分析化學(xué)高職高?；瘜W(xué)教材編寫組編（第五版）第九章

吸光光度法“十二五”職業(yè)教育國家規(guī)劃教材主要內(nèi)容第一節(jié)

概述第二節(jié)吸光光度法的基本原理第三節(jié)分光光度計第四節(jié)顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇第五節(jié)測量條件的選擇第六節(jié)定量分析方法及應(yīng)用示例學(xué)習(xí)目標(biāo)知識目標(biāo)了解吸光光度法的分類和特點。掌握吸收定律的成立條件、表達式及物理意義。理解分光光度計的基本結(jié)構(gòu)和工作原理。掌握定量分析方法和測量條件的選擇。能力目標(biāo)能繪制吸收曲線。能正確選擇顯色條件和光度測量條件。能應(yīng)用吸光光度法對樣品中的微量成分進行定量分析。

前面所學(xué)滴定分析和重量分析都屬于化學(xué)分析法，適用于含量高于1%常量組分的測定，測定結(jié)果的相對誤差可控制在0.2%以內(nèi)，但不宜測定含量低于1%的微量成分。例如：測定含F(xiàn)e約0.01%的樣品

假設(shè)稱取1.0g試樣,則其中mFe≈0.1mg，采用不同測定方法對比如下：導(dǎo)引用不同方法分析Fe含量為0.01%樣品的對比分析方法所測物理量測量絕對誤差相對誤差結(jié)論沉淀重量法質(zhì)量mFe2O3=0.14mg0.2mg143%誤差大，不可接受K2Cr2O7滴定法體積（0.001667mol/L的K2Cr2O7標(biāo)液）VK2Cr2O7=0.02mL0.02mL100%誤差大，不可接受分光光度法吸光度A0.002~0.005(T)2%~5%能夠滿足誤差要求KMnO4水溶液呈深紫色，K2CrO4溶液呈橙色，CuSO4溶液呈藍(lán)色……當(dāng)這些有色物質(zhì)溶液的濃度發(fā)生變化時，溶液顏色的深淺也隨之改變，濃度越大，顏色越深。一、吸光光度法的分類

物質(zhì)呈現(xiàn)不同的顏色其本質(zhì)是對光的選擇性吸收；顏色深淺隨濃度而變化是對光的吸收程度不同。通過深入研究，人們發(fā)現(xiàn)：第一節(jié)概述通過比較溶液顏色的深淺來測定物質(zhì)的含量的方法，稱為目視比色法。目前普遍采用分光光度計測量吸光度，以代替比較顏色深淺，應(yīng)用分光光度計的分析方法稱為分光光度法。分光光度法根據(jù)物質(zhì)對不同波長的單色光的吸收程度不同進行定性和定量分析。按照研究的波譜區(qū)域不同，可分為：分光光度法紫外分光光度法——200～400nm紅外分光光度法——780～3.0×104nm可見分光光度法——400～780nm吸光光度法比色分析法分光光度法

吸光光度法是基于物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法。1.靈敏度高：常用于測定試樣中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（10-2～10-8）的微量或痕量組分。

二、吸光光度法特點2.準(zhǔn)確度高：一般分光光度法的相對誤差2%～5％，能夠滿足微量組分的測定要求。3.儀器簡單，操作簡便、快速4.應(yīng)用廣泛

幾乎所有的無機離子和許多有機化合物都能直接或間接用吸光光度法測定。在化工、醫(yī)藥、冶金、環(huán)境保護、地質(zhì)等諸多領(lǐng)域已成為必不可少的測試手段之一。（一）光的基本特性

射線x射線紫外光紅外光微波無線電波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可見光一、物質(zhì)對光的選擇性吸收1.電磁波譜：光是一種電磁波第二節(jié)吸光光度法的基本原理2.可見光、單色光和互補色光可見光：人眼能感覺到的那一小段光，波長范圍約400～780nm

單色光：單一波長的光組成。單色光其實是一種理想的“單色”，實際上含有少量其它波長的光。復(fù)合光：由不同波長的光組合而成的光?；パa色光：兩種適當(dāng)顏色的單色光按一定強度比例混合可得到白光，這兩種單色光稱為互補色光。（二）物質(zhì)對光的選擇性吸收

一種物質(zhì)呈現(xiàn)何種顏色，與入射光組成和物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)有關(guān),而溶液呈現(xiàn)不同的顏色是由于溶液中的吸光質(zhì)點(離子或分子)選擇性地吸收某種顏色的光而引起的。1.物質(zhì)顏色的產(chǎn)生③如果對某種色光產(chǎn)生選擇性吸收，則溶液呈現(xiàn)透射光的顏色，即溶液呈現(xiàn)的是它吸收光的互補色光的顏色。如硫酸銅溶液選擇性地吸收了白色光中的黃色光，所以呈現(xiàn)藍(lán)色。②如果入射光全部透過（不吸收），則溶液無色透明。常見的有下列三種情況：①當(dāng)白光通過某一均勻溶液時，如果各種波長光幾乎全部被吸收，則溶液呈黑色。溶液的顏色與光吸收的關(guān)系完全吸收完全透過吸收黃色光光譜示意表觀現(xiàn)象示意復(fù)合光不同顏色的可見光波長及其互補光紅650～760綠藍(lán)橙610～650藍(lán)黃580～610紫黃綠560～580紅紫綠500～560紅藍(lán)綠490～500橙綠藍(lán)480～490黃藍(lán)450～480黃綠紫400～450互補光顏色/nm藍(lán)綠

互補色光和各種顏色光的波長范圍，可作為光度測定時選擇測量波長的參考

若以不同波長的光照射某一溶液，并測量每一波長下溶液對光的吸收程度（即吸光度A），以吸光度為縱坐標(biāo)，相應(yīng)波長為橫坐標(biāo)，所得A-λ曲線，稱為吸收曲線。它更清楚地描述了物質(zhì)對光的吸收情況。四種不同濃度KMnO4溶液的吸收曲線2.物質(zhì)的吸收曲線300400500600700

/nm350525545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2Absorbance350Cr2O72-、MnO4-的吸收曲線②同一物質(zhì)不同濃度的溶液，在一定波長處吸光度隨溶液濃度的增加而增大——定量分析的依據(jù)

定量分析時，在

max處測定A，其靈敏度最高，因此吸收曲線是吸光光度法選擇測量波長的重要依據(jù)。從圖中可以看出：①吸光度最大處的波長稱為最大吸收波長，用λmax表示，例如的KMnO4溶液的

λmax=525nm。3.物質(zhì)對光產(chǎn)生選擇性吸收的原因物質(zhì)對可見光的吸收與物質(zhì)分子中電子能級和分子振動、轉(zhuǎn)動能級的躍遷有關(guān)。由于這些能級是量子化的，所以分子在這些能級之間的躍遷也只能吸收一定的能量。即只有當(dāng)入射光的光子能量與分子內(nèi)兩能級之間的能量差相等時，分子才能吸收該光子，分子本身從基態(tài)被激發(fā)到激發(fā)態(tài)。不同物質(zhì)的激發(fā)態(tài)和基態(tài)的能量差不同，選擇性吸收光子的波長也不同，此即物質(zhì)對光產(chǎn)生選擇性吸收的原因。分子吸收光譜為帶狀的連續(xù)光譜。二、光吸收的基本定律:Lambert-Beer定律當(dāng)一束平行單色光，通過一均勻的溶液后，光的強度會減弱。I0=Ia+It入射光強度吸收光強度透過光強度（1）透光度T

（透射比）Transmittance定義透光度：T取值范圍為0.0~1.0全部吸收~全部透射A=lg(1/T)=-lgT（2）吸光度A(Absorbance）A取值范圍0.0~∞全部透射~全部吸收二者關(guān)系為：定義吸光度：1.透射比和吸光度2.朗伯-比爾定律

朗伯和比爾分別研究了吸光度與液層厚度和吸光度與濃度之間的定量關(guān)系，合稱朗伯-比爾定律，其數(shù)學(xué)表達式為：吸光度吸收層厚度(cm)吸光質(zhì)點濃度A=lg(I0/It)=kbc

物理意義:當(dāng)一束平行單色光通過均勻、透明的吸光介質(zhì)時，其吸光度與吸光質(zhì)點的濃度和吸收層厚度的乘積成正比——吸光光度法定量分析的理論基礎(chǔ)3.吸光系數(shù)①當(dāng)c的單位為g·L-1時，比例常數(shù)用a

表示，稱為質(zhì)量吸光系數(shù)

A＝abρ②當(dāng)c的單位用mol·L-1時，比例常數(shù)用

表示,稱為摩爾吸光系數(shù)

A＝

bca的單位:L·g-1·cm-1

的單位:L·mol-1·cm-1A=kbcK的取值與濃度大小和液層厚度無關(guān)，但因濃度單位不同而異。K

比例常數(shù)入射光波長物質(zhì)的性質(zhì)溫度溶劑三、偏離朗伯-比爾定律的原因

出現(xiàn)的現(xiàn)象：在高濃度端，A與c偏離線性，呈彎曲狀。

產(chǎn)生原因：1.單色光不純現(xiàn)有儀器無法獲得純單色光，只能獲得小范圍的復(fù)合光。通常選擇吸光物質(zhì)的最大吸收波長λmax為入射光的波長，以保證測定有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度。選用峰值波長，也可以得到較高的靈敏度。入射光非單色性引起偏離3.溶液本身引起的偏差1）若溶液濃度大于0.01mol·L-1時，粒子間的相互作用2）溶液以膠體、乳濁、懸浮狀態(tài)存在時，有反射、散射作用2.化學(xué)因素溶液中的吸光物質(zhì)常因解離、締合或產(chǎn)生副反應(yīng)而改變其濃度，導(dǎo)致偏離。因此應(yīng)嚴(yán)格控制顯色劑的用量，減少或避免這類偏離。分光光度法的基本部件用于測定試樣吸光度的儀器稱為分光光度計，其基本結(jié)構(gòu)由五部分構(gòu)成。光源單色器樣品室檢測器顯示一、分光光度計的基本組成部件第三節(jié)分光光度計光源：發(fā)出所需波長范圍內(nèi)的連續(xù)光譜，有足夠的光強度,穩(wěn)定?？梢姽鈪^(qū)：鎢燈，碘鎢燈(320～2500nm)紫外區(qū)：氫燈，氘燈(180～375nm)氙燈氫燈鎢燈光源單色器：將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置，包括入射狹縫、準(zhǔn)光裝置、色散元件和出射狹縫等入射狹縫：光源的光由此進入單色器準(zhǔn)光裝置：透鏡或反射鏡使入射光成為平行光束聚焦裝置：將分光后的單色光聚焦至出口狹縫（透鏡或凹面鏡）色散元件：將復(fù)合光分解成單色光，目前常用光柵

核心部件是光柵，色散均勻,分辨率高,適用波長范圍寬光柵分光原理

利用不同波長入射光產(chǎn)生干涉條紋的衍射角不同而將復(fù)合光分成單色光。吸收池(比色皿)：用于盛待測及參比溶液。 可見光區(qū)：光學(xué)玻璃池 紫外區(qū)：石英池規(guī)格：0.5，1，2，3，5cm不等樣品室：用于放置各種類型的吸收池和相應(yīng)的池架附件吸收池檢測器：利用光電效應(yīng)，將光能轉(zhuǎn)換成電流信號。 光電池，光電管，光電倍增管信號處理及指示器：數(shù)字顯示，自動掃描記錄等二、分光光度計的類型1.根據(jù)分光光度計的光源所提供波長的范圍，分為可見分光光度計（波長范圍400～780nm）和紫外可見分光光度計(波長范圍200～1000nm)；2.根據(jù)光路設(shè)計分為單光束分光光度計和雙光束分光光度計；3.根據(jù)測量中提供的波長數(shù)分為單波長分光光度計和雙波長分光光度計。

光路比較紫外可見分光光度計的類型及特點（1）單光束

結(jié)構(gòu)簡單，價廉，適于在給定波長處測量吸光度或透光度，作定量分析，測定結(jié)果受光源強度波動影響較大；一般不能作全波段光譜掃描。（2）雙光束

能連續(xù)改變波長，自動比較樣品及參比溶液的透光強度，自動消除光源強度變化引起的誤差，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。

采用雙單色器，將不同波長的兩束單色光(λ1、λ2)快束交替通過同一吸收池而后到達檢測器。產(chǎn)生交流信號。無需參比溶液?！?/p>

=1～2nm。兩波長同時掃描即可獲得導(dǎo)數(shù)光譜。儀器復(fù)雜，價格貴。（3）雙波長

可見光區(qū)的吸光光度分析，首先要利用顯色反應(yīng)將待測組分轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩镔|(zhì)，然后再進行測定。顯色劑：將待測組分轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩镔|(zhì)的化學(xué)試劑顯色反應(yīng)：M+RMR被測組分有色物質(zhì)顯色劑第四節(jié)顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇1.靈敏度高，

大。2.選擇性好，干擾少。3.顯色后的物質(zhì)組成恒定，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。4.顏色對比度大，有色物質(zhì)與顯色劑顏色差別要大，二者的Δ

max>60nm;M+RMR一、對顯色反應(yīng)的要求影響因素二、顯色條件的選擇M+RMROH-M（OH）nH+HnR顯色劑用量酸度溫度顯色時間溶劑溶液中共存離子1.顯色劑用量

為使顯色反應(yīng)完全，需加入過量的顯色劑，但顯色劑太多，有時會引起副反應(yīng)，合適用量可通過實驗選擇。固定

cM、pH，改變cR，配系列溶液，分別測其吸光度，繪圖，選擇平坦處cR

。cRcRcRMo(SCN)32+

淺紅Mo(SCN)5

橙紅Mo(SCN)6-淺紅Fe(SCN)n3-n2.溶液的酸度pH酸度對顯色反應(yīng)有多方面影響，合適的酸度需通過實驗確定。固定cM、cR，改變pH，配系列溶液，分別測其吸光度，繪圖。選擇平坦處pH。3.顯色時間

有的顯色反應(yīng)瞬間完成，有的需要放置一定時間。有的放置時間太長，會不穩(wěn)定，合適時間可通過實驗選擇。4.顯色溫度顯色反應(yīng)要在合適的溫度下進行

固定cM、cR

、pH，改變溫度和時間，繪圖，選擇平坦處的溫度和時間。25℃50℃t/minA

有時在顯色反應(yīng)中加入有機溶劑，可提高顯色反應(yīng)的靈敏度。5.溶劑6.溶液中共存離子的影響

共存離子有色或顯色劑反應(yīng)生成有色物質(zhì)干擾測定，需設(shè)法消除或提前分離之。三、顯色劑的種類無機顯色劑（少用）過氧化氫鉬酸銨硫氰酸鹽等有機顯色劑：偶氮類、三苯甲烷類等,應(yīng)用廣泛應(yīng)根據(jù)吸收曲線，一般選擇最大吸收時的波長λmax.一、入射光波長的選擇有干擾A

無干擾，選擇

max優(yōu)點：A

1.非單色光影響小2.靈敏度高原則：吸收最大，干擾最小第五節(jié)測量條件的選擇二、參比溶液的選擇

吸光度的測量：將被測溶液盛放在吸收池中，放入分光光度計光路中。如圖所示：MR吸收試樣中其他成分吸收溶劑和試劑吸收吸收池對光的反射和吸收A=lg(I0/It)

目的是為了消除由于比色皿、溶劑及試劑對入射光的反射和吸收等帶來的誤差。A（樣品）=A（MR）+A（干擾）+A（吸收池）A（參比）=A（干擾）+A（池）=0

為了使吸光度真正反映待測組分的濃度，需扣除非待測組分的影響——使用參比溶液，將不含待測離子的溶液或試劑加入一比色皿中，試液放入另一比色皿中，再調(diào)節(jié)儀器，使不含待測離子溶液處于T=100%（A=0）處。A（樣品）-A（參比）=

A（MR）=kbc

1）當(dāng)試液、顯色劑及所用的其它試劑在測量波長處均無吸收，僅MR有吸收，可用純?nèi)軇┳鲄⒈热芤骸Ｈ纾褐苽溧彾疲╬hen）—Fe2+標(biāo)準(zhǔn)曲線

選擇參比溶液的原則：試液的吸光度真正反映待測組分的濃度。2）顯色劑或其他試劑也有吸收，可用空白溶液作參比例:鄰二氮菲光度法測Li2CO3中的Fe，參比溶液為不含Li2CO3樣品的所有試劑。3）待測液也有吸收，可用待測液作參比。如：測汽水中的Fe三、吸光度范圍的選擇

儀器光源不穩(wěn)定、實驗條件的偶然變動、讀數(shù)精度變動等都會帶來測量誤差。光度分析誤差化學(xué)因素儀器因素濃度測量的相對誤差與T(或A)的關(guān)系：儀器讀數(shù)誤差對于給定的儀器，讀數(shù)誤差ΔT為一常數(shù)1086420204060800.70.40.20.1AT/%Er(36.8)0.434實際工作中，應(yīng)控制T在15～70％,A在0.2～0.8之間(調(diào)c,b,

)

因此，在不同的吸光度范圍內(nèi)儀器讀數(shù)對測定帶來不同程度的誤差。一、定量分析方法（一）目視比色法

用眼睛觀察、比較待測物質(zhì)溶液顏色深淺以確定其含量的方法。標(biāo)準(zhǔn)系列法：將標(biāo)準(zhǔn)溶液和被測溶液在相同條件下進行顏色對比，

因入射光相同（日光或燈光），吸光系數(shù)相等，因此當(dāng)溶液液層厚度相同、顏色深度一樣時，二者的濃度相等。第六節(jié)定量分析方法及應(yīng)用示例比色管觀察方向c4c3c2c1c1c2c3c4標(biāo)準(zhǔn)液系列法

一套直徑、長度、玻璃厚度、玻璃成分都相同的平底比色管特點：靈敏、儀器簡單、操作方便，準(zhǔn)確度差。常用于限界分析。

例：國標(biāo)規(guī)定白酒中甲醇含量<0.04g/100mL——品紅亞硫酸法測定標(biāo)準(zhǔn)系列未知樣品（二）分光光度法1.單一組分的定量分析（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法選取與被測物質(zhì)含有相同組分的標(biāo)準(zhǔn)品，配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按所需條件顯色后，選擇測定波長和適當(dāng)?shù)谋壬?，分別測定它們的吸光度A。以A為縱坐標(biāo)，濃度c或ρ為橫坐標(biāo)，繪制吸光度與濃度的關(guān)系曲線，稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。01.02.03.04.0

ρ(mg/mL)A。。。。0.800.600.400.200.00在相同條件下測得試液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出試液的濃度，再計算試樣中待測組分的含量。01.02.03.04.0ρ(mg/mL)A。。。。*0.800.600.400.200.00Axρx標(biāo)準(zhǔn)曲線法準(zhǔn)確、簡便，尤其適用于批量樣品的常規(guī)分析。

由于受到各種因素的影響，實驗測出的各點可能不完全在一條直線上，手工繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線或多或少帶有主觀性，若根據(jù)最小二乘法原理對實驗數(shù)據(jù)進行線性回歸處理，確定的回歸直線就會更準(zhǔn)確。

設(shè)有n個實驗點（xi，yi），其回歸直線方程可表示為：

y=a+bx式中x為標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，y為相應(yīng)的吸光度；a、b為回歸系數(shù)，a表示直線的截距，b表示斜率。其中：當(dāng)a和b確定之后，一元線性回歸方程及回歸直線就確定了，利用該方程可以求得線性范圍內(nèi)試樣吸光度所對應(yīng)的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性的好壞可用回歸方程的線性相關(guān)系數(shù)r來表示：r越接近于1，說明線性越好，分光光度法一般要求r≥0.999。

實際工作中，采用計算器或計算機可直接計算出a、b和r，列出回歸直線方程，省略中間計算步驟。

一般a保留到小數(shù)點后第三位，b保留三位有效數(shù)字，r保留小數(shù)點后全部數(shù)字9和一位非9數(shù)字（r≤1）。（2）比較法在實際工作中，對于個別樣品的測定，有時也采用比較法。這種方法是用一個已知準(zhǔn)確濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液cs，在一定條件下測定其吸光度As

，然后在相同條件下測定試液cx的吸光度Ax，當(dāng)試液和標(biāo)準(zhǔn)溶液完全符合朗伯-比爾定律時：使用這種方法要求cs與cx很接近，且都符合吸收定律。2、多組分含量的測定多組分樣品的吸收曲線有三種情況1）各組分吸收曲線的λmax互不干擾在各自的λmax處，按單組分的測定