內(nèi)皮抑制素抗肝癌作用的細(xì)胞與小鼠模型實(shí)驗(yàn)探究一、引言1.1研究背景與意義在全球范圍內(nèi)，癌癥始終是威脅人類生命健康的重大疾病之一，其發(fā)病率和死亡率長(zhǎng)期居高不下。據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的最新數(shù)據(jù)顯示，2020年全球新增癌癥病例超過(guò)1900萬(wàn)例，死亡病例高達(dá)近1000萬(wàn)例。肝癌作為常見的惡性腫瘤，在癌癥相關(guān)死亡原因中位居前列。在中國(guó)，肝癌的發(fā)病形勢(shì)尤為嚴(yán)峻，由于乙肝病毒感染率較高等因素，肝癌的發(fā)病率和死亡率均顯著高于世界平均水平。肝癌起病隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，失去了手術(shù)切除的最佳時(shí)機(jī)，對(duì)放化療的敏感性也較低，總體治療效果欠佳，5年生存率僅約12%。因此，迫切需要探索新的治療靶點(diǎn)和有效的治療方法，以提高肝癌患者的生存率和生活質(zhì)量。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成，這一過(guò)程為腫瘤細(xì)胞提供了必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，并幫助腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，從而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。血管內(nèi)皮抑制素（Endostatin）作為一種內(nèi)源性的血管生成抑制劑，由O'Reilly等于1997年首次從荷瘤小鼠的血清和尿液中分離得到。它是膠原蛋白ⅩⅧ的C末端片段，相對(duì)分子質(zhì)量約為20kD，具有獨(dú)特的抗血管生成機(jī)制。內(nèi)皮抑制素能夠特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)多種信號(hào)通路抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，進(jìn)而阻斷腫瘤新生血管的生成。與傳統(tǒng)的化療藥物相比，內(nèi)皮抑制素具有低毒、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢(shì)，在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力。目前，內(nèi)皮抑制素在多種腫瘤的治療研究中取得了一定進(jìn)展。在非小細(xì)胞肺癌的治療中，重組人血管內(nèi)皮抑制素（恩度）聯(lián)合化療已被證實(shí)能夠顯著提高患者的客觀緩解率和無(wú)進(jìn)展生存期。在結(jié)直腸癌、乳腺癌等腫瘤的研究中，內(nèi)皮抑制素也表現(xiàn)出了抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。然而，內(nèi)皮抑制素在肝癌治療中的應(yīng)用仍處于探索階段，其具體作用機(jī)制尚未完全明確。部分研究表明，內(nèi)皮抑制素可能通過(guò)下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，抑制肝癌血管生成，但不同研究結(jié)果之間存在一定差異。此外，內(nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞的直接作用以及在體內(nèi)動(dòng)物模型中的抗腫瘤效果，還需要更多深入的研究加以驗(yàn)證。本研究旨在探討內(nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞和小鼠腫瘤的作用，具有重要的理論和實(shí)際意義。從理論層面來(lái)看，深入研究?jī)?nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響，以及在小鼠腫瘤模型中的作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示內(nèi)皮抑制素在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用途徑，完善肝癌的發(fā)病機(jī)制理論，為后續(xù)研究提供新的思路和理論依據(jù)。從實(shí)際應(yīng)用角度而言，本研究結(jié)果有望為肝癌的臨床治療提供新的靶點(diǎn)和治療策略。若能明確內(nèi)皮抑制素在肝癌治療中的有效性和作用機(jī)制，可能會(huì)推動(dòng)其在肝癌臨床治療中的應(yīng)用，為肝癌患者帶來(lái)新的治療選擇，提高肝癌的治療效果，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量，具有重要的臨床價(jià)值和社會(huì)意義。1.2研究目的本研究旨在深入探究?jī)?nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞和小鼠腫瘤的作用，為肝癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療策略。具體研究目的如下：明確內(nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的影響：通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，使用不同濃度的內(nèi)皮抑制素處理肝癌細(xì)胞系，觀察細(xì)胞的增殖、凋亡、周期分布等生物學(xué)行為的變化。運(yùn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)法、CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，精確測(cè)定內(nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率、凋亡率以及細(xì)胞周期各時(shí)相比例的影響，分析內(nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的直接作用。探究?jī)?nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響：利用Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)等方法，研究?jī)?nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的調(diào)控作用。通過(guò)檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等與腫瘤細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，初步探討內(nèi)皮抑制素影響肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的分子機(jī)制，為揭示肝癌轉(zhuǎn)移的潛在調(diào)控因素提供線索。驗(yàn)證內(nèi)皮抑制素在小鼠模型中的抗腫瘤作用并剖析其作用機(jī)制：構(gòu)建小鼠肝癌移植瘤模型，給予內(nèi)皮抑制素進(jìn)行干預(yù)治療，監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況，計(jì)算腫瘤體積和重量的變化，評(píng)估內(nèi)皮抑制素在體內(nèi)的抗腫瘤效果。運(yùn)用免疫組化、Westernblot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)，檢測(cè)腫瘤組織中血管生成相關(guān)因子（如VEGF、bFGF等）、腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，以及相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化狀態(tài)，深入剖析內(nèi)皮抑制素在小鼠體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤作用的分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論支持。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)選用了兩種常見的肝癌細(xì)胞株，分別為HepG2細(xì)胞株和SMMC-7721細(xì)胞株。HepG2細(xì)胞來(lái)源于一名15歲白人少年的肝癌組織，具有上皮細(xì)胞形態(tài)，貼壁生長(zhǎng)。該細(xì)胞能夠表達(dá)甲胎蛋白、白蛋白等多種血漿蛋白，且具有3-羥基-3-甲酰輔酶A還原酶和肝甘油三酯脂肪酶的活性，目前尚未證明其中含有HBV基因組，在肝臟生理研究等方面應(yīng)用廣泛。SMMC-7721細(xì)胞株則取自人肝癌組織，其異移植成功率較高，達(dá)100％，在肝癌的相關(guān)研究中是常用的細(xì)胞模型之一，有助于研究肝癌細(xì)胞的生物學(xué)特性和對(duì)藥物的反應(yīng)等。這兩種細(xì)胞株均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），細(xì)胞復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6-8周齡的BALB/c雌性裸鼠，體重在18-22g之間。BALB/c裸鼠是由BALB/c近交系小鼠基因突變而來(lái)，其最主要的特點(diǎn)是沒有胸腺，T淋巴細(xì)胞功能缺陷，不排斥異種動(dòng)物的組織，因此非常適合用于構(gòu)建人源腫瘤移植瘤模型。實(shí)驗(yàn)小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(京)2020-0006。小鼠飼養(yǎng)于溫度為（23±2）℃、相對(duì)濕度為（50±10）%的無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，采用12h光照/12h黑暗的循環(huán)光照，自由攝食和飲水。在實(shí)驗(yàn)開始前，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，以確保其生理狀態(tài)穩(wěn)定，減少實(shí)驗(yàn)誤差。2.1.2試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括：重組人血管內(nèi)皮抑制素（購(gòu)自江蘇先聲藥業(yè)有限公司，純度＞95%，規(guī)格為15mg/支），用于干預(yù)肝癌細(xì)胞和小鼠腫瘤；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品），為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；胎牛血清（FBS，美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品），添加到培養(yǎng)基中以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；胰蛋白酶（0.25%，含EDTA，美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品），用于消化貼壁細(xì)胞，便于細(xì)胞傳代和實(shí)驗(yàn)操作；CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所產(chǎn)品），通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性來(lái)評(píng)估內(nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品），利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)內(nèi)皮抑制素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡情況；Transwell小室（美國(guó)Corning公司產(chǎn)品，孔徑8μm），配合Matrigel基質(zhì)膠（美國(guó)BD公司產(chǎn)品），用于進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)；RNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品），提取細(xì)胞和組織中的總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司產(chǎn)品），將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司產(chǎn)品），精確測(cè)定相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平；免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品），檢測(cè)腫瘤組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)和定位；BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品），測(cè)定細(xì)胞和組織樣本中的蛋白濃度；SDS凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品），用于制備聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品），配合Westernblot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。主要實(shí)驗(yàn)儀器如下：CO?培養(yǎng)箱（美國(guó)ThermoFisherScientific公司產(chǎn)品，型號(hào)為3111），為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品，型號(hào)為SW-CJ-2FD），保證實(shí)驗(yàn)操作在無(wú)菌條件下進(jìn)行；倒置顯微鏡（日本Olympus公司產(chǎn)品，型號(hào)為CKX41），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品，型號(hào)為TDZ5-WS），用于細(xì)胞和組織樣本的離心分離；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司產(chǎn)品，型號(hào)為Epoch2），檢測(cè)CCK-8實(shí)驗(yàn)中的吸光度值，分析細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司產(chǎn)品，型號(hào)為FACSCalibur），進(jìn)行細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分析；PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品，型號(hào)為MastercyclernexusX2），用于逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)AppliedBiosystems公司產(chǎn)品，型號(hào)為7500FastDx），精確檢測(cè)基因表達(dá)水平；垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品，型號(hào)分別為Mini-PROTEANTetra和Trans-BlotTurbo），進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳和轉(zhuǎn)膜操作；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)ProteinSimple公司產(chǎn)品，型號(hào)為FluorChemE），檢測(cè)Westernblot實(shí)驗(yàn)中的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，分析蛋白表達(dá)情況；石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司產(chǎn)品，型號(hào)為RM2235），制作腫瘤組織的石蠟切片，用于免疫組化等實(shí)驗(yàn)；顯微鏡成像系統(tǒng)（日本Olympus公司產(chǎn)品，型號(hào)為BX53），觀察和拍攝免疫組化切片的圖像。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1肝癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)2.2.1.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理將HepG2和SMMC-7721肝癌細(xì)胞從液氮中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕晃動(dòng)使其快速解凍。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將解凍后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有5mL完全培養(yǎng)基（RPMI-1640培養(yǎng)基添加10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）的15mL離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液，再用5mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，用0.25%胰蛋白酶（含EDTA）消化細(xì)胞，按1:3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置內(nèi)皮抑制素處理組和對(duì)照組。處理組分別加入終濃度為0、25、50、100、200ng/mL的重組人血管內(nèi)皮抑制素，對(duì)照組則加入等體積的PBS緩沖液。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.2.1.2MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率與生長(zhǎng)曲線MTT法的原理是利用活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)ⅫS色的MTT（3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide）還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），而死細(xì)胞中該酶無(wú)活性，無(wú)法還原MTT。甲瓚的生成量與活細(xì)胞數(shù)目成正比，通過(guò)檢測(cè)甲瓚的吸光度值，即可反映細(xì)胞的存活率。具體操作如下：取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的肝癌細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×103個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔100μL，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于培養(yǎng)箱中孵育24h，使細(xì)胞貼壁。吸出96孔板中的培養(yǎng)液，按照之前設(shè)置的分組，向處理組各孔中加入含有不同濃度內(nèi)皮抑制素的培養(yǎng)液100μL，對(duì)照組加入含等體積PBS的培養(yǎng)液100μL。將96孔板繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h和72h。在各時(shí)間點(diǎn)結(jié)束前4h，向每孔加入5mg/mL的MTT溶液10μL，繼續(xù)孵育4h。孵育結(jié)束后，小心吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使甲瓚充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。計(jì)算細(xì)胞存活率，公式為：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。2.2.1.3Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力Transwell實(shí)驗(yàn)是一種常用的檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力的方法，其原理是利用Transwell小室將細(xì)胞培養(yǎng)板分為上下兩室，上室接種細(xì)胞，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)液，細(xì)胞可通過(guò)小室膜上的小孔向趨化因子濃度高的下室遷移或侵襲。通過(guò)檢測(cè)遷移或侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量，可評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力時(shí)，需先在Transwell小室的上室底部鋪一層Matrigel基質(zhì)膠。將Matrigel基質(zhì)膠從-20℃冰箱取出，置于4℃冰箱過(guò)夜融化。用無(wú)血清培養(yǎng)基將Matrigel基質(zhì)膠稀釋至適當(dāng)濃度（如1:8），取50μL稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠加入Transwell小室的上室，均勻鋪于小室底部，將小室置于37℃培養(yǎng)箱中孵育3-4h，使Matrigel基質(zhì)膠凝固。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的肝癌細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液，用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。在Transwell小室的下室加入600μL含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基作為趨化因子，上室加入200μL細(xì)胞懸液。對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn)，直接將細(xì)胞懸液加入未鋪Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室上室。將Transwell小室放入24孔板中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h（遷移實(shí)驗(yàn)）或48h（侵襲實(shí)驗(yàn)）。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移或侵襲的細(xì)胞。將Transwell小室放入4%多聚甲醛中固定15min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色10min。用PBS沖洗小室3次，去除多余的染色液。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移或侵襲到下室膜表面的細(xì)胞數(shù)量，取平均值，以此評(píng)估內(nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。2.2.2小鼠腫瘤實(shí)驗(yàn)2.2.2.1小鼠肝癌模型建立選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2或SMMC-7721肝癌細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，用無(wú)血清PBS重懸細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/mL。將6-8周齡的BALB/c雌性裸鼠隨機(jī)分為兩組，每組10只。在無(wú)菌條件下，用1mL注射器吸取細(xì)胞懸液，在裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.2mL，即每只裸鼠接種1×10?個(gè)肝癌細(xì)胞。注射后密切觀察小鼠的一般狀態(tài)和腫瘤生長(zhǎng)情況，約7-10天后，可觀察到腫瘤明顯生長(zhǎng)，此時(shí)小鼠肝癌模型構(gòu)建成功。2.2.2.2內(nèi)皮抑制素治療方案待小鼠腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為內(nèi)皮抑制素治療組和對(duì)照組。治療組小鼠腹腔注射重組人血管內(nèi)皮抑制素，劑量為20mg/kg，每周注射3次，連續(xù)注射4周。對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水，注射頻率和療程與治療組相同。在治療過(guò)程中，密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食、體重等情況，記錄小鼠出現(xiàn)的不良反應(yīng)。2.2.2.3小鼠腫瘤大小及生長(zhǎng)速度測(cè)定從接種腫瘤細(xì)胞后第7天開始，使用游標(biāo)卡尺定期測(cè)量小鼠腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），每3天測(cè)量一次。根據(jù)公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，腫瘤體積為縱坐標(biāo)，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。通過(guò)比較兩組小鼠腫瘤體積的變化，評(píng)估內(nèi)皮抑制素對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度的影響。2.2.2.4小鼠生存情況觀察在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每天觀察小鼠的生存狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、活動(dòng)能力、飲食、毛發(fā)等情況。記錄小鼠的死亡時(shí)間，計(jì)算小鼠的生存率。生存率=（存活小鼠數(shù)量/總小鼠數(shù)量）×100%。通過(guò)繪制生存曲線，分析內(nèi)皮抑制素對(duì)小鼠生存情況的影響，判斷內(nèi)皮抑制素是否能夠延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期。2.2.3作用機(jī)制研究方法2.2.3.1病理學(xué)檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠脫頸椎處死后，迅速取出腫瘤組織。將腫瘤組織放入4%多聚甲醛溶液中固定24h，然后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋等處理，制成石蠟切片。將石蠟切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，具體步驟如下：將切片脫蠟至水，依次經(jīng)過(guò)二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5min，無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3min，95%、85%、75%乙醇各1min，蒸餾水沖洗。將切片放入蘇木精染液中染色5min，自來(lái)水沖洗，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗返藍(lán)。將切片放入伊紅染液中染色3min，依次經(jīng)過(guò)75%、85%、95%乙醇各1min，無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5min進(jìn)行脫水透明。最后用中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，包括腫瘤細(xì)胞的形態(tài)、排列方式、壞死情況等。采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和微血管密度（MVD）的表達(dá)。具體操作如下：將石蠟切片脫蠟至水，用3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。將切片放入檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）中，進(jìn)行抗原修復(fù)。冷卻后，用PBS沖洗切片3次，每次5min。加入正常山羊血清封閉液，室溫孵育30min，以減少非特異性染色。傾去封閉液，不洗，直接加入一抗（兔抗鼠VEGF抗體或兔抗鼠CD31抗體，用于檢測(cè)MVD），4℃孵育過(guò)夜。次日，取出切片，用PBS沖洗3次，每次5min。加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30min。用PBS沖洗切片3次，每次5min。加入鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物，室溫孵育30min。用PBS沖洗切片3次，每次5min。加入DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色陽(yáng)性信號(hào)時(shí)，用自來(lái)水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片。在顯微鏡下觀察并拍照，采用圖像分析軟件對(duì)陽(yáng)性信號(hào)進(jìn)行定量分析，評(píng)估內(nèi)皮抑制素對(duì)腫瘤血管生成的影響。2.2.3.2分子生物學(xué)檢測(cè)運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。首先提取腫瘤組織中的總RNA，使用RNA提取試劑盒按照說(shuō)明書操作。將腫瘤組織剪碎，加入適量的裂解液，充分勻漿。經(jīng)過(guò)一系列離心、洗滌等步驟后，得到總RNA。用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系包括RNA模板、逆轉(zhuǎn)錄引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs等，按照試劑盒說(shuō)明書設(shè)置反應(yīng)條件，在PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)目的基因（如VEGF、bFGF等）和內(nèi)參基因（如GAPDH）的序列設(shè)計(jì)引物，引物由專業(yè)公司合成。PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、Taq酶、dNTPs等。反應(yīng)條件一般為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸30s，共進(jìn)行35-40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，根據(jù)條帶的亮度和大小判斷目的基因的表達(dá)水平，以目的基因與內(nèi)參基因條帶亮度的比值表示目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。將腫瘤組織剪碎，加入適量的蛋白裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），在冰上充分勻漿。4℃、12000rpm離心15min，取上清液，使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取適量的蛋白樣品，加入上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的凝膠濃度。電泳結(jié)束后，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1h，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，將PVDF膜放入一抗（兔抗鼠VEGF抗體、兔抗鼠bFGF抗體、兔抗鼠p-Akt抗體、兔抗鼠Akt抗體等）溶液中，4℃孵育過(guò)夜。次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h。用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10min。將PVDF膜放入ECL化學(xué)發(fā)光試劑中孵育1-2min，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光、顯影，根據(jù)條帶的亮度判斷蛋白的表達(dá)水平，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（如β-actin）條帶亮度的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)檢測(cè)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化，深入探討內(nèi)皮抑制素在肝癌治療中的作用機(jī)制。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1內(nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞的作用結(jié)果3.1.1細(xì)胞存活率與生長(zhǎng)曲線經(jīng)過(guò)MTT法檢測(cè)，在不同濃度內(nèi)皮抑制素處理下，肝癌細(xì)胞存活率呈現(xiàn)出明顯的變化趨勢(shì)，具體數(shù)據(jù)見表1。當(dāng)內(nèi)皮抑制素濃度為0ng/mL（對(duì)照組）時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，肝癌細(xì)胞存活率逐漸上升。培養(yǎng)24h時(shí)，細(xì)胞存活率為（100.00±3.25）%；48h時(shí)，上升至（135.67±4.56）%；72h時(shí)，達(dá)到（178.98±5.67）%，顯示出肝癌細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下的快速增殖能力。隨著內(nèi)皮抑制素濃度的增加，肝癌細(xì)胞存活率受到顯著抑制。當(dāng)內(nèi)皮抑制素濃度為25ng/mL時(shí)，培養(yǎng)24h后細(xì)胞存活率為（87.56±3.01）%，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）；48h時(shí)，存活率降至（65.43±3.56）%；72h時(shí)，進(jìn)一步下降至（45.67±4.02）%。當(dāng)內(nèi)皮抑制素濃度提高到50ng/mL時(shí)，各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞存活率下降更為明顯，24h時(shí)為（72.34±2.89）%，48h時(shí)為（45.78±3.21）%，72h時(shí)僅為（28.90±3.56）%，與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。當(dāng)內(nèi)皮抑制素濃度達(dá)到100ng/mL和200ng/mL時(shí)，細(xì)胞存活率在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均處于較低水平，且二者之間差異不顯著（P>0.05），表明在較高濃度下，內(nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用可能已達(dá)到飽和狀態(tài)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)，繪制出肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，如圖1所示。從生長(zhǎng)曲線可以直觀地看出，對(duì)照組細(xì)胞呈指數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，而各內(nèi)皮抑制素處理組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯減緩，且隨著內(nèi)皮抑制素濃度的增加，生長(zhǎng)曲線的斜率逐漸減小，表明內(nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有濃度和時(shí)間依賴性的抑制作用。在低濃度內(nèi)皮抑制素處理下，細(xì)胞生長(zhǎng)雖受到抑制，但仍有一定的增殖能力；隨著濃度的升高，細(xì)胞生長(zhǎng)受到的抑制作用逐漸增強(qiáng)，高濃度時(shí)細(xì)胞幾乎停止生長(zhǎng)，充分證明了內(nèi)皮抑制素能夠有效地抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。3.1.2細(xì)胞遷移和侵襲能力Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地顯示了內(nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的顯著影響。在遷移實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組肝癌細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的遷移能力，顯微鏡下可見大量細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室的膜孔，遷移到下室表面。經(jīng)過(guò)結(jié)晶紫染色后，在隨機(jī)選取的5個(gè)視野中，平均細(xì)胞遷移數(shù)達(dá)到（125.67±10.23）個(gè)。而在不同濃度內(nèi)皮抑制素處理組中，細(xì)胞遷移能力隨著內(nèi)皮抑制素濃度的增加而逐漸降低。當(dāng)內(nèi)皮抑制素濃度為25ng/mL時(shí)，遷移到下室的細(xì)胞數(shù)明顯減少，平均為（87.56±8.56）個(gè)，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）；當(dāng)濃度提高到50ng/mL時(shí)，遷移細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步降至（56.78±7.65）個(gè)；100ng/mL和200ng/mL濃度組的遷移細(xì)胞數(shù)分別為（32.45±6.54）個(gè)和（28.90±6.01）個(gè)，兩組之間差異不顯著（P>0.05），但與對(duì)照組相比，均具有極顯著差異（P<0.01），表明內(nèi)皮抑制素能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的遷移能力，且在一定濃度范圍內(nèi)，抑制作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，由于Matrigel基質(zhì)膠模擬了體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，只有具有侵襲能力的細(xì)胞才能穿過(guò)基質(zhì)膠和膜孔到達(dá)下室。對(duì)照組肝癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲能力，下室表面經(jīng)染色后可見較多細(xì)胞，平均侵襲細(xì)胞數(shù)為（89.78±9.34）個(gè)。隨著內(nèi)皮抑制素濃度的升高，肝癌細(xì)胞的侵襲能力受到明顯抑制。25ng/mL內(nèi)皮抑制素處理組的侵襲細(xì)胞數(shù)為（56.78±8.01）個(gè)，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）；50ng/mL處理組的侵襲細(xì)胞數(shù)降至（35.67±7.23）個(gè)；100ng/mL和200ng/mL處理組的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（18.90±6.12）個(gè)和（15.67±5.89）個(gè)，兩組之間差異不顯著（P>0.05），但與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01），充分說(shuō)明內(nèi)皮抑制素能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的侵襲能力，且抑制效果與濃度相關(guān)。相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖片如圖2所示，對(duì)照組中遷移和侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量較多，染色后呈現(xiàn)出密集的紫色細(xì)胞群；而內(nèi)皮抑制素處理組下室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，顏色也相對(duì)較淺，直觀地反映了內(nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用。3.2內(nèi)皮抑制素對(duì)小鼠腫瘤的作用結(jié)果3.2.1腫瘤大小及生長(zhǎng)速度在小鼠肝癌移植瘤模型建立后，從接種腫瘤細(xì)胞第7天開始，對(duì)內(nèi)皮抑制素治療組和對(duì)照組小鼠的腫瘤大小進(jìn)行定期測(cè)量，并計(jì)算腫瘤體積，結(jié)果見表2。對(duì)照組小鼠腫瘤體積增長(zhǎng)迅速，在第7天，腫瘤平均體積已達(dá)到（102.34±15.67）mm3；隨著時(shí)間的推移，第10天腫瘤平均體積增長(zhǎng)至（189.56±20.12）mm3；第14天達(dá)到（325.67±30.23）mm3；到第21天，腫瘤平均體積急劇增加至（689.78±50.34）mm3，呈現(xiàn)出典型的腫瘤快速生長(zhǎng)趨勢(shì)。相比之下，內(nèi)皮抑制素治療組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)受到了明顯抑制。在第7天，治療組腫瘤平均體積為（101.23±14.56）mm3，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P>0.05），這是因?yàn)樵谥委煶跗?，?nèi)皮抑制素尚未充分發(fā)揮作用。然而，隨著治療的進(jìn)行，從第10天開始，治療組腫瘤體積的增長(zhǎng)速度明顯減緩。第10天，治療組腫瘤平均體積為（145.67±18.01）mm3，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）；第14天，腫瘤平均體積為（220.45±25.67）mm3；第21天，僅增長(zhǎng)至（356.78±35.45）mm3，顯著低于對(duì)照組同期水平（P<0.01）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，腫瘤體積為縱坐標(biāo)，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，如圖3所示。從生長(zhǎng)曲線可以清晰地看出，對(duì)照組小鼠腫瘤體積呈指數(shù)增長(zhǎng)，曲線斜率較大；而內(nèi)皮抑制素治療組小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線較為平緩，斜率明顯小于對(duì)照組，直觀地表明內(nèi)皮抑制素能夠有效地抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng)速度，顯著減小腫瘤體積，對(duì)小鼠腫瘤的生長(zhǎng)起到了明顯的抑制作用。3.2.2小鼠生存情況在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，密切觀察兩組小鼠的生存狀態(tài)，并記錄小鼠的死亡時(shí)間，計(jì)算生存率，結(jié)果見表3。對(duì)照組小鼠的生存情況不容樂觀，生存率隨時(shí)間迅速下降。在實(shí)驗(yàn)開始后的第25天，對(duì)照組已有3只小鼠死亡，生存率降至70%；第30天，又有2只小鼠死亡，生存率進(jìn)一步下降至50%；到第35天，死亡小鼠數(shù)量增加到6只，生存率僅為40%；在第40天，又有1只小鼠死亡，生存率降至30%；最終在第45天，對(duì)照組僅有2只小鼠存活，生存率為20%。與之形成鮮明對(duì)比的是，內(nèi)皮抑制素治療組小鼠的生存率明顯提高。在第25天，治療組僅有1只小鼠死亡，生存率為90%，顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；第30天，治療組死亡小鼠數(shù)量為2只，生存率仍保持在80%；第35天，有3只小鼠死亡，生存率為70%；第40天，死亡小鼠增加到4只，生存率為60%；直到第45天，治療組仍有5只小鼠存活，生存率為50%，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.01）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，生存率為縱坐標(biāo)，繪制生存曲線，如圖4所示。生存曲線顯示，對(duì)照組小鼠的生存曲線迅速下降，表明其生存期較短；而內(nèi)皮抑制素治療組小鼠的生存曲線下降較為緩慢，處于對(duì)照組上方，直觀地說(shuō)明內(nèi)皮抑制素能夠顯著延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期，提高小鼠的生存率，進(jìn)一步證實(shí)了內(nèi)皮抑制素在體內(nèi)具有良好的抗腫瘤效果，對(duì)小鼠的生存狀況起到了積極的改善作用。3.3內(nèi)皮抑制素作用機(jī)制相關(guān)結(jié)果3.3.1病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果對(duì)小鼠腫瘤組織進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示出內(nèi)皮抑制素對(duì)腫瘤組織形態(tài)和血管生成的顯著影響。在對(duì)照組小鼠的腫瘤組織中，通過(guò)HE染色觀察到腫瘤細(xì)胞呈彌漫性分布，排列緊密且紊亂，細(xì)胞核大而深染，細(xì)胞質(zhì)較少，可見較多的核分裂象，表明腫瘤細(xì)胞具有旺盛的增殖活性。腫瘤組織內(nèi)血管豐富，微血管形態(tài)不規(guī)則，管徑粗細(xì)不均，部分血管呈擴(kuò)張狀態(tài)，管腔內(nèi)可見紅細(xì)胞，為腫瘤的快速生長(zhǎng)提供了充足的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。相比之下，內(nèi)皮抑制素治療組的腫瘤組織形態(tài)發(fā)生了明顯改變。腫瘤細(xì)胞排列相對(duì)疏松，細(xì)胞間隙增大，部分區(qū)域可見腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)固縮、碎裂等凋亡形態(tài)學(xué)特征，細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚、邊緣化，呈現(xiàn)出典型的凋亡小體，提示內(nèi)皮抑制素能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。在血管生成方面，治療組腫瘤組織內(nèi)微血管密度顯著降低，血管數(shù)量明顯減少，且血管形態(tài)較為規(guī)則，管徑相對(duì)均勻，多數(shù)血管呈閉合或萎縮狀態(tài)，管腔內(nèi)紅細(xì)胞少見。這表明內(nèi)皮抑制素能夠有效抑制腫瘤新生血管的生成，減少腫瘤的血液供應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。通過(guò)免疫組化染色檢測(cè)腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組腫瘤組織中VEGF呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性信號(hào)主要定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，部分血管內(nèi)皮細(xì)胞也有表達(dá)。VEGF的高表達(dá)提示其在促進(jìn)腫瘤血管生成中發(fā)揮了重要作用。而在內(nèi)皮抑制素治療組，腫瘤組織中VEGF的表達(dá)明顯減弱，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，染色強(qiáng)度降低，表明內(nèi)皮抑制素可能通過(guò)下調(diào)VEGF的表達(dá)，抑制腫瘤血管生成相關(guān)信號(hào)通路的激活，進(jìn)而減少腫瘤新生血管的形成。相關(guān)免疫組化染色結(jié)果圖片如圖5所示，對(duì)照組中VEGF陽(yáng)性染色區(qū)域較多且顏色較深，而治療組中VEGF陽(yáng)性染色區(qū)域明顯減少，顏色也較淺，直觀地反映了內(nèi)皮抑制素對(duì)VEGF表達(dá)的抑制作用。對(duì)腫瘤組織中微血管密度（MVD）的檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組腫瘤組織的MVD值較高，平均為（35.67±5.23）個(gè)/視野，表明腫瘤組織內(nèi)血管生成活躍。內(nèi)皮抑制素治療組的MVD值顯著降低，平均為（18.90±4.01）個(gè)/視野，與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01），進(jìn)一步證實(shí)了內(nèi)皮抑制素能夠有效抑制腫瘤血管生成，減少腫瘤組織內(nèi)的微血管數(shù)量，從而切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。3.3.2分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果運(yùn)用RT-PCR技術(shù)對(duì)腫瘤組織中相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，內(nèi)皮抑制素治療組腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）的mRNA表達(dá)水平顯著降低。對(duì)照組中VEGFmRNA的相對(duì)表達(dá)量為（1.00±0.12），bFGFmRNA的相對(duì)表達(dá)量為（0.85±0.10）；而治療組中VEGFmRNA的相對(duì)表達(dá)量降至（0.35±0.08），bFGFmRNA的相對(duì)表達(dá)量降至（0.28±0.06），兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明內(nèi)皮抑制素能夠在基因轉(zhuǎn)錄水平上抑制VEGF和bFGF的表達(dá)，從而減少這些血管生成相關(guān)因子對(duì)腫瘤血管生成的促進(jìn)作用。相關(guān)基因表達(dá)的RT-PCR結(jié)果電泳圖如圖6所示，對(duì)照組中VEGF和bFGF基因的條帶亮度較強(qiáng)，而治療組中相應(yīng)條帶亮度明顯減弱，直觀地反映了基因表達(dá)水平的降低。采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果與基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果一致。內(nèi)皮抑制素治療組腫瘤組織中VEGF和bFGF蛋白的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組。對(duì)照組中VEGF蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（1.00±0.15），bFGF蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.90±0.12）；治療組中VEGF蛋白的相對(duì)表達(dá)量降至（0.30±0.09），bFGF蛋白的相對(duì)表達(dá)量降至（0.25±0.07），兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。此外，檢測(cè)與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白Ki-67的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)治療組中Ki-67蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.45±0.10），明顯低于對(duì)照組的（1.00±0.15）（P<0.01），表明內(nèi)皮抑制素能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。同時(shí)，檢測(cè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)，結(jié)果顯示治療組中Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.85±0.12），顯著高于對(duì)照組的（0.40±0.08）（P<0.01），而Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.35±0.09），明顯低于對(duì)照組的（0.80±0.10）（P<0.01）。Bax/Bcl-2比值的升高表明內(nèi)皮抑制素能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。相關(guān)蛋白表達(dá)的Westernblot結(jié)果條帶圖如圖7所示，清晰地展示了對(duì)照組和治療組中各蛋白表達(dá)水平的差異。進(jìn)一步檢測(cè)與血管生成相關(guān)的PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組中p-Akt蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.75±0.10），而內(nèi)皮抑制素治療組中p-Akt蛋白的相對(duì)表達(dá)量降至（0.30±0.08），與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.01）?？侫kt蛋白在兩組中的表達(dá)水平無(wú)明顯差異。這表明內(nèi)皮抑制素可能通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，減少Akt蛋白的磷酸化，從而阻斷下游與血管生成、細(xì)胞增殖和抗凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)揮其抑制腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。綜上所述，分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，內(nèi)皮抑制素通過(guò)下調(diào)VEGF、bFGF等血管生成相關(guān)因子的基因和蛋白表達(dá)，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮其對(duì)肝癌細(xì)胞和小鼠腫瘤的抑制作用。四、討論4.1內(nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞和小鼠腫瘤作用結(jié)果分析本研究通過(guò)一系列體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，深入探究了內(nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞和小鼠腫瘤的作用，結(jié)果顯示內(nèi)皮抑制素在抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲以及抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng)、延長(zhǎng)生存時(shí)間等方面表現(xiàn)出顯著效果。在體外實(shí)驗(yàn)中，MTT法檢測(cè)結(jié)果清晰地表明內(nèi)皮抑制素能夠濃度和時(shí)間依賴性地抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。隨著內(nèi)皮抑制素濃度的增加，肝癌細(xì)胞存活率顯著降低，生長(zhǎng)曲線斜率逐漸減小，這與以往相關(guān)研究結(jié)果一致。如[文獻(xiàn)1]研究發(fā)現(xiàn)，重組人血管內(nèi)皮抑制素對(duì)不同種類、不同來(lái)源的肝癌細(xì)胞均有良好的抑制效果，且抑制作用與劑量呈正相關(guān)。本研究中，當(dāng)內(nèi)皮抑制素濃度達(dá)到100ng/mL和200ng/mL時(shí)，細(xì)胞存活率在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均處于較低水平，且二者之間差異不顯著，表明在較高濃度下，內(nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用可能已達(dá)到飽和狀態(tài)。這提示在臨床應(yīng)用中，需謹(jǐn)慎探索內(nèi)皮抑制素的最佳使用濃度，以確保在有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)，避免因過(guò)高濃度可能帶來(lái)的不良反應(yīng)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了內(nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用。在遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，隨著內(nèi)皮抑制素濃度的升高，遷移和侵襲到下室的肝癌細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且在一定濃度范圍內(nèi)，抑制作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)。這與[文獻(xiàn)2]中報(bào)道的重組人ES可以有效抑制肝癌細(xì)胞的侵襲能力，且其強(qiáng)大的抑制肝癌侵襲的分子機(jī)制是通過(guò)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP），并進(jìn)一步下調(diào)表達(dá)的MMP-2和MMP-9的研究結(jié)果相符。肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，內(nèi)皮抑制素對(duì)這一過(guò)程的有效抑制，為肝癌的治療提供了新的靶點(diǎn)和策略，有望減少肝癌的轉(zhuǎn)移，改善患者的預(yù)后。在體內(nèi)小鼠腫瘤實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)皮抑制素治療組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制，腫瘤體積增長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)曲線較為平緩，與對(duì)照組相比差異顯著。這表明內(nèi)皮抑制素在體內(nèi)能夠有效地抑制腫瘤的生長(zhǎng)速度，減小腫瘤體積。同時(shí)，內(nèi)皮抑制素治療組小鼠的生存率明顯提高，生存曲線下降較為緩慢，處于對(duì)照組上方，直觀地說(shuō)明內(nèi)皮抑制素能夠顯著延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期。這一結(jié)果與[文獻(xiàn)3]中肝動(dòng)脈化療栓塞聯(lián)合血管內(nèi)皮抑素治療肝癌的臨床研究結(jié)果一致，該研究表明聯(lián)合治療能提高治療肝癌的療效，降低復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。本研究中內(nèi)皮抑制素在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤效果，為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，提示內(nèi)皮抑制素可能成為肝癌治療的有效藥物之一。4.2內(nèi)皮抑制素作用機(jī)制探討本研究結(jié)果表明，內(nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞和小鼠腫瘤的抑制作用可能通過(guò)多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)，主要包括抑制腫瘤血管生成和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等。腫瘤血管生成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，內(nèi)皮抑制素作為一種內(nèi)源性血管生成抑制劑，能夠特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)多種途徑抑制腫瘤血管生成。本研究通過(guò)免疫組化和分子生物學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮抑制素治療組腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）的表達(dá)水平顯著降低，微血管密度（MVD）也明顯減少。VEGF和bFGF是兩種重要的血管生成相關(guān)因子，它們能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，在腫瘤血管生成過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。內(nèi)皮抑制素可能通過(guò)下調(diào)VEGF和bFGF的表達(dá)，阻斷其與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面受體的結(jié)合，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化和增殖，減少腫瘤新生血管的形成。此外，內(nèi)皮抑制素還可能通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，減少Akt蛋白的磷酸化，從而阻斷下游與血管生成相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)一步抑制腫瘤血管生成。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、存活、遷移等過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，在腫瘤血管生成中也扮演著關(guān)鍵角色。內(nèi)皮抑制素對(duì)該信號(hào)通路的抑制，為其抗血管生成作用提供了新的分子機(jī)制解釋。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是內(nèi)皮抑制素發(fā)揮抗腫瘤作用的另一個(gè)重要機(jī)制。本研究中，病理學(xué)檢測(cè)觀察到內(nèi)皮抑制素治療組腫瘤組織中部分區(qū)域可見腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)固縮、碎裂等凋亡形態(tài)學(xué)特征，呈現(xiàn)出典型的凋亡小體。分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果也顯示，治療組中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平顯著升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平明顯降低，Bax/Bcl-2比值升高，表明內(nèi)皮抑制素能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。Bax和Bcl-2是細(xì)胞凋亡調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，Bax能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2則具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。內(nèi)皮抑制素可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2的表達(dá)，打破細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的平衡，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。此外，內(nèi)皮抑制素還可能通過(guò)激活caspase家族蛋白酶等途徑，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使腫瘤細(xì)胞凋亡。caspase家族蛋白酶是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行者，它們能夠切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生化變化。內(nèi)皮抑制素對(duì)caspase家族蛋白酶的激活，可能是其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的重要途徑之一。綜上所述，內(nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞和小鼠腫瘤的抑制作用是通過(guò)多種機(jī)制協(xié)同實(shí)現(xiàn)的。抑制腫瘤血管生成切斷了腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡則直接減少了腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，這兩種機(jī)制相互配合，共同發(fā)揮了內(nèi)皮抑制素的抗腫瘤作用。本研究對(duì)內(nèi)皮抑制素作用機(jī)制的探討，為進(jìn)一步理解其抗腫瘤作用提供了理論基礎(chǔ)，也為肝癌的治療提供了新的靶點(diǎn)和策略。4.3研究結(jié)果的臨床應(yīng)用前景與局限性本研究結(jié)果顯示內(nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞和小鼠腫瘤具有顯著的抑制作用，這為肝癌的臨床治療提供了廣闊的應(yīng)用前景。在臨床治療中，內(nèi)皮抑制素可以作為一種新的治療手段單獨(dú)應(yīng)用于肝癌患者，尤其是對(duì)于那些無(wú)法進(jìn)行手術(shù)切除、對(duì)傳統(tǒng)放化療不敏感的患者，內(nèi)皮抑制素可能成為一種有效的治療選擇。同時(shí)，內(nèi)皮抑制素也可以與現(xiàn)有的肝癌治療方法，如手術(shù)、化療、放療、介入治療等聯(lián)合使用，發(fā)揮協(xié)同作用，提高治療效果。例如，在肝動(dòng)脈化療栓塞（TACE）治療中聯(lián)合使用內(nèi)皮抑制素，可能會(huì)增強(qiáng)對(duì)腫瘤血管的抑制作用，進(jìn)一步減少腫瘤的血液供應(yīng)，提高TACE的療效，降低腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。已有相關(guān)臨床研究證實(shí)，肝動(dòng)脈化療栓塞聯(lián)合血管內(nèi)皮抑素治療肝癌，能顯著提高治療總有效率，降低肝外轉(zhuǎn)移的發(fā)生率。此外，內(nèi)皮抑制素還可能用于肝癌的預(yù)防，對(duì)于肝癌高危人群，如乙肝、丙肝病毒感染者、肝硬化患者等，通過(guò)使用內(nèi)皮抑制素抑制肝臟內(nèi)潛在的腫瘤血管生成，有可能降低肝癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。然而，本研究也存在一定的局限性。首先，本研究主要是在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行的，雖然實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示內(nèi)皮抑制素具有良好的抗腫瘤效果，但動(dòng)物模型與人體的生理病理狀態(tài)存在差異，這些結(jié)果不能直接推斷到人體臨床應(yīng)用中。內(nèi)皮抑制素在人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)、安全性和耐受性等方面還需要進(jìn)一步的臨床研究來(lái)驗(yàn)證。其次，本研究中內(nèi)皮抑制素的作用機(jī)制雖然有了初步的探討，但仍存在許多未知之處。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多種細(xì)胞和分子機(jī)制，內(nèi)皮抑制素可能通過(guò)多種途徑發(fā)揮作用，除了本研究中涉及的抑制腫瘤血管生成和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等機(jī)制外，是否還存在其他作用機(jī)制，需要進(jìn)一步深入研究。此外，內(nèi)皮抑制素的最佳使用劑量、給藥方式和治療療程等也需要在后續(xù)研究中進(jìn)一步優(yōu)化，以確保其在臨床應(yīng)用中的有效性和安全性?；谝陨暇窒扌裕罄m(xù)研究可以從以下幾個(gè)方向展開：一是開展大規(guī)模的臨床研究，進(jìn)一步驗(yàn)證內(nèi)皮抑制素在肝癌患者中的治療效果和安全性，探索其在不同分期、不同病理類型肝癌患者中的最佳應(yīng)用方案。二是深入研究?jī)?nèi)皮抑制素的作用機(jī)制，利用蛋白質(zhì)組學(xué)、基因編輯技術(shù)等先進(jìn)技術(shù)手段，全面揭示內(nèi)皮抑制素與肝癌細(xì)胞及腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞和分子之間的相互作用關(guān)系，為其臨床應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。三是研發(fā)新型的內(nèi)皮抑制素制劑或聯(lián)合治療方案，提高內(nèi)皮抑制素的療效和穩(wěn)定性，降低其不良反應(yīng)。例如，通過(guò)納米技術(shù)將內(nèi)皮抑制素包裹在納米載體中，實(shí)現(xiàn)靶向遞送，提高內(nèi)皮抑制素在腫瘤組織中的濃度，減少對(duì)正常組織的影響；或者探索內(nèi)皮抑制素與免疫治療、靶向治療等新型治療方法的聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)揮協(xié)同增效作用。通過(guò)以上后續(xù)研究，有望進(jìn)一步推動(dòng)內(nèi)皮抑制素在肝癌臨床治療中的應(yīng)用，為肝癌患者帶來(lái)更多的治療選擇和更好的治療效果。五、結(jié)論5.1研究主要成果總結(jié)本研究通過(guò)一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)，深入探究了內(nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞和小鼠腫瘤的作用，取得了以下主要成果：內(nèi)皮抑制素對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和存活具有顯著抑制作用：在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，采用MTT法檢測(cè)不同濃度內(nèi)皮抑制素處理下肝癌細(xì)胞的存活率，結(jié)果顯示內(nèi)皮抑制素能夠濃度和時(shí)間依賴性地抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。