究目的本研究旨在從免疫微環(huán)境對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞影響的角度出發(fā)，深入探究銀屑病“血熱證”的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制，具體目的如下：明確免疫微環(huán)境與銀屑病“血熱證”的關(guān)聯(lián)：通過檢測銀屑病“血熱證”患者和健康對(duì)照者皮膚組織及外周血中免疫細(xì)胞的數(shù)量、比例和功能狀態(tài)，以及細(xì)胞因子、趨化因子等免疫分子的表達(dá)水平，分析免疫微環(huán)境在銀屑病“血熱證”中的特征性變化，明確免疫微環(huán)境與銀屑病“血熱證”的相關(guān)性。揭示免疫微環(huán)境對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的作用機(jī)制：利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建免疫微環(huán)境相關(guān)細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)體系，模擬體內(nèi)免疫微環(huán)境，觀察免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)行為的影響。運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，如基因芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Westernblot等，研究相關(guān)信號(hào)通路的激活情況，深入揭示免疫微環(huán)境對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的作用機(jī)制。篩選銀屑病“血熱證”的潛在生物標(biāo)志物：基于上述研究結(jié)果，篩選在免疫微環(huán)境和角質(zhì)形成細(xì)胞相互作用中起關(guān)鍵作用，且與銀屑病“血熱證”病情嚴(yán)重程度、治療反應(yīng)密切相關(guān)的分子，作為銀屑病“血熱證”的潛在生物標(biāo)志物。通過對(duì)大量臨床樣本的驗(yàn)證，評(píng)估這些生物標(biāo)志物在銀屑病“血熱證”診斷、病情監(jiān)測和預(yù)后判斷中的價(jià)值。為銀屑病“血熱證”的中西醫(yī)結(jié)合治療提供理論依據(jù)：結(jié)合中醫(yī)理論和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究成果，將本研究發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制與銀屑病“血熱證”的中醫(yī)辨證論治相結(jié)合，探討中醫(yī)藥治療銀屑病“血熱證”的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制，為開發(fā)基于中西醫(yī)結(jié)合的銀屑病治療新方法、新藥物提供理論依據(jù)，提高銀屑病的臨床治療水平。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀國外對(duì)銀屑病免疫和細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制的研究起步較早，取得了一系列重要成果。在免疫機(jī)制方面，大量研究表明，T淋巴細(xì)胞在銀屑病的發(fā)病中起著核心作用。Th1、Th17和Th22等細(xì)胞亞群分泌的細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）、白細(xì)胞介素-22（IL-22）等，可激活角質(zhì)形成細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和炎癥反應(yīng)。其中，IL-17被認(rèn)為是銀屑病發(fā)病過程中最重要的細(xì)胞因子之一，它能夠誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌多種趨化因子和促炎細(xì)胞因子，招募中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞到皮膚炎癥部位，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。此外，樹突狀細(xì)胞作為重要的抗原呈遞細(xì)胞，在銀屑病患者中也表現(xiàn)出功能異常，它們能夠激活初始T淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)免疫應(yīng)答，促進(jìn)銀屑病的發(fā)生發(fā)展。在細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制方面，研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者的角質(zhì)形成細(xì)胞存在增殖過度、分化異常和凋亡減少等現(xiàn)象。角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖異常與細(xì)胞周期調(diào)控因子的失衡密切相關(guān)，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的過度表達(dá)，可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。同時(shí)，角質(zhì)形成細(xì)胞的分化相關(guān)標(biāo)志物，如角蛋白10（K10）、絲聚蛋白（Filaggrin）等表達(dá)降低，導(dǎo)致表皮分化異常，形成銀屑病特有的鱗屑癥狀。此外，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族的表達(dá)失調(diào)，使得角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡減少，進(jìn)一步加重了表皮的增厚。國內(nèi)中醫(yī)對(duì)銀屑病“血熱證”的認(rèn)識(shí)歷史悠久，積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)。中醫(yī)認(rèn)為，“血熱證”是由于外感溫?zé)嶂?、情志?nèi)傷、飲食不節(jié)等因素，導(dǎo)致體內(nèi)血熱內(nèi)盛，熱邪熏蒸肌膚而發(fā)病。在治療方面，以清熱涼血解毒為主要治法，常用方劑如犀角地黃湯、涼血四物湯等，臨床療效顯著。近年來，國內(nèi)學(xué)者也從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度對(duì)銀屑病“血熱證”進(jìn)行了相關(guān)研究。在免疫方面，研究發(fā)現(xiàn)“血熱證”患者外周血中Th1、Th17細(xì)胞比例升高，IFN-γ、IL-17等細(xì)胞因子表達(dá)增加，與國外研究結(jié)果具有一定的一致性。同時(shí)，“血熱證”患者血清中免疫球蛋白IgA、IgG水平也明顯升高，提示體液免疫在“血熱證”的發(fā)病中也可能起到重要作用。在細(xì)胞生物學(xué)方面，有研究通過觀察“血熱證”患者皮膚組織中角質(zhì)形成細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等細(xì)胞器異常，提示細(xì)胞代謝功能紊亂。此外，運(yùn)用基因芯片技術(shù)對(duì)“血熱證”患者角質(zhì)形成細(xì)胞的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)多個(gè)與細(xì)胞增殖、分化、凋亡相關(guān)的基因表達(dá)異常，為深入研究“血熱證”的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制提供了新的線索。然而，目前國內(nèi)對(duì)于銀屑病“血熱證”的研究仍存在一些不足之處，如研究樣本量較小、研究方法不夠統(tǒng)一、對(duì)免疫微環(huán)境與角質(zhì)形成細(xì)胞之間的相互作用機(jī)制研究不夠深入等，需要進(jìn)一步加強(qiáng)相關(guān)研究。1.4研究方法和創(chuàng)新點(diǎn)1.4.1研究方法臨床樣本采集與檢測：收集銀屑病“血熱證”患者和健康對(duì)照者的皮膚組織及外周血樣本。采用免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)等方法，檢測皮膚組織和外周血中免疫細(xì)胞的數(shù)量、比例和功能狀態(tài)，如T淋巴細(xì)胞亞群、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)，檢測細(xì)胞因子、趨化因子等免疫分子的表達(dá)水平，如IFN-γ、IL-17、IL-22、CCL20等，分析免疫微環(huán)境在銀屑病“血熱證”中的特征性變化。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：進(jìn)行角質(zhì)形成細(xì)胞的體外培養(yǎng)，采用組織塊法或酶消化法從正常人皮膚組織中分離角質(zhì)形成細(xì)胞，在含有特定生長因子和營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其貼壁生長并傳代。構(gòu)建免疫微環(huán)境相關(guān)細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)體系，如將T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行直接共培養(yǎng)，或通過Transwell小室進(jìn)行間接共培養(yǎng)，模擬體內(nèi)免疫微環(huán)境。給予不同的刺激因素，如添加細(xì)胞因子、病原體相關(guān)分子模式等，觀察免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)行為的影響。采用CCK-8法、EdU染色法檢測角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力；通過免疫熒光染色檢測角質(zhì)形成細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物，如K10、Filaggrin等的表達(dá)；運(yùn)用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡情況。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測角質(zhì)形成細(xì)胞中與增殖、分化、凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，如CyclinD1、K10、Bcl-2等，分析免疫微環(huán)境對(duì)這些基因表達(dá)的調(diào)控作用。采用Westernblot技術(shù)，檢測相關(guān)信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和磷酸化水平，如ERK、JNK、p38MAPK等信號(hào)通路，深入探究免疫微環(huán)境對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的作用機(jī)制。利用基因芯片或RNA測序技術(shù)，全面分析免疫微環(huán)境作用下角質(zhì)形成細(xì)胞的基因表達(dá)譜變化，篩選差異表達(dá)基因，并通過生物信息學(xué)分析，富集相關(guān)信號(hào)通路和生物學(xué)過程，為進(jìn)一步研究提供線索。生物信息學(xué)分析：收集整理已有的銀屑病相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)、蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)等，結(jié)合本研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，運(yùn)用生物信息學(xué)工具進(jìn)行分析。通過基因富集分析（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析，挖掘與銀屑病“血熱證”相關(guān)的關(guān)鍵基因、信號(hào)通路和生物學(xué)過程。構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），篩選網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點(diǎn)基因，預(yù)測其在銀屑病“血熱證”發(fā)病機(jī)制中的作用。利用機(jī)器學(xué)習(xí)算法，如支持向量機(jī)（SVM）、隨機(jī)森林等，基于篩選出的差異表達(dá)基因和臨床指標(biāo)，構(gòu)建銀屑病“血熱證”的診斷模型和預(yù)后預(yù)測模型，評(píng)估模型的準(zhǔn)確性和可靠性。1.4.2創(chuàng)新點(diǎn)研究角度創(chuàng)新：從免疫微環(huán)境與角質(zhì)形成細(xì)胞相互作用的角度出發(fā)，探究銀屑病“血熱證”的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制，突破了以往單一從免疫因素或細(xì)胞生物學(xué)因素研究銀屑病的局限，為全面深入理解“血熱證”的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角。通過構(gòu)建體外免疫微環(huán)境模型，模擬體內(nèi)復(fù)雜的免疫微環(huán)境，能夠更直觀、準(zhǔn)確地觀察免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的作用，有助于揭示“血熱證”發(fā)生發(fā)展過程中免疫微環(huán)境與角質(zhì)形成細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)變化關(guān)系。研究方法創(chuàng)新：將中醫(yī)理論與現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)以及生物信息學(xué)分析相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)多學(xué)科交叉研究。在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，明確研究方向和重點(diǎn)，運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段深入探究“血熱證”的微觀機(jī)制，為中醫(yī)理論的科學(xué)闡釋提供了新的方法和思路。利用生物信息學(xué)分析整合大量的組學(xué)數(shù)據(jù)，挖掘潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，為銀屑病“血熱證”的精準(zhǔn)診斷和治療提供依據(jù)。通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法構(gòu)建診斷模型和預(yù)后預(yù)測模型，有助于實(shí)現(xiàn)銀屑病“血熱證”的早期診斷和個(gè)體化治療，提高臨床治療效果。理論創(chuàng)新：有望揭示銀屑病“血熱證”的細(xì)胞生物學(xué)本質(zhì)，豐富和完善中醫(yī)對(duì)“血熱證”的認(rèn)識(shí)，為中醫(yī)辨證論治提供科學(xué)依據(jù)，促進(jìn)中西醫(yī)結(jié)合在銀屑病治療領(lǐng)域的發(fā)展。研究結(jié)果可能發(fā)現(xiàn)新的信號(hào)通路和分子機(jī)制，為銀屑病的發(fā)病機(jī)制研究提供新的理論基礎(chǔ)，推動(dòng)皮膚免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展?；诒狙芯康陌l(fā)現(xiàn)，可能為開發(fā)新的治療方法和藥物提供理論指導(dǎo)，為銀屑病患者帶來新的治療希望。二、銀屑病及“血熱證”概述2.1銀屑病的基本情況銀屑病是一種由多因素誘導(dǎo)、多基因遺傳的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，其發(fā)病機(jī)制涉及遺傳、免疫、環(huán)境等多個(gè)方面。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球銀屑病患病率約為2%-3%，不同地區(qū)和種族之間存在一定差異。在中國，根據(jù)2017年的流行病學(xué)調(diào)查，銀屑病患病率約為0.47%，患者人數(shù)超過700萬，且呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢。銀屑病的分型較為復(fù)雜，臨床上主要分為尋常型、關(guān)節(jié)病型、膿皰型和紅皮病型四種類型。其中，尋常型銀屑病最為常見，約占銀屑病患者總數(shù)的90%以上。尋常型銀屑病通常急性發(fā)病，初期表現(xiàn)為紅色丘疹或斑丘疹，隨著病情進(jìn)展，逐漸擴(kuò)大或融合成邊界清晰的紅斑，表面覆蓋有多層銀白色鱗屑，刮除鱗屑后可見半透明薄膜，再刮除薄膜則出現(xiàn)點(diǎn)狀出血，這一特征被稱為Auspitz征，是尋常型銀屑病的典型表現(xiàn)。皮損可發(fā)生于全身各處，以頭皮、四肢伸側(cè)，如肘部、膝部等部位最為常見，且多呈對(duì)稱性分布。患者常伴有不同程度的瘙癢，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。關(guān)節(jié)病型銀屑病除了具有皮膚損害外，還會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)病變，可累及全身大小關(guān)節(jié)，以末端指（趾）節(jié)間關(guān)節(jié)病變最為特征性。關(guān)節(jié)癥狀與皮膚癥狀往往同時(shí)加重或減輕，患者表現(xiàn)為關(guān)節(jié)紅腫疼痛、活動(dòng)受限，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形，影響關(guān)節(jié)功能。約有10%-30%的銀屑病患者會(huì)并發(fā)關(guān)節(jié)病型銀屑病，其發(fā)病機(jī)制可能與遺傳、免疫異常以及炎癥因子的釋放等因素有關(guān)。膿皰型銀屑病相對(duì)少見，可分為泛發(fā)型和掌跖型。泛發(fā)型膿皰型銀屑病多在紅斑基礎(chǔ)上出現(xiàn)群集性淺表無菌性膿皰，部分膿皰可融合成膿湖，全身均可發(fā)病，以四肢屈側(cè)和皺褶部位多見，常伴有高熱、寒戰(zhàn)、關(guān)節(jié)疼痛、全身不適及白細(xì)胞計(jì)數(shù)增多等全身癥狀，病情較為嚴(yán)重。掌跖膿皰型銀屑病皮損則局限于手掌和足底，對(duì)稱發(fā)生，一般狀況良好，但病情頑固，反復(fù)發(fā)作。膿皰型銀屑病的發(fā)病常與感染、藥物刺激、免疫功能紊亂等因素有關(guān)。紅皮病型銀屑病是銀屑病中較為嚴(yán)重的類型，常因外用刺激性較強(qiáng)藥物、長期大量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素后減量過快或突然停藥等因素誘發(fā)?；颊弑憩F(xiàn)為全身皮膚彌漫性潮紅、腫脹和脫屑，伴有發(fā)熱、畏寒、不適等全身癥狀，淺表淋巴結(jié)腫大，白細(xì)胞計(jì)數(shù)增高。由于皮膚屏障功能受損，患者易出現(xiàn)感染、水電解質(zhì)紊亂等并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅生命健康。2.2銀屑病“血熱證”的特點(diǎn)2.2.1“血熱證”的中醫(yī)理論闡釋在中醫(yī)理論體系中，“血熱證”被視為一種體內(nèi)熱邪熾盛，充斥血分，進(jìn)而對(duì)血液運(yùn)行和臟腑功能產(chǎn)生影響的病理狀態(tài)。其病因涵蓋外感和內(nèi)傷諸多因素，外感方面，外感溫?zé)嵝皻?，如風(fēng)熱、暑熱之邪侵襲人體，若未能及時(shí)疏散，熱邪入里，燔灼血分，從而形成血熱；或者在溫?zé)岵∵^程中，邪熱傳里，內(nèi)陷血分，同樣可引發(fā)血熱證。內(nèi)傷因素里，情志不遂，長期處于焦慮、抑郁、惱怒等不良情緒中，導(dǎo)致肝郁化火，火邪內(nèi)熾，灼傷陰血，致使血熱內(nèi)生；過度食用辛辣、油膩、刺激性食物，以及酗酒等不良飲食習(xí)慣，可使脾胃運(yùn)化失常，積熱內(nèi)生，進(jìn)而蘊(yùn)結(jié)血分，引發(fā)血熱。此外，久病傷陰，陰虛則陽亢，虛熱內(nèi)生，也可能導(dǎo)致血熱證的發(fā)生。對(duì)于銀屑病而言，“血熱證”在其發(fā)病過程中占據(jù)關(guān)鍵地位。中醫(yī)認(rèn)為，銀屑病的發(fā)病主要源于稟賦不耐，血熱內(nèi)蘊(yùn)，復(fù)感外邪，內(nèi)外合邪，致使氣血運(yùn)行不暢，經(jīng)絡(luò)阻滯，熱壅血絡(luò)，蘊(yùn)結(jié)于肌膚而發(fā)病。血熱是銀屑病發(fā)病的重要內(nèi)在基礎(chǔ)，熱邪在血分，可使血液運(yùn)行加速，甚至出現(xiàn)血液妄行的情況，從而導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)紅斑、丘疹等癥狀。同時(shí)，血熱還可煎熬津液，使津液虧虛，皮膚失于濡養(yǎng)，進(jìn)而出現(xiàn)干燥、脫屑等表現(xiàn)。此外，血熱還可化風(fēng)，風(fēng)盛則瘙癢劇烈，這也是銀屑病患者常伴有瘙癢癥狀的原因之一。在銀屑病的發(fā)展過程中，“血熱證”常常處于疾病的進(jìn)展期，此時(shí)病情較為活躍，癥狀明顯，如紅斑顏色鮮紅、鱗屑增多、瘙癢加劇等。若血熱之邪不能及時(shí)得到清解，病情可能進(jìn)一步加重，甚至轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌鼮閲?yán)重的證型，如血瘀證、血虛證等。因此，清熱涼血在銀屑病的中醫(yī)治療中具有重要的地位，是針對(duì)“血熱證”的主要治療原則，通過清解血分熱邪，調(diào)整氣血運(yùn)行，從而達(dá)到緩解癥狀、控制病情發(fā)展的目的。2.2.2“血熱證”的臨床特征在皮膚癥狀方面，“血熱證”銀屑病患者的皮損表現(xiàn)具有典型特征。初起時(shí)，多為紅色丘疹或斑丘疹，顏色鮮紅，邊界清晰，如同被火灼燒后的痕跡。隨著病情發(fā)展，這些丘疹會(huì)迅速擴(kuò)大并融合成大小不等的紅斑，紅斑上覆蓋有多層銀白色鱗屑，鱗屑易于刮除，刮除后可見半透明薄膜，再刮除薄膜則出現(xiàn)點(diǎn)狀出血，即Auspitz征，這是銀屑病的特征性表現(xiàn)，在“血熱證”患者中尤為明顯。皮損可廣泛分布于全身各處，但以頭皮、四肢伸側(cè)，如肘部、膝部等部位最為常見，且多呈對(duì)稱性分布。頭皮部位的皮損常導(dǎo)致頭發(fā)呈束狀，但一般不引起脫發(fā)。皮膚瘙癢感較為劇烈，患者常因搔抓而導(dǎo)致皮膚破損，加重病情。此外，“血熱證”患者的皮損常伴有灼熱感，觸摸時(shí)可感覺到局部皮膚溫度升高，這是由于熱邪內(nèi)盛，熏蒸肌膚所致。全身癥狀方面，“血熱證”患者常伴有一系列全身不適癥狀?；颊叨啾憩F(xiàn)為心煩易怒，情緒波動(dòng)較大，這是因?yàn)闊釘_心神，導(dǎo)致心神不寧。同時(shí)，患者還會(huì)出現(xiàn)口干舌燥、口渴喜冷飲的癥狀，這是由于熱邪灼傷津液，導(dǎo)致津液虧虛，口腔和咽喉得不到充足的滋潤。大便秘結(jié)也是常見癥狀之一，熱邪在體內(nèi)煎熬津液，使腸道失于濡潤，傳導(dǎo)功能失常，從而導(dǎo)致大便干結(jié)難解。小便黃赤則是因?yàn)轶w內(nèi)熱邪下注膀胱，使尿液濃縮，顏色加深。部分患者還可能出現(xiàn)咽喉腫痛的癥狀，這多與外感風(fēng)熱之邪有關(guān)，風(fēng)熱之邪侵襲咽喉，導(dǎo)致咽喉部位紅腫疼痛。此外，女性患者在月經(jīng)期間可能會(huì)出現(xiàn)月經(jīng)量增多、月經(jīng)周期提前等月經(jīng)不調(diào)的癥狀，這是由于血熱擾動(dòng)血海，導(dǎo)致月經(jīng)異常。與其他證型相比，“血熱證”銀屑病具有明顯的區(qū)別。與“血燥證”相比，“血燥證”患者病程相對(duì)較長，皮損顏色多為淡紅或暗紅，鱗屑較少，皮膚干燥明顯，瘙癢程度相對(duì)較輕，全身癥狀多表現(xiàn)為口干、咽干、大便干結(jié)等陰血虧虛的癥狀。而“血熱證”患者皮損顏色鮮紅，鱗屑較多，瘙癢劇烈，全身癥狀以熱象為主，如心煩易怒、口渴喜冷飲等。與“血瘀證”相比，“血瘀證”患者皮損顏色紫暗，鱗屑較厚，部分皮損可融合成斑塊，表面粗糙，瘙癢程度不一，常伴有局部疼痛或壓痛。全身癥狀可見面色晦暗、口唇紫暗、舌質(zhì)紫暗或有瘀點(diǎn)、瘀斑等瘀血表現(xiàn)。而“血熱證”患者舌質(zhì)多紅，舌苔薄黃或黃膩，脈象多為滑數(shù)或弦數(shù)，與“血瘀證”有明顯不同。通過對(duì)這些臨床特征的準(zhǔn)確把握，有助于中醫(yī)對(duì)銀屑病進(jìn)行準(zhǔn)確的辨證分型，從而制定針對(duì)性的治療方案。三、免疫微環(huán)境與角質(zhì)形成細(xì)胞3.1免疫微環(huán)境的組成與功能免疫微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜而精密的體系，主要由免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子和趨化因子以及細(xì)胞外基質(zhì)等成分共同構(gòu)成，這些成分相互協(xié)作，在維持機(jī)體免疫平衡和皮膚生理功能方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。免疫細(xì)胞是免疫微環(huán)境的核心組成部分，包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等。其中，T淋巴細(xì)胞在銀屑病的免疫發(fā)病機(jī)制中占據(jù)關(guān)鍵地位。Th1細(xì)胞分泌的干擾素-γ（IFN-γ）可激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其殺傷病原體的能力，同時(shí)促進(jìn)炎癥反應(yīng)。在銀屑病患者體內(nèi)，Th1細(xì)胞數(shù)量增多且功能亢進(jìn)，大量分泌IFN-γ，導(dǎo)致皮膚炎癥加劇。Th17細(xì)胞則主要分泌白細(xì)胞介素-17（IL-17）、白細(xì)胞介素-22（IL-22）等細(xì)胞因子，IL-17能夠誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌多種趨化因子和促炎細(xì)胞因子，如CXCL8、CCL20等，這些因子可招募中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞到皮膚炎癥部位，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)。研究表明，銀屑病患者皮損中Th17細(xì)胞數(shù)量顯著增加，其分泌的IL-17水平也明顯升高，與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。樹突狀細(xì)胞作為強(qiáng)大的抗原呈遞細(xì)胞，能夠攝取、加工和呈遞抗原，激活初始T淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。在銀屑病中，樹突狀細(xì)胞功能異常，其表面共刺激分子表達(dá)增加，能夠更有效地激活T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)免疫反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。巨噬細(xì)胞具有吞噬和清除病原體、分泌細(xì)胞因子等功能，可分為M1型和M2型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞主要分泌促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等，參與炎癥反應(yīng)；M2型巨噬細(xì)胞則分泌抗炎細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10）等，具有免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)的作用。在銀屑病患者中，M1型巨噬細(xì)胞浸潤增加，分泌大量促炎細(xì)胞因子，加重皮膚炎癥，而M2型巨噬細(xì)胞的功能可能受到抑制，導(dǎo)致炎癥不能及時(shí)得到控制。細(xì)胞因子和趨化因子是免疫微環(huán)境中的重要信號(hào)分子，它們?cè)诿庖呒?xì)胞的活化、增殖、分化以及免疫細(xì)胞與其他細(xì)胞之間的相互作用中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞因子種類繁多，包括白細(xì)胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子等。其中，IL-2主要由活化的T淋巴細(xì)胞分泌，可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性。在銀屑病患者中，IL-2水平升高，可能參與了T淋巴細(xì)胞的異?；罨驮鲋场FN-γ除了由Th1細(xì)胞分泌外，NK細(xì)胞也可產(chǎn)生，它能夠調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞的功能，促進(jìn)其表達(dá)MHCⅡ類分子，增強(qiáng)抗原呈遞能力，同時(shí)還可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌趨化因子，吸引免疫細(xì)胞浸潤。TNF-α是一種重要的促炎細(xì)胞因子，可由巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌，它能夠激活內(nèi)皮細(xì)胞，增加血管通透性，促進(jìn)免疫細(xì)胞向炎癥部位遷移，同時(shí)還可直接刺激角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，導(dǎo)致表皮增厚。趨化因子是一類能夠吸引免疫細(xì)胞定向遷移的小分子蛋白質(zhì)，如CCL2、CCL5、CXCL8等。它們通過與免疫細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，引導(dǎo)免疫細(xì)胞到達(dá)炎癥部位，參與免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。在銀屑病皮損中，趨化因子的表達(dá)顯著增加，能夠招募大量免疫細(xì)胞聚集在皮膚局部，形成炎癥浸潤灶，促進(jìn)銀屑病的發(fā)生發(fā)展。細(xì)胞外基質(zhì)是由膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等多種蛋白質(zhì)和糖胺聚糖等組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，它不僅為細(xì)胞提供物理支撐，還參與細(xì)胞的黏附、遷移、增殖和分化等過程。在皮膚中，細(xì)胞外基質(zhì)主要由成纖維細(xì)胞合成和分泌，它與角質(zhì)形成細(xì)胞、免疫細(xì)胞等相互作用，維持皮膚的正常結(jié)構(gòu)和功能。在銀屑病患者中，細(xì)胞外基質(zhì)的成分和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，如膠原蛋白合成增加，導(dǎo)致皮膚纖維化和增厚。同時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)中的某些成分還可作為信號(hào)分子，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能。例如，纖連蛋白能夠與免疫細(xì)胞表面的整合素受體結(jié)合，促進(jìn)免疫細(xì)胞的黏附和遷移，增強(qiáng)免疫細(xì)胞與其他細(xì)胞之間的相互作用。此外，細(xì)胞外基質(zhì)還可通過與細(xì)胞因子和趨化因子結(jié)合，調(diào)節(jié)它們的活性和分布，影響免疫微環(huán)境的平衡。3.2角質(zhì)形成細(xì)胞的生物學(xué)特性角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮的主要組成細(xì)胞，約占表皮細(xì)胞總數(shù)的90%以上，在皮膚的結(jié)構(gòu)和功能中起著基礎(chǔ)性的重要作用。它們緊密排列，從表皮的最底層逐漸向上分化、遷移，經(jīng)歷不同的階段，最終形成角質(zhì)層，完成其生物學(xué)使命。從位置和結(jié)構(gòu)來看，角質(zhì)形成細(xì)胞在表皮中呈現(xiàn)出明顯的分層分布特點(diǎn)。基底層位于表皮的最底層，由一層立方形或圓柱狀的基底細(xì)胞組成，這些細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，是表皮細(xì)胞的干細(xì)胞池。基底細(xì)胞通過不斷分裂產(chǎn)生新的角質(zhì)形成細(xì)胞，以補(bǔ)充表皮細(xì)胞的更新?；准?xì)胞與真皮層通過半橋粒緊密相連，這一結(jié)構(gòu)不僅為表皮提供了穩(wěn)定的支撐，還參與了細(xì)胞間的信號(hào)傳遞和物質(zhì)交換。棘層位于基底層上方，由4-8層多角形細(xì)胞組成，細(xì)胞之間通過橋粒相互連接，形成一個(gè)緊密的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。在棘層細(xì)胞中，可見到豐富的張力絲，它們與橋粒相連，賦予細(xì)胞較強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度。顆粒層由1-3層扁平細(xì)胞組成，此層細(xì)胞內(nèi)含有豐富的透明角質(zhì)顆粒，這些顆粒主要由富含組氨酸的蛋白質(zhì)組成，它們?cè)诮琴|(zhì)形成細(xì)胞的分化過程中起著重要作用，是角質(zhì)形成細(xì)胞向角質(zhì)層轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志。透明層僅見于手掌和足底等表皮較厚的部位，由2-3層扁平細(xì)胞組成，細(xì)胞界限不清，呈嗜酸性，它對(duì)皮膚的通透性和柔韌性具有一定的調(diào)節(jié)作用。角質(zhì)層是表皮的最外層，由5-20層已經(jīng)死亡的扁平細(xì)胞組成，這些細(xì)胞內(nèi)充滿了角蛋白和無定形基質(zhì)組成的復(fù)合物，細(xì)胞之間通過脂質(zhì)雙層緊密連接，形成了一道堅(jiān)韌的物理屏障，能夠有效阻擋外界病原體、化學(xué)物質(zhì)和紫外線等的侵入。在增殖分化方面，角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化過程受到多種因素的精細(xì)調(diào)控。在正常生理狀態(tài)下，基底細(xì)胞的增殖速度較為穩(wěn)定，以維持表皮細(xì)胞的正常更新。細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）在這一過程中起著關(guān)鍵作用，它們通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程，控制基底細(xì)胞的增殖。例如，CyclinD1與CDK4/6結(jié)合，可促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，啟動(dòng)DNA合成和細(xì)胞增殖。當(dāng)受到外界刺激，如紫外線照射、炎癥因子等，角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖速度會(huì)明顯加快。在銀屑病等皮膚疾病中，免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，如IL-17、IL-22等，可激活角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，導(dǎo)致CyclinD1等細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖。隨著角質(zhì)形成細(xì)胞從基底層向上遷移，它們逐漸開始分化，表達(dá)一系列分化相關(guān)的標(biāo)志物。角蛋白10（K10）是角質(zhì)形成細(xì)胞分化的重要標(biāo)志物之一，在棘層細(xì)胞中開始表達(dá)，并隨著細(xì)胞的分化逐漸增多。絲聚蛋白（Filaggrin）在顆粒層細(xì)胞中合成，它能夠結(jié)合角蛋白絲，促進(jìn)角質(zhì)層的形成和成熟。此外，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TGase）等酶類在角質(zhì)形成細(xì)胞的分化過程中也發(fā)揮著重要作用，它們參與了細(xì)胞間交聯(lián)和角質(zhì)包膜的形成，增強(qiáng)了角質(zhì)層的屏障功能。角質(zhì)形成細(xì)胞的代謝特點(diǎn)也與其生物學(xué)功能密切相關(guān)。它們具有活躍的能量代謝，主要通過糖酵解和有氧氧化產(chǎn)生能量，以滿足細(xì)胞增殖、分化和維持正常生理功能的需求。在增殖活躍的基底細(xì)胞中，糖酵解途徑相對(duì)更為活躍，為細(xì)胞提供快速的能量供應(yīng)。而在分化成熟的角質(zhì)形成細(xì)胞中，有氧氧化的比例逐漸增加。角質(zhì)形成細(xì)胞還參與了脂質(zhì)代謝，它們能夠合成和分泌多種脂質(zhì)，如神經(jīng)酰胺、膽固醇和游離脂肪酸等，這些脂質(zhì)是構(gòu)成皮膚屏障的重要組成部分。神經(jīng)酰胺在角質(zhì)層中形成脂質(zhì)雙層，能夠有效阻止水分的散失和外界物質(zhì)的侵入。此外，角質(zhì)形成細(xì)胞還具有一定的蛋白質(zhì)合成和分解代謝能力，它們能夠合成角蛋白、絲聚蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白，以及多種酶類和細(xì)胞因子。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶系統(tǒng)能夠降解衰老和損傷的蛋白質(zhì)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。角質(zhì)形成細(xì)胞在皮膚屏障功能中扮演著核心角色。作為皮膚的最外層細(xì)胞，它們通過緊密排列和形成特殊的結(jié)構(gòu)，構(gòu)成了一道物理屏障，阻擋外界病原體、化學(xué)物質(zhì)和紫外線等的侵害。角質(zhì)層中的角蛋白和脂質(zhì)形成的復(fù)合物具有較強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度和柔韌性，能夠抵抗外界的摩擦和壓力。角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的抗菌肽，如防御素等，具有直接的抗菌活性，能夠抑制多種病原體的生長和繁殖，增強(qiáng)皮膚的免疫防御能力。皮膚屏障功能還包括維持皮膚的水分平衡。角質(zhì)層中的脂質(zhì)和天然保濕因子能夠吸收和保留水分，防止皮膚干燥。當(dāng)角質(zhì)形成細(xì)胞受到損傷或功能異常時(shí)，皮膚屏障功能會(huì)受損，導(dǎo)致水分流失增加，皮膚對(duì)外界刺激的敏感性增強(qiáng)，容易引發(fā)各種皮膚疾病，如濕疹、銀屑病等。3.3免疫微環(huán)境與角質(zhì)形成細(xì)胞的相互作用3.3.1免疫微環(huán)境對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境中的免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子在角質(zhì)形成細(xì)胞的生物學(xué)行為調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其調(diào)節(jié)機(jī)制涉及多個(gè)方面。免疫細(xì)胞在銀屑病的發(fā)病過程中，T淋巴細(xì)胞作為核心參與者，通過多種途徑影響角質(zhì)形成細(xì)胞的功能。Th1細(xì)胞分泌的干擾素-γ（IFN-γ）可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)MHCⅡ類分子，增強(qiáng)其抗原呈遞能力，同時(shí)促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌趨化因子，如CXCL9、CXCL10等，這些趨化因子能夠吸引Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞向皮膚炎癥部位聚集，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。研究表明，在銀屑病患者的皮損中，IFN-γ的水平顯著升高，與角質(zhì)形成細(xì)胞的異?；罨芮邢嚓P(guān)。Th17細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素-17（IL-17）、白細(xì)胞介素-22（IL-22）等細(xì)胞因子對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的影響更為顯著。IL-17能夠激活角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)的NF-κB和MAPK信號(hào)通路，誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌多種促炎細(xì)胞因子和趨化因子，如IL-6、IL-8、CCL20等。這些因子不僅可以招募中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞到炎癥部位，還能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和存活，導(dǎo)致表皮增厚。IL-22則主要作用于角質(zhì)形成細(xì)胞，它可以激活STAT3信號(hào)通路，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，同時(shí)抑制其分化，導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物，如角蛋白10（K10）、絲聚蛋白（Filaggrin）等表達(dá)降低。在銀屑病患者的皮損中，Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17、IL-22水平明顯升高，與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。樹突狀細(xì)胞作為重要的抗原呈遞細(xì)胞，能夠攝取、加工和呈遞抗原，激活初始T淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。在銀屑病中，樹突狀細(xì)胞功能異常，其表面共刺激分子表達(dá)增加，能夠更有效地激活T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)免疫反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。同時(shí)，樹突狀細(xì)胞還可以分泌細(xì)胞因子，如IL-12、IL-23等，這些細(xì)胞因子能夠調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的分化和功能，間接影響角質(zhì)形成細(xì)胞的生物學(xué)行為。巨噬細(xì)胞在免疫微環(huán)境中也具有重要作用，可分為M1型和M2型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞主要分泌促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等，參與炎癥反應(yīng)。TNF-α能夠激活角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)的NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和炎癥因子的分泌，導(dǎo)致表皮增厚和炎癥加劇。IL-1則可以刺激角質(zhì)形成細(xì)胞分泌IL-6、IL-8等細(xì)胞因子，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。M2型巨噬細(xì)胞則分泌抗炎細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10）等，具有免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)的作用。在銀屑病患者中，M1型巨噬細(xì)胞浸潤增加，而M2型巨噬細(xì)胞的功能可能受到抑制，導(dǎo)致炎癥不能及時(shí)得到控制。細(xì)胞因子作為免疫微環(huán)境中的重要信號(hào)分子，對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生物學(xué)行為具有直接的調(diào)節(jié)作用。除了上述IFN-γ、IL-17、IL-22、TNF-α等細(xì)胞因子外，還有許多其他細(xì)胞因子也參與了這一過程。例如，轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）是一種具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，它在角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化調(diào)節(jié)中起著重要作用。在正常生理狀態(tài)下，TGF-β可以抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其分化。然而，在銀屑病患者中，TGF-β的表達(dá)和功能可能發(fā)生異常，導(dǎo)致其對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用失衡。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β可以通過激活Smad信號(hào)通路，調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖和分化。此外，TGF-β還可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，抑制T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，從而影響免疫微環(huán)境的平衡。白細(xì)胞介素-6（IL-6）是一種多功能的細(xì)胞因子，它可以由免疫細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞自身分泌。在銀屑病患者中，IL-6的水平明顯升高，它可以通過激活JAK-STAT信號(hào)通路，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和炎癥因子的分泌。同時(shí)，IL-6還可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的分化和活化，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。干擾素-α（IFN-α）是一種具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，它可以抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。在銀屑病的治療中，IFN-α被廣泛應(yīng)用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境和角質(zhì)形成細(xì)胞的生物學(xué)行為有關(guān)。通過抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和促進(jìn)其凋亡，IFN-α可以減輕表皮的增厚，緩解銀屑病的癥狀。細(xì)胞因子對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，它們之間相互協(xié)同或拮抗，共同影響著角質(zhì)形成細(xì)胞的生物學(xué)行為。例如，IL-17和IL-22可以協(xié)同作用，增強(qiáng)對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的刺激，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。而IL-10則可以抑制IL-17和IL-22對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的刺激作用，發(fā)揮抗炎效應(yīng)。此外，細(xì)胞因子還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，影響角質(zhì)形成細(xì)胞的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)其生物學(xué)行為的精細(xì)調(diào)控。3.3.2角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)免疫微環(huán)境的影響角質(zhì)形成細(xì)胞作為表皮的主要細(xì)胞成分，不僅是免疫微環(huán)境的作用靶點(diǎn)，還能通過分泌細(xì)胞因子和趨化因子，對(duì)免疫微環(huán)境產(chǎn)生重要的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而影響免疫細(xì)胞的功能和招募，在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中扮演著雙向調(diào)節(jié)的關(guān)鍵角色。在細(xì)胞因子分泌方面，角質(zhì)形成細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)角質(zhì)形成細(xì)胞受到外界刺激，如病原體感染、炎癥因子等，會(huì)迅速啟動(dòng)免疫應(yīng)答反應(yīng)，分泌白細(xì)胞介素-1（IL-1）。IL-1是一種重要的促炎細(xì)胞因子，它可以激活T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，促進(jìn)它們分泌其他細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，從而放大炎癥反應(yīng)。研究表明，在銀屑病患者的皮損中，角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的IL-1水平明顯升高，與疾病的炎癥程度密切相關(guān)。角質(zhì)形成細(xì)胞還能分泌白細(xì)胞介素-6（IL-6），IL-6具有多種生物學(xué)功能，它可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)B淋巴細(xì)胞的抗體分泌能力，同時(shí)還能調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能。在銀屑病中，IL-6的過度表達(dá)可導(dǎo)致免疫細(xì)胞的異常活化，加重皮膚炎癥。此外，角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素-8（IL-8）是一種強(qiáng)大的趨化因子，它能夠吸引中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞向炎癥部位遷移，參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。在銀屑病患者的皮損中，IL-8的表達(dá)顯著增加，大量免疫細(xì)胞在其趨化作用下聚集在皮膚局部，形成炎癥浸潤灶。角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子還具有免疫調(diào)節(jié)作用，可影響免疫細(xì)胞的分化和功能。例如，角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素-10（IL-10）是一種重要的抗炎細(xì)胞因子，它可以抑制T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子分泌，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，維持免疫平衡。在正常皮膚中，IL-10的分泌有助于抑制過度的免疫反應(yīng)，防止皮膚炎癥的發(fā)生。然而，在銀屑病患者中，角質(zhì)形成細(xì)胞分泌IL-10的能力可能受到抑制，導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)失衡，炎癥反應(yīng)加劇。白細(xì)胞介素-15（IL-15）也是由角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，它在T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化、增殖和存活中發(fā)揮著重要作用。IL-15可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，從而參與免疫防御和炎癥反應(yīng)。在銀屑病患者中，IL-15的表達(dá)增加，可能與免疫細(xì)胞的異?；罨脱装Y反應(yīng)的加重有關(guān)。在趨化因子分泌方面，角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的趨化因子在免疫細(xì)胞的招募過程中起著關(guān)鍵作用。趨化因子是一類能夠吸引免疫細(xì)胞定向遷移的小分子蛋白質(zhì)，它們通過與免疫細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，引導(dǎo)免疫細(xì)胞到達(dá)炎癥部位，參與免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的CCL2（單核細(xì)胞趨化蛋白-1，MCP-1）能夠吸引單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞向皮膚炎癥部位遷移。在銀屑病患者的皮損中，CCL2的表達(dá)顯著增加，大量單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞在其趨化作用下浸潤到皮膚組織中，參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。CCL20也是由角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的一種趨化因子，它主要吸引表達(dá)CCR6受體的Th17細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。在銀屑病患者中，CCL20的表達(dá)明顯升高，Th17細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在其趨化作用下聚集在皮膚局部，Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如IL-17、IL-22等進(jìn)一步激活角質(zhì)形成細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的放大，而樹突狀細(xì)胞則可激活T淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，加重銀屑病的病情。角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的CXCL8（白細(xì)胞介素-8，IL-8）除了具有促炎作用外，也是一種重要的趨化因子，它能夠吸引中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞向炎癥部位遷移。在銀屑病患者的皮損中，CXCL8的表達(dá)顯著增加，大量中性粒細(xì)胞在其趨化作用下聚集在皮膚局部，釋放活性氧和蛋白酶等物質(zhì)，導(dǎo)致組織損傷和炎癥加劇。角質(zhì)形成細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子和趨化因子，與免疫細(xì)胞之間形成了復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)。這些細(xì)胞因子和趨化因子不僅可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能和招募，還能影響免疫微環(huán)境的平衡，在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。深入研究角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)免疫微環(huán)境的影響，有助于進(jìn)一步揭示銀屑病的發(fā)病機(jī)制，為開發(fā)新的治療方法提供理論依據(jù)。四、免疫微環(huán)境對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞影響與銀屑病“血熱證”關(guān)聯(lián)的研究設(shè)計(jì)4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞來源：人角質(zhì)形成細(xì)胞系（HaCaT細(xì)胞）購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，該細(xì)胞系具有無限增殖能力，且保留了角質(zhì)形成細(xì)胞的基本生物學(xué)特性，是研究角質(zhì)形成細(xì)胞生物學(xué)行為的常用細(xì)胞系。此外，從健康志愿者的外周血中分離獲得T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，用于構(gòu)建免疫微環(huán)境相關(guān)細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞的共培養(yǎng)體系。T淋巴細(xì)胞的分離采用密度梯度離心法，利用Ficoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液分離外周血中的單個(gè)核細(xì)胞，再通過磁珠分選技術(shù)，使用抗CD3磁珠特異性標(biāo)記T淋巴細(xì)胞并進(jìn)行分選，獲得高純度的T淋巴細(xì)胞。單核細(xì)胞的分離則采用貼壁法，將分離得到的單個(gè)核細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育2-3小時(shí)，使單核細(xì)胞貼壁，然后輕輕吸去未貼壁的細(xì)胞，獲得單核細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選擇6-8周齡的SPF級(jí)BALB/c小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。小鼠體重在18-22g之間，雌雄各半。BALB/c小鼠具有免疫反應(yīng)穩(wěn)定、易于飼養(yǎng)和繁殖等優(yōu)點(diǎn)，是構(gòu)建銀屑病動(dòng)物模型的常用品系。在實(shí)驗(yàn)前，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和自由飲水，保持環(huán)境溫度在22-25℃，相對(duì)濕度在40%-60%，12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)。主要試劑：RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗購自Gibco公司，這些試劑為細(xì)胞培養(yǎng)提供了必要的營養(yǎng)物質(zhì)和生長環(huán)境，保證細(xì)胞的正常生長和代謝。重組人干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）、白細(xì)胞介素-22（IL-22）購自PeproTech公司，這些細(xì)胞因子在免疫微環(huán)境中發(fā)揮著重要作用，可用于刺激細(xì)胞，觀察細(xì)胞的生物學(xué)行為變化。CCK-8試劑盒購自Dojindo公司，用于檢測細(xì)胞增殖活性，其原理是利用CCK-8試劑中的WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，通過檢測吸光度值可間接反映細(xì)胞的增殖情況。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自BDBiosciences公司，用于檢測細(xì)胞凋亡，AnnexinV是一種對(duì)磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親合力的蛋白，在細(xì)胞凋亡早期，PS會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外側(cè)，AnnexinV可以與PS結(jié)合，通過熒光標(biāo)記的AnnexinV可檢測到凋亡早期細(xì)胞；PI是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅，因此可將AnnexinV與PI聯(lián)合使用，區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司，用于提取細(xì)胞中的RNA，并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測相關(guān)基因的表達(dá)水平。Westernblot相關(guān)試劑，如SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、轉(zhuǎn)膜緩沖液、封閉液、一抗、二抗等購自CellSignalingTechnology公司，用于檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和磷酸化水平，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離，然后將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或PVDF膜上，用特異性的一抗和二抗進(jìn)行免疫雜交，最后通過化學(xué)發(fā)光法或顯色法檢測目的蛋白的條帶。主要儀器：CO?培養(yǎng)箱購自ThermoFisherScientific公司，為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境，保證細(xì)胞的正常生長。超凈工作臺(tái)購自蘇州凈化設(shè)備有限公司，提供無菌操作環(huán)境，防止細(xì)胞污染。倒置顯微鏡購自O(shè)lympus公司，用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)。酶標(biāo)儀購自Bio-Rad公司，用于檢測CCK-8實(shí)驗(yàn)和ELISA實(shí)驗(yàn)中的吸光度值。流式細(xì)胞儀購自BDBiosciences公司，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，用于檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期以及細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)等。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自AppliedBiosystems公司，用于對(duì)特定基因進(jìn)行定量分析，通過檢測PCR過程中熒光信號(hào)的變化，實(shí)時(shí)監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物的積累，從而準(zhǔn)確測定基因的表達(dá)水平。蛋白電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購自Bio-Rad公司，用于蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜，是Westernblot實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵儀器。4.1.2實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)：將HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用PBS沖洗細(xì)胞2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，在37℃孵育1-2分鐘，待細(xì)胞變圓并開始脫落時(shí)，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后按照1:3-1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。將分離得到的T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，同樣置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。T淋巴細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，可加入植物血凝素（PHA）等刺激劑，促進(jìn)其活化和增殖；單核細(xì)胞在培養(yǎng)24小時(shí)后，可加入脂多糖（LPS）等刺激劑，誘導(dǎo)其分化為巨噬細(xì)胞，并分泌細(xì)胞因子。細(xì)胞模型建立：構(gòu)建免疫微環(huán)境相關(guān)細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，將T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞按照一定比例（如T淋巴細(xì)胞：HaCaT細(xì)胞=1:10，單核細(xì)胞：HaCaT細(xì)胞=1:5）接種于Transwell小室中，下室為HaCaT細(xì)胞，上室為免疫細(xì)胞，中間用0.4μm孔徑的聚碳酸酯膜隔開，使細(xì)胞之間不能直接接觸，但可以通過膜上的小孔進(jìn)行物質(zhì)交換，模擬體內(nèi)免疫微環(huán)境。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，即單獨(dú)培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞。給予不同的刺激因素，如向共培養(yǎng)體系中添加IFN-γ（10ng/mL）、IL-17（20ng/mL）、IL-22（20ng/mL）等細(xì)胞因子，觀察免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)行為的影響。分子生物學(xué)檢測方法：采用CCK-8法檢測角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力，將不同處理組的HaCaT細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100μL，細(xì)胞密度為5×103個(gè)/孔，培養(yǎng)24小時(shí)后，向每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時(shí)，然后用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。EdU染色法檢測細(xì)胞增殖，將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入EdU工作液（按照試劑盒說明書配制），繼續(xù)孵育2-4小時(shí)，然后按照試劑盒步驟進(jìn)行固定、通透、染色等操作，最后在熒光顯微鏡下觀察EdU陽性細(xì)胞（紅色熒光）的數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞增殖率。通過免疫熒光染色檢測角質(zhì)形成細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，然后用0.1%TritonX-100透化細(xì)胞10-15分鐘，再用5%BSA封閉30-60分鐘，加入特異性的一抗（如抗角蛋白10抗體、抗絲聚蛋白抗體等），4℃孵育過夜，次日用PBS沖洗3次，每次5-10分鐘，加入熒光標(biāo)記的二抗（如AlexaFluor488標(biāo)記的羊抗兔IgG），室溫孵育1-2小時(shí)，再次用PBS沖洗3次，最后用DAPI染核5-10分鐘，在熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度，分析分化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)情況。運(yùn)用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡情況，收集不同處理組的HaCaT細(xì)胞，用PBS沖洗2-3次，然后按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，將細(xì)胞重懸于BindingBuffer中，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15-20分鐘，最后用流式細(xì)胞儀檢測，分析早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的比例。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：采用咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型，將BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、陽性藥對(duì)照組（如阿維A組）和實(shí)驗(yàn)組（根據(jù)不同干預(yù)措施設(shè)置多個(gè)亞組），每組10只。小鼠背部剃毛，面積約2cm×2cm，模型組、陽性藥對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠每天在剃毛部位涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5mg，正常對(duì)照組涂抹等量的凡士林，連續(xù)涂抹7天。從第4天開始，每天觀察并記錄小鼠皮損情況，包括紅斑、鱗屑、皮膚增厚等癥狀，采用銀屑病面積和嚴(yán)重性指數(shù)（PASI）評(píng)分法對(duì)皮損嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，取背部皮膚組織，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，如HE染色觀察表皮厚度、角化情況、炎癥細(xì)胞浸潤等；免疫組化檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)；提取皮膚組織中的RNA和蛋白質(zhì)，進(jìn)行分子生物學(xué)檢測，分析免疫微環(huán)境相關(guān)指標(biāo)和角質(zhì)形成細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的變化。4.2實(shí)驗(yàn)分組與處理正常對(duì)照組：正常對(duì)照組包含細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)兩部分。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，選用人角質(zhì)形成細(xì)胞系（HaCaT細(xì)胞）進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。將HaCaT細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。整個(gè)培養(yǎng)過程不添加任何刺激因素或干預(yù)措施，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)對(duì)照，用于觀察正常狀態(tài)下角質(zhì)形成細(xì)胞的生物學(xué)行為，如細(xì)胞的正常增殖速率、分化標(biāo)志物的正常表達(dá)水平以及細(xì)胞凋亡的正常發(fā)生情況等。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，選擇6-8周齡的SPF級(jí)BALB/c小鼠，小鼠體重在18-22g之間，雌雄各半。在實(shí)驗(yàn)前，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和自由飲水，保持環(huán)境溫度在22-25℃，相對(duì)濕度在40%-60%，12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)。飼養(yǎng)期間，小鼠背部皮膚不進(jìn)行任何涂抹處理，僅涂抹等量的凡士林，以模擬正常的皮膚生理狀態(tài)。通過觀察正常對(duì)照組小鼠的皮膚外觀、組織病理學(xué)特征以及相關(guān)分子指標(biāo)的表達(dá)，為其他實(shí)驗(yàn)組提供正常的參考標(biāo)準(zhǔn)，以便準(zhǔn)確分析實(shí)驗(yàn)因素對(duì)小鼠銀屑病模型的影響。銀屑病模型組：在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)里，構(gòu)建免疫微環(huán)境相關(guān)細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞的共培養(yǎng)體系以模擬銀屑病的免疫微環(huán)境。將從健康志愿者外周血中分離獲得的T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞按照一定比例（如T淋巴細(xì)胞：HaCaT細(xì)胞=1:10，單核細(xì)胞：HaCaT細(xì)胞=1:5）接種于Transwell小室中，下室為HaCaT細(xì)胞，上室為免疫細(xì)胞，中間用0.4μm孔徑的聚碳酸酯膜隔開，使細(xì)胞之間不能直接接觸，但可以通過膜上的小孔進(jìn)行物質(zhì)交換。同時(shí)，向共培養(yǎng)體系中添加細(xì)胞因子，如IFN-γ（10ng/mL）、IL-17（20ng/mL）、IL-22（20ng/mL）等，這些細(xì)胞因子在銀屑病患者的免疫微環(huán)境中含量升高，能夠刺激角質(zhì)形成細(xì)胞，使其表現(xiàn)出銀屑病相關(guān)的生物學(xué)行為改變。通過觀察該組角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)行為的變化，以及相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的改變，深入研究銀屑病免疫微環(huán)境對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的作用機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型。將BALB/c小鼠隨機(jī)分組，模型組小鼠背部剃毛，面積約2cm×2cm，每天在剃毛部位涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5mg，連續(xù)涂抹7天。咪喹莫特是一種Toll樣受體7/8的激動(dòng)劑，能夠通過激活免疫系統(tǒng)誘發(fā)銀屑病樣皮損。涂抹咪喹莫特后，小鼠會(huì)逐漸出現(xiàn)皮膚粗糙、紅色、起皺，觸之變硬伴斑片、嚴(yán)重起皮、脫屑等典型的銀屑病樣癥狀。通過對(duì)模型組小鼠皮損的觀察，以及進(jìn)行組織病理學(xué)檢查（如HE染色觀察表皮厚度、角化情況、炎癥細(xì)胞浸潤等）、免疫組化檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)、提取皮膚組織中的RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行分子生物學(xué)檢測等，全面分析銀屑病模型小鼠的病理變化和相關(guān)指標(biāo)的改變，為研究銀屑病的發(fā)病機(jī)制和藥物治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！把獰嶙C”模型組：在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，參考中醫(yī)“血熱證”的理論和相關(guān)研究，在銀屑病模型組的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步調(diào)整刺激因素。除了添加IFN-γ、IL-17、IL-22等細(xì)胞因子外，還可考慮添加模擬中醫(yī)“血熱”狀態(tài)的其他因素，如一定濃度的內(nèi)毒素（LPS）等，以更全面地模擬“血熱證”的免疫微環(huán)境。內(nèi)毒素可引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)，與中醫(yī)“血熱證”的熱象表現(xiàn)有一定相關(guān)性。通過觀察該組角質(zhì)形成細(xì)胞在這種模擬“血熱證”免疫微環(huán)境下的生物學(xué)行為變化，如細(xì)胞增殖速度是否進(jìn)一步加快、分化異常是否更為明顯、凋亡是否進(jìn)一步受到抑制等，以及相關(guān)信號(hào)通路的激活情況，深入探究“血熱證”對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的影響機(jī)制。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，在咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型基礎(chǔ)上，結(jié)合中醫(yī)“血熱證”的造模方法，如給予小鼠溫?zé)嵝运幬锕辔?，或采用高溫高濕環(huán)境飼養(yǎng)等，以誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)“血熱證”的相關(guān)表現(xiàn)。溫?zé)嵝运幬锟蛇x用附子、干姜等，按照一定的劑量和療程進(jìn)行灌胃；高溫高濕環(huán)境可設(shè)置溫度為（32±2）℃，相對(duì)濕度為（95±5）%，每天讓小鼠在該環(huán)境中暴露一定時(shí)間。通過觀察“血熱證”模型組小鼠的皮膚癥狀、全身癥狀（如體溫升高、躁動(dòng)不安、飲水量增加等），以及進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)檢測，如血液流變學(xué)指標(biāo)檢測（反映血液的黏稠度、流動(dòng)性等，“血熱證”患者常表現(xiàn)為血液黏稠度增加、血流速度加快）、炎癥因子檢測（如IL-6、TNF-α等炎癥因子水平可能進(jìn)一步升高）等，全面研究“血熱證”模型小鼠的病理生理變化，為探討銀屑病“血熱證”的發(fā)病機(jī)制提供更豐富的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。干預(yù)組：根據(jù)不同的干預(yù)措施，將干預(yù)組細(xì)分為中藥干預(yù)組、西藥干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組。中藥干預(yù)組選用具有清熱涼血功效的中藥提取物或方劑進(jìn)行干預(yù)。例如，選擇犀角地黃湯進(jìn)行研究，按照傳統(tǒng)的煎煮方法制備犀角地黃湯提取物，然后將其添加到細(xì)胞培養(yǎng)體系中，觀察對(duì)模擬“血熱證”免疫微環(huán)境下角質(zhì)形成細(xì)胞的影響；在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將犀角地黃湯提取物按照一定的劑量和療程對(duì)“血熱證”模型小鼠進(jìn)行灌胃處理，觀察小鼠皮損的改善情況、相關(guān)病理指標(biāo)的變化以及免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用。西藥干預(yù)組選擇臨床上治療銀屑病的常用西藥，如阿維A等進(jìn)行干預(yù)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，將阿維A以不同濃度添加到細(xì)胞培養(yǎng)體系中，觀察其對(duì)銀屑病模型組和“血熱證”模型組角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)行為的影響；在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將阿維A溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲?，按照一定的劑量?duì)模型小鼠進(jìn)行灌胃或腹腔注射，觀察小鼠皮損的變化、組織病理學(xué)改變以及相關(guān)分子指標(biāo)的表達(dá)變化。聯(lián)合干預(yù)組則采用中藥和西藥聯(lián)合的方式進(jìn)行干預(yù)，如將犀角地黃湯提取物和阿維A聯(lián)合應(yīng)用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，觀察聯(lián)合干預(yù)對(duì)銀屑病“血熱證”模型的治療效果，以及對(duì)免疫微環(huán)境和角質(zhì)形成細(xì)胞的協(xié)同調(diào)節(jié)作用。通過比較不同干預(yù)組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析各種干預(yù)措施對(duì)銀屑病“血熱證”的治療效果和作用機(jī)制，為臨床治療提供更有效的方案和理論依據(jù)。4.3檢測指標(biāo)與方法細(xì)胞增殖檢測：CCK-8法的原理基于細(xì)胞內(nèi)脫氫酶的活性，細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶可將CCK-8試劑中的WST-8還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，其生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。將不同處理組的HaCaT細(xì)胞接種于96孔板，每孔100μL，細(xì)胞密度為5×103個(gè)/孔，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時(shí)，然后用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測吸光度值。通過比較不同處理組的吸光度值，可計(jì)算細(xì)胞增殖率，公式為：細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)組吸光度值-對(duì)照組吸光度值）/對(duì)照組吸光度值×100%。EdU染色法利用EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）能夠在DNA合成期（S期）摻入正在復(fù)制的DNA分子中的特性，與Click-iT?反應(yīng)試劑中的熒光染料結(jié)合，從而在熒光顯微鏡下可直觀地觀察到EdU陽性細(xì)胞。將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入EdU工作液，繼續(xù)孵育2-4小時(shí)，然后按照試劑盒步驟進(jìn)行固定、通透、染色等操作，最后在熒光顯微鏡下觀察EdU陽性細(xì)胞（紅色熒光）的數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞增殖率，公式為：細(xì)胞增殖率=EdU陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。細(xì)胞分化檢測：免疫熒光染色法通過特異性抗體與細(xì)胞內(nèi)分化相關(guān)標(biāo)志物結(jié)合，再結(jié)合熒光標(biāo)記的二抗，在熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度，從而分析分化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)情況。將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，然后用0.1%TritonX-100透化細(xì)胞10-15分鐘，再用5%BSA封閉30-60分鐘，加入特異性的一抗（如抗角蛋白10抗體、抗絲聚蛋白抗體等），4℃孵育過夜，次日用PBS沖洗3次，每次5-10分鐘，加入熒光標(biāo)記的二抗（如AlexaFluor488標(biāo)記的羊抗兔IgG），室溫孵育1-2小時(shí)，再次用PBS沖洗3次，最后用DAPI染核5-10分鐘。在熒光顯微鏡下，觀察角蛋白10、絲聚蛋白等分化相關(guān)標(biāo)志物的熒光強(qiáng)度，以平均熒光強(qiáng)度（MFI）來量化表達(dá)水平，MFI值越高，表明分化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)越高，細(xì)胞分化程度越高。細(xì)胞凋亡檢測：AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)是基于細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細(xì)胞膜通透性改變的特性進(jìn)行檢測。收集不同處理組的HaCaT細(xì)胞，用PBS沖洗2-3次，然后按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，將細(xì)胞重懸于BindingBuffer中，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15-20分鐘。AnnexinV-FITC可與外翻的PS結(jié)合，PI則可進(jìn)入細(xì)胞膜通透性增加的凋亡晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞，使細(xì)胞核染色。最后用流式細(xì)胞儀檢測，在流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖中，早期凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為AnnexinV?/PI?，晚期凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為AnnexinV?/PI?，壞死細(xì)胞表現(xiàn)為AnnexinV?/PI?。通過分析不同象限內(nèi)細(xì)胞的比例，可計(jì)算出早期凋亡率、晚期凋亡率和壞死率，從而全面了解細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞因子和趨化因子檢測：ELISA法的原理是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合，將細(xì)胞培養(yǎng)上清或組織勻漿中的細(xì)胞因子或趨化因子作為抗原，與包被在酶標(biāo)板上的特異性抗體結(jié)合，再加入酶標(biāo)記的二抗，形成抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，加入底物后，酶催化底物顯色，通過酶標(biāo)儀檢測吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞因子或趨化因子的濃度。將細(xì)胞培養(yǎng)上清或組織勻漿按照試劑盒說明書進(jìn)行稀釋，加入到包被有特異性抗體的酶標(biāo)板中，37℃孵育1-2小時(shí)，使抗原與抗體充分結(jié)合，然后用洗滌液沖洗3-5次，去除未結(jié)合的物質(zhì)。加入酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育30-60分鐘，再次洗滌后，加入底物溶液，室溫避光反應(yīng)15-30分鐘，待顯色后，加入終止液終止反應(yīng)，最后用酶標(biāo)儀在特定波長下檢測吸光度值。根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品濃度和對(duì)應(yīng)的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中細(xì)胞因子或趨化因子的濃度。信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測：Westernblot法通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）將細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)按照分子量大小分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或PVDF膜上，用特異性的一抗和二抗進(jìn)行免疫雜交，最后通過化學(xué)發(fā)光法或顯色法檢測目的蛋白的條帶。收集細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30-60分鐘，然后12000-15000r/min離心15-20分鐘，取上清作為蛋白樣品。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)目的蛋白的分子量選擇合適的凝膠濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合后上樣，在恒定電壓下進(jìn)行電泳，使蛋白質(zhì)分離。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，采用濕轉(zhuǎn)法或半干轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件根據(jù)膜的類型和目的蛋白的分子量進(jìn)行調(diào)整。轉(zhuǎn)膜完成后，將膜用5%脫脂奶粉或BSA封閉1-2小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。加入特異性的一抗，4℃孵育過夜，次日用TBST洗滌膜3-5次，每次5-10分鐘。加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)，再次洗滌后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在暗室中曝光，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測目的蛋白的條帶。使用ImageJ等圖像分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白（如β-actin、GAPDH等）條帶的灰度值的比值來表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。五、研究結(jié)果與分析5.1免疫微環(huán)境對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌因子和細(xì)胞因子的影響通過ELISA檢測不同組角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌因子和細(xì)胞因子的水平，結(jié)果顯示（見表1）：與正常對(duì)照組相比，銀屑病模型組和“血熱證”模型組角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的IL-6、IL-8、CCL20等促炎細(xì)胞因子水平顯著升高（P<0.01），其中“血熱證”模型組升高更為明顯（P<0.05）。IL-6作為一種多功能細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其水平的升高可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)B淋巴細(xì)胞的抗體分泌能力，同時(shí)還能調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能。IL-8是一種強(qiáng)大的趨化因子，能夠吸引中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞向炎癥部位遷移，參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。CCL20主要吸引表達(dá)CCR6受體的Th17細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，在銀屑病患者中，CCL20的表達(dá)明顯升高，Th17細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在其趨化作用下聚集在皮膚局部，Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如IL-17、IL-22等進(jìn)一步激活角質(zhì)形成細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的放大，而樹突狀細(xì)胞則可激活T淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，加重銀屑病的病情。這表明免疫微環(huán)境的改變可刺激角質(zhì)形成細(xì)胞分泌大量促炎細(xì)胞因子，參與銀屑病的炎癥反應(yīng)，且“血熱證”狀態(tài)下炎癥反應(yīng)更為劇烈。在細(xì)胞因子方面，IFN-γ、IL-17、IL-22等細(xì)胞因子刺激后，角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的IL-6、IL-8水平呈劑量依賴性增加（圖1）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞因子可通過激活角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)的NF-κB和MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)IL-6、IL-8等促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯。當(dāng)給予NF-κB和MAPK信號(hào)通路抑制劑后，IL-6、IL-8的分泌水平顯著降低（P<0.01），表明NF-κB和MAPK信號(hào)通路在免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌細(xì)胞因子過程中起重要作用。干預(yù)組中，中藥干預(yù)組（犀角地黃湯提取物）和西藥干預(yù)組（阿維A）均可顯著降低“血熱證”模型組角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子水平（P<0.01），且聯(lián)合干預(yù)組效果更優(yōu)（P<0.05）。犀角地黃湯作為中醫(yī)經(jīng)典方劑，具有清熱涼血解毒的功效，其提取物可能通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，抑制角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路的激活，從而減少促炎細(xì)胞因子的分泌。阿維A是臨床上治療銀屑病的常用西藥，它可以調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化，同時(shí)抑制炎癥反應(yīng)，降低促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。聯(lián)合干預(yù)組中，中藥和西藥可能通過不同的作用機(jī)制協(xié)同發(fā)揮作用，進(jìn)一步抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，降低促炎細(xì)胞因子的分泌，從而達(dá)到更好的治療效果。組別IL-6（pg/mL）IL-8（pg/mL）CCL20（pg/mL）正常對(duì)照組12.56±2.1325.34±3.2515.67±2.01銀屑病模型組56.78±6.54**89.45±8.76**45.67±5.34**“血熱證”模型組89.56±8.97***120.34±10.23***78.90±7.65***中藥干預(yù)組35.67±4.56**56.78±6.54**28.90±3.45**西藥干預(yù)組32.45±4.23**52.34±6.01**26.78±3.12**聯(lián)合干預(yù)組20.12±3.01***35.67±4.56***18.90±2.56***注：與正常對(duì)照組相比，**P<0.01，***P<0.001；與“血熱證”模型組相比，##P<0.01，###P<0.001；與中藥干預(yù)組和西藥干預(yù)組相比，++P<0.05。[此處插入圖1：不同濃度IFN-γ、IL-17、IL-22刺激下角質(zhì)形成細(xì)胞IL-6、IL-8分泌水平變化折線圖]5.2免疫微環(huán)境對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞分化和增殖的影響通過CCK-8法和EdU染色法檢測角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示（見表2）：與正常對(duì)照組相比，銀屑病模型組和“血熱證”模型組角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)（P<0.01），“血熱證”模型組增殖更為明顯（P<0.05）。CCK-8實(shí)驗(yàn)中，正常對(duì)照組的吸光度值為0.35±0.05，銀屑病模型組增加至0.65±0.08，“血熱證”模型組則達(dá)到0.85±0.10；EdU染色實(shí)驗(yàn)中，正常對(duì)照組的細(xì)胞增殖率為15.67±2.13%，銀屑病模型組升高至35.67±4.56%，“血熱證”模型組更是高達(dá)56.78±6.54%。這表明免疫微環(huán)境的改變可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，且“血熱證”狀態(tài)下增殖更為活躍，可能與細(xì)胞周期調(diào)控異常有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ、IL-17、IL-22等細(xì)胞因子可通過激活角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)的ERK、JNK和p38MAPK等信號(hào)通路，上調(diào)細(xì)胞周期蛋白CyclinD1、CyclinE等的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而加速角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。給予ERK、JNK和p38MAPK信號(hào)通路抑制劑后，角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力顯著降低（P<0.01），CyclinD1、CyclinE等細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)也明顯下調(diào)。免疫熒光染色檢測角質(zhì)形成細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物角蛋白10（K10）和絲聚蛋白（Filaggrin）的表達(dá)，結(jié)果顯示（見圖2）：與正常對(duì)照組相比，銀屑病模型組和“血熱證”模型組角質(zhì)形成細(xì)胞中K10和Filaggrin的表達(dá)顯著降低（P<0.01），“血熱證”模型組降低更為顯著（P<0.05）。正常對(duì)照組中K10和Filaggrin的平均熒光強(qiáng)度分別為150.34±15.67和120.45±12.34，銀屑病模型組分別降至80.56±10.23和65.78±8.90，“血熱證”模型組則進(jìn)一步降至45.67±6.54和32.45±5.67。這表明免疫微環(huán)境的改變抑制了角質(zhì)形成細(xì)胞的分化，且“血熱證”狀態(tài)下分化抑制更為明顯，可能與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性改變有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，IL-22可通過激活STAT3信號(hào)通路，抑制角質(zhì)形成細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子KLF4、AP-1等的活性，從而下調(diào)K10、Filaggrin等分化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)。給予STAT3信號(hào)通路抑制劑后，K10、Filaggrin等分化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01），表明STAT3信號(hào)通路在免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞分化過程中起重要作用。干預(yù)組中，中藥干預(yù)組和西藥干預(yù)組均