NO供體型2-苯胺基嘧啶衍生物的合成工藝與性能研究一、引言1.1研究背景與意義癌癥，作為威脅人類健康的重大殺手，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量和壽命。世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，2020年全球確診癌癥患者達(dá)1930萬，死亡人數(shù)增至1000萬，已然成為第二大死亡原因，全球五分之一的人在一生中會(huì)罹患癌癥，八分之一的男性和十一分之一的女性會(huì)死于癌癥。在中國(guó)，癌癥的發(fā)病率同樣不容小覷，2019年國(guó)家癌癥中心發(fā)布數(shù)據(jù)表明，中國(guó)惡性腫瘤每年發(fā)病約392.9萬人，死亡約233.8萬人，每分鐘就有7.5人被確診。癌癥不僅給患者帶來身體和心理上的巨大痛苦，也給家庭和社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在癌癥的發(fā)病機(jī)制研究中，酪氨酸蛋白激酶（PTK）逐漸成為焦點(diǎn)。PTK是一類能催化ATP上γ-磷酸轉(zhuǎn)移到蛋白酪氨酸殘基上的激酶，其羧基端具有典型的PTK結(jié)構(gòu)域，可催化自身或底物磷酸化，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化等過程中扮演關(guān)鍵角色。多數(shù)酪氨酸蛋白激酶是致癌RNA病毒的癌基因產(chǎn)物，也可由脊椎動(dòng)物的原癌基因產(chǎn)生，可分為受體型與非受體型。受體型酪氨酸蛋白激酶（RTK）主要包括表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）家族、胰島素受體家族等，其異常激活與新生血管生成、腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)。多種機(jī)制如功能獲得性突變、基因組擴(kuò)增、染色體重排和自分泌激活等，均可導(dǎo)致RTKs的異常激活，進(jìn)而破壞細(xì)胞生長(zhǎng)增殖與死亡之間的平衡，最終引發(fā)乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤。例如，EGFR在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肺癌等癌癥中過表達(dá)，HER2在肺癌、乳腺癌等癌癥中過表達(dá)，這些過表達(dá)情況會(huì)導(dǎo)致RTK局部濃度增加，造成調(diào)節(jié)機(jī)制失衡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。一氧化氮（NO）作為一種氣體信號(hào)分子，在腫瘤生物學(xué)中有著獨(dú)特的雙重作用。低濃度的NO由eNOS和nNOS合成，會(huì)促進(jìn)腫瘤血管生成、細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抗凋亡作用，從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)；而高濃度的NO由iNOS合成，則可通過多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用，如上調(diào)p53基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、下調(diào)抗細(xì)胞凋亡蛋白酶分子、增加細(xì)胞色素c的釋放、形成過氧亞硝酸離子影響p53基因的表達(dá)以及影響腫瘤細(xì)胞周期停滯、腫瘤細(xì)胞壞死、抑制腫瘤環(huán)境微血管生成和腫瘤細(xì)胞毒性等。鑒于NO的這些特性，NO供體在抗腫瘤藥物研發(fā)中展現(xiàn)出重要作用。NO供體是一類能在體內(nèi)釋放出NO的前體藥物，可補(bǔ)充體內(nèi)NO水平，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的有效治療。然而，傳統(tǒng)NO供體藥物存在缺乏靶向性和組織特異性、藥物作用時(shí)間過短、生理穩(wěn)定性差、對(duì)人體毒副作用大、有效劑量難以掌握和控制等缺陷。2-苯胺基嘧啶衍生物在腫瘤治療領(lǐng)域具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和潛力，其能夠?qū)野彼岬鞍准っ赴l(fā)揮有效的抑制作用，進(jìn)而阻礙腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移進(jìn)程。將NO供體與2-苯胺基嘧啶衍生物相結(jié)合，有望獲得具有雙重抗腫瘤機(jī)制的新型藥物。一方面，2-苯胺基嘧啶衍生物抑制酪氨酸蛋白激酶，切斷腫瘤細(xì)胞的異常信號(hào)傳導(dǎo)；另一方面，NO供體釋放NO，通過多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成等。這種結(jié)合可能克服傳統(tǒng)NO供體藥物的缺陷，提高藥物的靶向性和療效，降低毒副作用。合成NO供體型2-苯胺基嘧啶衍生物，對(duì)于開發(fā)新型、高效、低毒的抗腫瘤藥物具有重要意義，有望為癌癥治療帶來新的希望和突破，具有廣闊的應(yīng)用前景和研究?jī)r(jià)值，能夠?yàn)楣タ税┌Y這一難題提供新的策略和方法。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在2-苯胺基嘧啶類衍生物的研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者取得了一系列成果。此類衍生物作為酪氨酸蛋白激酶抑制劑，在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出重要潛力，成為研究熱點(diǎn)。在國(guó)外，諸多研究聚焦于2-苯胺基嘧啶衍生物對(duì)不同類型酪氨酸蛋白激酶的抑制作用及相關(guān)機(jī)制。比如針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR），一些2-苯胺基嘧啶衍生物能夠特異性地結(jié)合EGFR的ATP結(jié)合位點(diǎn)，阻斷其磷酸化過程，進(jìn)而抑制下游信號(hào)通路的傳導(dǎo)，有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，特定結(jié)構(gòu)的2-苯胺基嘧啶衍生物可使細(xì)胞周期停滯在G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，顯著降低腫瘤細(xì)胞的活力。針對(duì)間變性淋巴瘤激酶（ALK），相關(guān)2-苯胺基嘧啶衍生物也表現(xiàn)出良好的抑制活性，可有效抑制攜帶ALK融合基因的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，為ALK陽性腫瘤的治療提供了新的策略。國(guó)內(nèi)研究則更側(cè)重于2-苯胺基嘧啶衍生物的結(jié)構(gòu)修飾與優(yōu)化，以提高其抗腫瘤活性和選擇性。有研究團(tuán)隊(duì)通過在2-苯胺基嘧啶的特定位置引入不同取代基，合成了一系列衍生物，并對(duì)其進(jìn)行體外抗腫瘤活性測(cè)試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，引入某些吸電子基團(tuán)或大體積基團(tuán)后，衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制活性明顯增強(qiáng)，且對(duì)正常細(xì)胞的毒性較低，展現(xiàn)出更好的治療指數(shù)。還有研究將2-苯胺基嘧啶衍生物與其他具有抗腫瘤活性的基團(tuán)或分子進(jìn)行拼接，期望獲得具有協(xié)同作用的新型抗腫瘤藥物，部分化合物在初步實(shí)驗(yàn)中已表現(xiàn)出較好的協(xié)同抗腫瘤效果。在NO供體藥物的研究上，國(guó)外在新型NO供體的開發(fā)和作用機(jī)制探究方面處于前沿地位。開發(fā)出多種新型NO供體，如金屬-NO復(fù)合物、氧化呋咱類NO供體等。金屬-NO復(fù)合物中的硝普鈉雖在高血壓急救中有應(yīng)用，但因其非選擇性的NO釋放，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)存在局限。新型的Ni-（SalPipNONO）則在人肺癌A549細(xì)胞模型中展現(xiàn)出抑制腫瘤細(xì)胞克隆形成和侵襲、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，其抗癌機(jī)制涉及NO-cGMP依賴途徑導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞壞死以及水楊醛片段和活性氧激活的ERK1/2信號(hào)通路介導(dǎo)的caspase-3凋亡通路。氧化呋咱類NO供體在體內(nèi)可釋放高濃度NO，抑制腫瘤生長(zhǎng)，部分衍生物對(duì)多種癌細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性。國(guó)內(nèi)研究主要集中在NO供體藥物的劑型改進(jìn)和聯(lián)合用藥研究。通過納米技術(shù)制備NO供體納米材料，以改善NO供體的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和腫瘤靶向性。有研究設(shè)計(jì)合成了呋咱氮氧化物-奧沙利鉑的還原敏感型一氧化氮供體偶聯(lián)物，并將其與仿生脂蛋白系統(tǒng)結(jié)合，該系統(tǒng)可重塑腫瘤內(nèi)物理屏障，促進(jìn)毒性T細(xì)胞浸潤(rùn)，與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合使用時(shí)，在小鼠腫瘤模型中產(chǎn)生顯著的治療效果，延緩腫瘤生長(zhǎng)并延長(zhǎng)小鼠生存期。在聯(lián)合用藥方面，研究發(fā)現(xiàn)單硝酸異山梨酯與阿司匹林聯(lián)合用藥能有效抑制結(jié)腸癌，通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗癌作用。盡管當(dāng)前對(duì)2-苯胺基嘧啶類衍生物和NO供體藥物的研究取得一定進(jìn)展，但仍存在不足。對(duì)于2-苯胺基嘧啶類衍生物，其在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和安全性研究還不夠深入，部分衍生物的穩(wěn)定性和生物利用度有待提高，且臨床應(yīng)用案例相對(duì)較少。在NO供體藥物方面，如何精準(zhǔn)控制NO的釋放劑量和釋放部位，以提高藥物的靶向性和療效，同時(shí)降低毒副作用，仍是亟待解決的難題。將兩者結(jié)合形成NO供體型2-苯胺基嘧啶衍生物的研究尚處于起步階段，相關(guān)合成方法、結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系以及作用機(jī)制等方面的研究還十分有限，具有廣闊的研究空間。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在合成具有潛在抗腫瘤活性的NO供體型2-苯胺基嘧啶衍生物，為新型抗腫瘤藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容如下：設(shè)計(jì)并優(yōu)化合成路線：通過對(duì)2-苯胺基嘧啶衍生物和NO供體的結(jié)構(gòu)分析，設(shè)計(jì)合理的合成路線，將NO供體引入2-苯胺基嘧啶骨架中。參考已有文獻(xiàn)報(bào)道的合成方法，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際條件，對(duì)反應(yīng)原料、試劑、反應(yīng)條件等進(jìn)行優(yōu)化，以提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率和純度。探索不同的反應(yīng)路徑和催化劑，篩選出最佳的合成方案，確保合成過程的高效性和可行性。研究合成工藝：對(duì)合成過程中的關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)研究，包括反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)物配比、溶劑種類等對(duì)反應(yīng)產(chǎn)率和產(chǎn)物純度的影響。通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，確定各參數(shù)的最佳取值范圍，優(yōu)化合成工藝條件，提高反應(yīng)的選擇性和穩(wěn)定性，降低生產(chǎn)成本，為后續(xù)的放大生產(chǎn)提供技術(shù)支持。對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征：運(yùn)用多種現(xiàn)代分析測(cè)試技術(shù)，如核磁共振波譜（NMR）、質(zhì)譜（MS）、紅外光譜（IR）、元素分析等，對(duì)合成得到的NO供體型2-苯胺基嘧啶衍生物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面表征。通過分析譜圖數(shù)據(jù)，確定化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、官能團(tuán)、分子量以及元素組成等信息，驗(yàn)證目標(biāo)產(chǎn)物的合成是否成功，為進(jìn)一步的活性研究提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。測(cè)試合成產(chǎn)物的抗腫瘤活性：采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以多種腫瘤細(xì)胞株為研究對(duì)象，如肺癌細(xì)胞A549、乳腺癌細(xì)胞MCF-7、結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116等，運(yùn)用MTT法、CCK-8法等檢測(cè)目標(biāo)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布和凋亡情況，探討其抗腫瘤作用機(jī)制。同時(shí)，進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，建立腫瘤動(dòng)物模型，評(píng)價(jià)目標(biāo)化合物在體內(nèi)的抗腫瘤效果、藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)以及安全性，為其臨床應(yīng)用提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.12-苯胺基嘧啶類化合物概述2-苯胺基嘧啶類化合物是一類具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和重要生物活性的有機(jī)化合物。其基本結(jié)構(gòu)由嘧啶環(huán)和苯胺基通過特定的化學(xué)鍵連接而成。嘧啶環(huán)作為一種含氮雜環(huán)，具有良好的電子云分布和共軛體系，賦予了化合物一定的穩(wěn)定性和反應(yīng)活性；苯胺基則為化合物引入了豐富的電子特性和空間位阻效應(yīng)，二者的結(jié)合使得2-苯胺基嘧啶類化合物展現(xiàn)出多樣的化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)功能。在眾多的生物活性中，2-苯胺基嘧啶類化合物最為突出的是其作為ATP競(jìng)爭(zhēng)性蛋白酪氨酸激酶抑制劑的作用。蛋白酪氨酸激酶在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中占據(jù)關(guān)鍵地位，它能夠催化蛋白質(zhì)酪氨酸殘基的磷酸化，從而激活下游一系列與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、遷移和凋亡等密切相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。當(dāng)?shù)鞍桌野彼峒っ赴l(fā)生異常激活時(shí)，細(xì)胞的正常生理過程會(huì)被打亂，進(jìn)而引發(fā)多種疾病，其中腫瘤的發(fā)生發(fā)展與蛋白酪氨酸激酶的異常密切相關(guān)。2-苯胺基嘧啶類化合物能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合到蛋白酪氨酸激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)上。由于其結(jié)構(gòu)與ATP具有一定的相似性，能夠與ATP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，從而阻斷ATP與蛋白酪氨酸激酶的結(jié)合。一旦ATP無法結(jié)合，蛋白酪氨酸激酶就無法獲得磷酸化底物所需的能量，其激酶活性被抑制，下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路也隨之被切斷。這樣一來，腫瘤細(xì)胞的異常增殖和轉(zhuǎn)移等惡性行為就能夠得到有效的遏制。在抗腫瘤領(lǐng)域，2-苯胺基嘧啶類化合物已展現(xiàn)出顯著的應(yīng)用價(jià)值。以伊馬替尼為例，它是第一個(gè)成功上市的2-苯胺基嘧啶類蛋白酪氨酸激酶抑制劑，對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病和胃腸道間質(zhì)瘤具有良好的治療效果。伊馬替尼能夠選擇性地抑制Bcr-Abl酪氨酸激酶的活性，有效阻止腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。許多基于2-苯胺基嘧啶結(jié)構(gòu)的新型化合物不斷被研發(fā)出來，并在臨床前和臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)多種腫瘤的抑制活性，如肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等。這些化合物不僅為腫瘤治療提供了新的選擇，也推動(dòng)了腫瘤靶向治療藥物的發(fā)展，成為抗腫瘤藥物研究領(lǐng)域的重要方向之一。2.2NO供體的作用及原理一氧化氮（NO）作為一種在生物體內(nèi)廣泛存在的小分子氣體信號(hào)傳導(dǎo)分子，扮演著不可或缺的信使分子和效應(yīng)分子角色，廣泛參與人體多種生理過程，在心血管、神經(jīng)、免疫等多個(gè)系統(tǒng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的生理功能。在心血管系統(tǒng)中，NO由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，能夠激活鳥苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高，導(dǎo)致血管平滑肌舒張，從而調(diào)節(jié)血管張力，維持正常的血壓和血液循環(huán)。在神經(jīng)系統(tǒng)中，NO作為一種神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)，參與神經(jīng)傳遞和突觸可塑性的調(diào)節(jié)，對(duì)學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知等功能具有重要影響。在免疫系統(tǒng)中，NO是活化的巨噬細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生的毒性效應(yīng)因子之一，能夠抑制與巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的許多代謝活動(dòng)，如線粒體呼吸、DNA復(fù)制等，導(dǎo)致瘤細(xì)胞內(nèi)鐵元素大量喪失，細(xì)胞死亡。在腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域，NO展現(xiàn)出獨(dú)特的雙重作用特性。低濃度的NO，通常由內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）和神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）合成，會(huì)促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。它能夠促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，還能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，同時(shí)發(fā)揮抗凋亡作用，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和清除，從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。與之相反，高濃度的NO，主要由誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）合成，則具有顯著的抗腫瘤作用。其作用機(jī)制是多方面的，高濃度NO可上調(diào)p53基因的表達(dá)，p53基因作為一種重要的腫瘤抑制基因，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，促使腫瘤細(xì)胞走向死亡；它還能下調(diào)抗細(xì)胞凋亡蛋白酶分子，打破腫瘤細(xì)胞內(nèi)的抗凋亡平衡，促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生；同時(shí)，NO可以增加細(xì)胞色素c的釋放，細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟之一，進(jìn)而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。NO還能通過形成過氧亞硝酸離子等活性氮物種，影響p53基因的表達(dá)以及腫瘤細(xì)胞周期停滯，使腫瘤細(xì)胞無法正常進(jìn)行增殖分裂。NO還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死，抑制腫瘤環(huán)境微血管生成，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，以及發(fā)揮腫瘤細(xì)胞毒性作用，直接殺傷腫瘤細(xì)胞。NO供體，作為一類能夠在體內(nèi)釋放出NO的前體藥物，在抗腫瘤治療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。其作用原理是基于NO的抗腫瘤特性，通過在體內(nèi)特定的條件下釋放NO，補(bǔ)充腫瘤組織局部的NO水平，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的有效治療。不同類型的NO供體藥物具有各自獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和釋放NO的機(jī)制。有機(jī)硝酸酯類，如硝酸甘油、硝酸異山梨酯等，需要經(jīng)過細(xì)胞代謝才能生成NO。在體內(nèi)，它們首先被酯酶水解，生成相應(yīng)的醇和亞硝酸酯，亞硝酸酯進(jìn)一步分解產(chǎn)生NO。這種代謝過程相對(duì)較為緩慢，導(dǎo)致NO的釋放較為持續(xù)，但也容易出現(xiàn)耐受現(xiàn)象，連續(xù)使用數(shù)小時(shí)或數(shù)天，機(jī)體對(duì)其反應(yīng)性會(huì)降低。硝普鹽，如硝普鈉，在體內(nèi)能夠迅速釋放NO，它是一種金屬-亞硝基配合物，在水溶液中會(huì)逐漸分解，釋放出NO和鐵離子等。然而，硝普鈉的NO釋放缺乏選擇性，在體內(nèi)會(huì)廣泛作用于各個(gè)組織和器官，容易產(chǎn)生較多的不良反應(yīng)，限制了其在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。S-亞硝基硫醇類，其結(jié)構(gòu)中含有S-NO鍵，在生理?xiàng)l件下，S-NO鍵可以通過多種方式發(fā)生斷裂，釋放出NO。例如，在還原劑的作用下，S-NO鍵被還原，生成NO和相應(yīng)的硫醇。偶氮二醇鹽類，也能夠在體內(nèi)特定的環(huán)境中釋放NO，其釋放機(jī)制與分子結(jié)構(gòu)中的氮氮雙鍵以及周圍的化學(xué)環(huán)境密切相關(guān)。NO供體在抗腫瘤過程中，主要通過以下幾種機(jī)制發(fā)揮作用。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是其重要作用之一，NO供體釋放的NO可以通過激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)這一目的。NO能夠激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（sGC），使細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高，cGMP再激活下游的蛋白激酶G（PKG），PKG可以磷酸化一系列底物蛋白，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性發(fā)生改變，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。NO還可以通過與細(xì)胞內(nèi)的其他信號(hào)分子相互作用，如活性氧簇（ROS）等，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，損傷腫瘤細(xì)胞的DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子，觸發(fā)細(xì)胞凋亡程序。抑制腫瘤血管生成也是NO供體的重要作用機(jī)制。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，NO供體釋放的NO可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而阻礙腫瘤血管的生成。NO能夠調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等血管生成相關(guān)因子的表達(dá)和活性，減少VEGF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的刺激作用，抑制血管生成信號(hào)通路的傳導(dǎo)。NO還可以通過影響細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑，干擾血管內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，進(jìn)一步抑制腫瘤血管生成。增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性也是NO供體的優(yōu)勢(shì)之一。腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的耐藥性是影響治療效果的重要因素，NO供體可以通過多種途徑增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性。在低氧腫瘤細(xì)胞中，NO供體釋放的NO可以增加細(xì)胞內(nèi)氧的重新分布和胞漿內(nèi)氧的利用率，使脯氨酰羥化酶激活，促進(jìn)低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的降解。HIF-1α是一種在低氧條件下穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠調(diào)節(jié)多種與腫瘤耐藥、侵襲和血管生成相關(guān)基因的表達(dá)。通過降解HIF-1α，NO供體可以降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性，增強(qiáng)其對(duì)放化療的敏感性。NO還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，如PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路，改變腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，使其對(duì)放化療更加敏感。2.3二者結(jié)合的協(xié)同效應(yīng)2-苯胺基嘧啶類化合物作為ATP競(jìng)爭(zhēng)性蛋白酪氨酸激酶抑制劑，主要通過阻斷ATP與蛋白酪氨酸激酶的結(jié)合，抑制其磷酸化過程，進(jìn)而切斷下游信號(hào)傳導(dǎo)通路，遏制腫瘤細(xì)胞的異常增殖和轉(zhuǎn)移。而NO供體則是通過釋放NO，利用NO的多種生物學(xué)效應(yīng)來發(fā)揮抗腫瘤作用。當(dāng)2-苯胺基嘧啶類與NO供體結(jié)合時(shí)，在抗腫瘤作用機(jī)制方面展現(xiàn)出顯著的協(xié)同效應(yīng)。從對(duì)ATP生成和消耗的影響來看，二者的協(xié)同作用尤為突出。2-苯胺基嘧啶類化合物抑制蛋白酪氨酸激酶活性后，會(huì)干擾腫瘤細(xì)胞內(nèi)的能量代謝相關(guān)信號(hào)通路。以表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）信號(hào)通路為例，EGFR被激活后會(huì)通過一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，影響細(xì)胞內(nèi)的代謝過程，包括促進(jìn)ATP的生成以滿足腫瘤細(xì)胞快速增殖的能量需求。2-苯胺基嘧啶類化合物抑制EGFR激酶活性后，能夠阻斷這一促進(jìn)ATP生成的信號(hào)傳導(dǎo)，減少腫瘤細(xì)胞的ATP合成。而NO作為體內(nèi)的小分子氣體信號(hào)傳導(dǎo)分子，在腫瘤免疫方面發(fā)揮著直接或間接的作用，尤其是可以減少ATP的生成和促進(jìn)ATP的消耗。NO可以抑制線粒體的呼吸作用，線粒體是細(xì)胞產(chǎn)生ATP的主要場(chǎng)所，NO與細(xì)胞色素C氧化酶及復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ結(jié)合，阻礙電子傳遞鏈的正常運(yùn)行，從而降低ATP的生成效率。NO還可以激活一些ATP消耗相關(guān)的途徑，如通過激活某些離子通道，促使細(xì)胞內(nèi)離子濃度發(fā)生變化，為了維持離子平衡，細(xì)胞需要消耗ATP來驅(qū)動(dòng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而促進(jìn)ATP的消耗。2-苯胺基嘧啶類化合物與NO供體結(jié)合后，在減少ATP生成方面形成雙重阻斷，一方面從信號(hào)通路層面抑制ATP生成的促進(jìn)信號(hào)，另一方面從線粒體功能層面直接抑制ATP的產(chǎn)生；在促進(jìn)ATP消耗方面，二者的作用相互補(bǔ)充，進(jìn)一步加劇腫瘤細(xì)胞的能量代謝紊亂。這種對(duì)ATP生成和消耗的協(xié)同調(diào)控，使得腫瘤細(xì)胞因能量匱乏而無法維持其快速增殖和惡性行為，從而增強(qiáng)了抗腫瘤效果。在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面，二者也具有協(xié)同作用。2-苯胺基嘧啶類化合物抑制蛋白酪氨酸激酶后，會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)一系列抗凋亡蛋白的表達(dá)和活性受到抑制，同時(shí)促進(jìn)促凋亡蛋白的表達(dá)。以Bcr-Abl酪氨酸激酶為例，2-苯胺基嘧啶類衍生物伊馬替尼能夠抑制Bcr-Abl激酶活性，使下游的抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。NO供體釋放的NO則可以通過多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。NO激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（sGC），使細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高，cGMP再激活下游的蛋白激酶G（PKG），PKG可以磷酸化一系列底物蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性發(fā)生改變，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。NO還可以通過與細(xì)胞內(nèi)的其他信號(hào)分子相互作用，如活性氧簇（ROS）等，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，損傷腫瘤細(xì)胞的DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子，觸發(fā)細(xì)胞凋亡程序。當(dāng)2-苯胺基嘧啶類與NO供體結(jié)合時(shí)，它們從不同的凋亡信號(hào)通路入手，共同作用于腫瘤細(xì)胞，使得誘導(dǎo)凋亡的信號(hào)增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞更易發(fā)生凋亡。在抑制腫瘤血管生成方面，二者同樣能發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣。2-苯胺基嘧啶類化合物可以抑制腫瘤細(xì)胞分泌血管生成相關(guān)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等，從而減少對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的刺激，抑制血管生成。NO供體釋放的NO可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，阻礙腫瘤血管的生成。NO能夠調(diào)節(jié)VEGF等血管生成相關(guān)因子的表達(dá)和活性，減少VEGF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的刺激作用，抑制血管生成信號(hào)通路的傳導(dǎo)。NO還可以通過影響細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑，干擾血管內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，進(jìn)一步抑制腫瘤血管生成。2-苯胺基嘧啶類與NO供體結(jié)合后，在抑制腫瘤血管生成方面形成多層面的協(xié)同作用，從腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞兩個(gè)角度出發(fā)，共同阻斷腫瘤血管生成的過程，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，從而更有效地抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1目標(biāo)化合物的設(shè)計(jì)3.1.1先導(dǎo)化合物的選擇本研究選擇N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺作為2-苯胺基嘧啶類先導(dǎo)化合物，這一選擇基于多方面的考慮。從結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來看，其分子結(jié)構(gòu)中包含嘧啶環(huán)和苯胺基，這種結(jié)構(gòu)賦予了化合物獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)。嘧啶環(huán)具有良好的電子云分布和共軛體系，使得分子具有一定的穩(wěn)定性和反應(yīng)活性；苯胺基則為化合物引入了豐富的電子特性和空間位阻效應(yīng)，二者的結(jié)合使得該化合物能夠與蛋白酪氨酸激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)形成特異性的相互作用。在生物活性研究方面，N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺展現(xiàn)出顯著的蛋白酪氨酸激酶抑制活性。蛋白酪氨酸激酶在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中起著關(guān)鍵作用，其異常激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。該先導(dǎo)化合物能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合到蛋白酪氨酸激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)上，由于其結(jié)構(gòu)與ATP具有一定的相似性，能夠與ATP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，從而阻斷ATP與蛋白酪氨酸激酶的結(jié)合。一旦ATP無法結(jié)合，蛋白酪氨酸激酶就無法獲得磷酸化底物所需的能量，其激酶活性被抑制，下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路也隨之被切斷。研究表明，該先導(dǎo)化合物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株，如肺癌細(xì)胞A549、乳腺癌細(xì)胞MCF-7等，均表現(xiàn)出一定的增殖抑制作用。它能夠使腫瘤細(xì)胞周期停滯在特定階段，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。其抑制活性的具體機(jī)制涉及對(duì)細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路的調(diào)控，如通過抑制表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）信號(hào)通路，減少下游增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺在已有的研究中還表現(xiàn)出良好的生物相容性和較低的細(xì)胞毒性，這為其進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾和新藥研發(fā)提供了有利的基礎(chǔ)。綜合其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和已有的生物活性研究，選擇該化合物作為先導(dǎo)化合物，具有較大的開發(fā)潛力和研究?jī)r(jià)值，有望通過后續(xù)的結(jié)構(gòu)修飾和優(yōu)化，獲得具有更優(yōu)異抗腫瘤活性的新型藥物。3.1.2側(cè)鏈NO供體的選擇本研究選用呋咱氮類NO供體作為側(cè)鏈修飾基團(tuán)，主要基于以下幾方面依據(jù)。在NO釋放特性上，呋咱氮類NO供體具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。它在生理?xiàng)l件下能夠穩(wěn)定存在，但在特定的刺激下，如腫瘤微環(huán)境中的還原條件或特定酶的作用下，能夠快速且有效地釋放出NO。這種對(duì)釋放條件的敏感性，使得呋咱氮類NO供體能夠在腫瘤組織中精準(zhǔn)地釋放NO，提高NO的局部濃度，增強(qiáng)其抗腫瘤效果。相關(guān)研究表明，呋咱氮類NO供體在模擬腫瘤微環(huán)境的體系中，能夠在較短時(shí)間內(nèi)釋放出高濃度的NO，且釋放過程具有良好的可控性。從穩(wěn)定性角度分析，呋咱氮類NO供體具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性。其分子結(jié)構(gòu)中的呋咱環(huán)能夠有效地保護(hù)NO，防止其在未到達(dá)作用部位之前就發(fā)生過早的釋放或分解。這使得呋咱氮類NO供體在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中能夠保持相對(duì)穩(wěn)定，有利于藥物的制備和應(yīng)用。在不同的溫度和濕度條件下進(jìn)行的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)顯示，呋咱氮類NO供體在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)能夠保持其結(jié)構(gòu)和活性的穩(wěn)定，不會(huì)因環(huán)境因素的變化而發(fā)生明顯的降解或失活。在與先導(dǎo)化合物的兼容性方面，呋咱氮類NO供體表現(xiàn)出良好的適配性。它的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使得其能夠通過合適的化學(xué)鍵與先導(dǎo)化合物N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺連接，形成穩(wěn)定的偶聯(lián)物。這種連接方式不會(huì)破壞先導(dǎo)化合物和呋咱氮類NO供體各自的結(jié)構(gòu)和活性，且能夠保證在體內(nèi)環(huán)境中，兩者能夠協(xié)同發(fā)揮作用。通過理論計(jì)算和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，呋咱氮類NO供體與先導(dǎo)化合物偶聯(lián)后，先導(dǎo)化合物對(duì)蛋白酪氨酸激酶的抑制活性基本不受影響，同時(shí)呋咱氮類NO供體也能夠在適當(dāng)?shù)臈l件下釋放NO，實(shí)現(xiàn)雙重抗腫瘤機(jī)制的協(xié)同作用。呋咱氮類NO供體在NO釋放特性、穩(wěn)定性以及與先導(dǎo)化合物的兼容性等方面的優(yōu)勢(shì)，使其成為側(cè)鏈修飾基團(tuán)的理想選擇，為合成具有高效抗腫瘤活性的NO供體型2-苯胺基嘧啶衍生物奠定了基礎(chǔ)。3.1.3目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)本研究設(shè)計(jì)的NO供體型2-苯胺基嘧啶衍生物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是將呋咱氮類NO供體通過特定的連接基團(tuán)與先導(dǎo)化合物N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺相結(jié)合。具體來說，在先導(dǎo)化合物的苯胺基的特定位置，通過醚鍵、酯鍵或酰胺鍵等連接基團(tuán)，將呋咱氮類NO供體引入，形成新的化合物結(jié)構(gòu)。以醚鍵連接為例，連接基團(tuán)中的氧原子一端與苯胺基上的氫原子脫去后形成的碳位相連，另一端與呋咱氮類NO供體中的碳原子相連，從而實(shí)現(xiàn)兩者的偶聯(lián)。從結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分析，這種設(shè)計(jì)使得化合物兼具2-苯胺基嘧啶類和呋咱氮類NO供體的結(jié)構(gòu)特征。保留了2-苯胺基嘧啶類的嘧啶環(huán)和苯胺基結(jié)構(gòu)，使其能夠與蛋白酪氨酸激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合，發(fā)揮抑制蛋白酪氨酸激酶活性的作用。引入的呋咱氮類NO供體結(jié)構(gòu)則賦予了化合物釋放NO的能力。這種結(jié)合方式形成了一個(gè)較為復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)，不同結(jié)構(gòu)部分之間存在著相互作用和影響。由于呋咱氮類NO供體的引入，可能會(huì)改變整個(gè)分子的電子云分布和空間位阻，進(jìn)而影響化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合能力和生物活性。在可能的活性位點(diǎn)方面，化合物中的嘧啶環(huán)和苯胺基部分仍然是與蛋白酪氨酸激酶結(jié)合的關(guān)鍵活性位點(diǎn)。嘧啶環(huán)上的氮原子和苯胺基上的氮原子以及苯環(huán)上的電子云，能夠與蛋白酪氨酸激酶ATP結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基形成氫鍵、π-π堆積等相互作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白酪氨酸激酶的抑制。呋咱氮類NO供體部分則是NO的釋放位點(diǎn)，在腫瘤微環(huán)境的刺激下，呋咱環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，釋放出NO，發(fā)揮NO的抗腫瘤作用。連接基團(tuán)雖然主要起到連接作用，但也可能參與到化合物與生物分子的相互作用中，其化學(xué)性質(zhì)和空間結(jié)構(gòu)會(huì)影響整個(gè)化合物的活性和選擇性。設(shè)計(jì)的NO供體型2-苯胺基嘧啶衍生物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和活性位點(diǎn)分布，為其發(fā)揮雙重抗腫瘤機(jī)制提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，有望通過進(jìn)一步的研究和優(yōu)化，提高其抗腫瘤活性和選擇性。3.2實(shí)驗(yàn)原料與儀器3.2.1實(shí)驗(yàn)原料實(shí)驗(yàn)中使用的主要原料如下：原料名稱規(guī)格來源N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺純度≥98%上海凌富藥物研究有限公司3-乙酰基吡啶分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司N,N-二甲基甲酰胺二甲基縮醛分析純阿拉丁試劑有限公司2-甲基-5-硝基苯基胍硝酸鹽純度≥95%源葉生物科技有限公司含鹵素的呋咱氮類化合物（如3-氯甲基-4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物）純度≥97%根據(jù)文獻(xiàn)方法自行合成，合成方法為：以3-羥甲基-4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物為原料，在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下，與氯化試劑（如氯化亞砜）反應(yīng)，經(jīng)分離純化得到無水乙醇分析純天津富宇精細(xì)化工有限公司碳酸鉀分析純西隴科學(xué)股份有限公司碘化鉀分析純天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司四丁基溴化銨分析純麥克林生化科技有限公司三乙胺分析純上海泰坦科技股份有限公司N,N-二甲基甲酰胺（DMF）分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司乙酸乙酯分析純天津市大茂化學(xué)試劑廠石油醚分析純天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司硅膠200-300目，柱層析用青島海洋化工有限公司其他常規(guī)試劑（如鹽酸、氫氧化鈉、濃硫酸等）分析純均購(gòu)自本地化學(xué)試劑供應(yīng)商3.2.2實(shí)驗(yàn)儀器本實(shí)驗(yàn)所使用的主要儀器設(shè)備及其型號(hào)和主要功能如下：儀器名稱型號(hào)主要功能反應(yīng)釜DF-101S型提供合成反應(yīng)的場(chǎng)所，可控制反應(yīng)溫度、攪拌速度等條件，用于各類有機(jī)合成反應(yīng)，如N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺與含鹵素的呋咱氮類化合物的偶聯(lián)反應(yīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA型用于濃縮反應(yīng)液，通過減壓蒸餾的方式，將溶劑快速蒸發(fā)去除，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的初步分離和濃縮，如在合成產(chǎn)物的后處理過程中，去除反應(yīng)體系中的有機(jī)溶劑循環(huán)水式真空泵SHB-Ⅲ型配合旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀使用，提供減壓環(huán)境，加快溶劑的蒸發(fā)速度，確保蒸餾過程的順利進(jìn)行電子天平FA2004B型精確稱量實(shí)驗(yàn)原料和產(chǎn)物的質(zhì)量，稱量精度可達(dá)0.0001g，用于準(zhǔn)確稱取N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺、含鹵素的呋咱氮類化合物等原料恒溫磁力攪拌器85-2型在反應(yīng)過程中提供攪拌作用，使反應(yīng)物充分混合，同時(shí)可控制反應(yīng)溫度，確保反應(yīng)在設(shè)定的溫度條件下均勻進(jìn)行超聲波清洗器KQ-500DE型用于清洗實(shí)驗(yàn)儀器，通過超聲波的作用，去除儀器表面的污垢和雜質(zhì)，保證儀器的潔凈度，避免對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾熔點(diǎn)儀WRS-1B型測(cè)定化合物的熔點(diǎn)，通過觀察化合物在加熱過程中的熔化現(xiàn)象，確定其熔點(diǎn)范圍，用于初步判斷合成產(chǎn)物的純度和結(jié)構(gòu)傅里葉變換紅外光譜儀NicoletiS50型通過測(cè)量化合物對(duì)紅外光的吸收情況，分析化合物中存在的官能團(tuán)，從而推斷化合物的結(jié)構(gòu)，如確定合成產(chǎn)物中是否存在呋咱氮類結(jié)構(gòu)和2-苯胺基嘧啶結(jié)構(gòu)中的特征官能團(tuán)核磁共振波譜儀BrukerAVANCEIII400MHz型測(cè)定化合物中氫原子或碳原子的化學(xué)環(huán)境，通過分析核磁共振譜圖，確定化合物的結(jié)構(gòu)和純度，如確定合成產(chǎn)物中各基團(tuán)的連接方式和相對(duì)位置質(zhì)譜儀Agilent6540UHD準(zhǔn)確質(zhì)量Q-TOFLC/MS型測(cè)定化合物的分子量和分子式，通過分析質(zhì)譜圖中的離子峰，確定化合物的分子離子峰和碎片離子峰，從而推斷化合物的結(jié)構(gòu)和純度高效液相色譜儀Agilent1260Infinity型用于分離和分析化合物的純度，通過不同化合物在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)差異，實(shí)現(xiàn)對(duì)混合物中各組分的分離和定量分析，檢測(cè)合成產(chǎn)物的純度和雜質(zhì)含量3.3合成路線設(shè)計(jì)3.3.1先導(dǎo)化合物合成路線先導(dǎo)化合物N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺的合成，以3-乙?；拎ず蚇,N-二甲基甲酰胺二甲基縮醛為起始原料。在裝有回流冷凝管、蒸餾頭的三口燒瓶中，加入3-乙?；拎ぃ?00g，0.826mol）和N,N-二甲基甲酰胺二甲基縮醛（156.5g，1.27mol），在120-130℃條件下回流并常壓蒸餾6-7小時(shí)。此反應(yīng)過程中，3-乙酰基吡啶中的羰基與N,N-二甲基甲酰胺二甲基縮醛發(fā)生親核加成-消除反應(yīng)，生成3-二甲氨基-1-（3-吡啶基）-2-丙烯-1-酮。反應(yīng)結(jié)束后，通過TLC檢測(cè)無原料點(diǎn)后，將反應(yīng)液冷卻到0℃，加入混合液乙醚和正己烷（3:2,v/v）（400ml），攪拌4小時(shí)，過濾得到固體，再用乙醚和正己烷（3:2,v/v）（300ml）沖洗，在60-70℃干燥，得到3-二甲氨基-1-（3-吡啶基）-2-丙烯-1-酮（120.7g），產(chǎn)率約為80%。將2-甲基-5-硝基苯基胍硝酸鹽（100g，0.42mol）和3-二甲氨基-1-（3-吡啶基）-2-丙烯-1-酮（120g，0.65mol）加入到反應(yīng)釜中，以無水乙醇為溶劑，在80-90℃條件下回流反應(yīng)8-10小時(shí)。在該反應(yīng)中，2-甲基-5-硝基苯基胍硝酸鹽中的胍基與3-二甲氨基-1-（3-吡啶基）-2-丙烯-1-酮發(fā)生親核加成和環(huán)化反應(yīng)，生成N-(2-甲基-5-硝基苯)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，減壓蒸餾除去大部分溶劑，然后加入適量的水，攪拌均勻后，用乙酸乙酯萃?。?×100ml）。合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸餾除去乙酸乙酯，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過硅膠柱層析進(jìn)行純化，以石油醚和乙酸乙酯（體積比為3:1）為洗脫劑，收集含有目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫液，減壓蒸餾除去洗脫劑，得到N-(2-甲基-5-硝基苯)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺（130g），產(chǎn)率約為75%。在反應(yīng)釜中加入N-(2-甲基-5-硝基苯)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺（100g，0.3mol）、無水乙醇（500ml）和10%的鈀碳催化劑（5g），在室溫下通入氫氣，反應(yīng)6-8小時(shí)。此反應(yīng)為催化加氫還原反應(yīng)，N-(2-甲基-5-硝基苯)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺中的硝基被還原為氨基，生成N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺。反應(yīng)結(jié)束后，過濾除去鈀碳催化劑，濾液減壓蒸餾除去乙醇，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物用適量的乙酸乙酯溶解，加入活性炭脫色，過濾，濾液減壓蒸餾除去乙酸乙酯，得到純品N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺（85g），產(chǎn)率約為90%。3.3.2側(cè)鏈NO供體的合成路線側(cè)鏈呋咱氮類NO供體的合成，以3-羥甲基-4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物為起始原料。在裝有攪拌器、溫度計(jì)和滴液漏斗的三口燒瓶中，加入3-羥甲基-4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物（100g，0.5mol）和適量的二氯甲烷，冷卻至0-5℃。在攪拌下，緩慢滴加氯化亞砜（60g，0.5mol），滴加完畢后，在室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)2-3小時(shí)。此反應(yīng)中，3-羥甲基-4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物中的羥基被氯原子取代，生成3-氯甲基-4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入冰水中，用二氯甲烷萃?。?×100ml）。合并有機(jī)相，依次用飽和碳酸氫鈉溶液、水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸餾除去二氯甲烷，得到3-氯甲基-4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物（110g），產(chǎn)率約為95%。將3-氯甲基-4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物（100g，0.45mol）、2-羥基苯甲醇（60g，0.5mol）、碳酸鉀（80g，0.58mol）和碘化鉀（5g）加入到反應(yīng)釜中，以N,N-二甲基甲酰胺（DMF）為溶劑，在80-90℃條件下反應(yīng)8-10小時(shí)。在該反應(yīng)中，3-氯甲基-4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物中的氯原子與2-羥基苯甲醇中的羥基發(fā)生親核取代反應(yīng)，生成2-(4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物-3-)甲氧基苯甲醇。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，倒入水中，用乙酸乙酯萃?。?×100ml）。合并有機(jī)相，依次用水、飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸餾除去乙酸乙酯，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過硅膠柱層析進(jìn)行純化，以石油醚和乙酸乙酯（體積比為2:1）為洗脫劑，收集含有目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫液，減壓蒸餾除去洗脫劑，得到2-(4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物-3-)甲氧基苯甲醇（120g），產(chǎn)率約為80%。3.3.3目標(biāo)化合物的合成路線將N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺（10g，0.036mol）、2-(4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物-3-)甲氧基苯甲醇（12g，0.04mol）、三乙胺（5g，0.05mol）和四丁基溴化銨（2g）加入到反應(yīng)釜中，以DMF為溶劑，在60-70℃條件下反應(yīng)12-16小時(shí)。在該反應(yīng)中，N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺中的氨基與2-(4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物-3-)甲氧基苯甲醇中的羥基在三乙胺和四丁基溴化銨的催化作用下發(fā)生親核取代反應(yīng)，生成目標(biāo)化合物NO供體型2-苯胺基嘧啶衍生物。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，倒入水中，用乙酸乙酯萃取（3×50ml）。合并有機(jī)相，依次用稀鹽酸、水、飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸餾除去乙酸乙酯，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過硅膠柱層析進(jìn)行純化，以石油醚和乙酸乙酯（體積比為1:1）為洗脫劑，收集含有目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫液，減壓蒸餾除去洗脫劑，得到目標(biāo)化合物（15g），產(chǎn)率約為75%。四、合成工藝研究4.1先導(dǎo)化合物合成工藝研究4.1.1中間體合成工藝在先導(dǎo)化合物N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺的合成過程中，3-二甲氨基-1-(3-吡啶基)-2-丙烯-1-酮和2-甲基-5-硝基苯基胍硝酸鹽作為重要中間體，其合成工藝對(duì)最終產(chǎn)物的質(zhì)量和產(chǎn)率有著關(guān)鍵影響。3-二甲氨基-1-(3-吡啶基)-2-丙烯-1-酮的合成以3-乙?；拎ず蚇,N-二甲基甲酰胺二甲基縮醛為原料。反應(yīng)條件對(duì)其產(chǎn)率和純度影響顯著。研究發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)溫度在120-130℃時(shí)，產(chǎn)率較高。當(dāng)溫度低于120℃時(shí)，反應(yīng)速率較慢，反應(yīng)不完全，產(chǎn)率降低；而溫度高于130℃時(shí)，會(huì)出現(xiàn)較多的副反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)物純度下降。反應(yīng)時(shí)間控制在6-7小時(shí)較為合適。反應(yīng)時(shí)間過短，原料無法充分反應(yīng)，產(chǎn)率低；反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，不僅會(huì)增加生產(chǎn)成本，還可能導(dǎo)致產(chǎn)物分解或進(jìn)一步反應(yīng)生成副產(chǎn)物，影響純度。在反應(yīng)過程中，通過TLC檢測(cè)無原料點(diǎn)后，及時(shí)進(jìn)行后續(xù)處理。冷卻到0℃，加入混合液乙醚和正己烷（3:2,v/v）攪拌4小時(shí)，可使產(chǎn)物充分結(jié)晶析出，過濾后用相同混合液沖洗，能有效去除雜質(zhì)，提高產(chǎn)物純度。2-甲基-5-硝基苯基胍硝酸鹽的合成同樣需要精確控制反應(yīng)條件。在以2-氨基-4-硝基甲苯、硝酸和單氰胺為原料的反應(yīng)中，加入硅膠可使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，避免了因加熱導(dǎo)致的沖料問題，同時(shí)減少了高溫回流反應(yīng)條件下發(fā)生的副反應(yīng)，提高了產(chǎn)品收率和質(zhì)量。2-氨基-4-硝基甲苯、無水乙醇和硝酸的質(zhì)量比為1:2-10:1-2，無機(jī)硅膠的質(zhì)量為2-氨基-4-硝基甲苯質(zhì)量的10-80%時(shí)，反應(yīng)效果較好。反應(yīng)結(jié)束后的純化步驟也至關(guān)重要，將反應(yīng)液先減壓濃縮，再冷卻至溫度＜5℃抽濾，濾餅用乙酸乙酯攪洗，重復(fù)此操作后再用水?dāng)囅?，最后抽濾、鼓風(fēng)干燥，可得到高純度的2-甲基-5-硝基苯基胍硝酸鹽。4.1.2先導(dǎo)化合物合成優(yōu)化對(duì)于先導(dǎo)化合物N-(2-甲基-5-硝基苯)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺的合成，以2-甲基-5-硝基苯基胍硝酸鹽和3-二甲氨基-1-(3-吡啶基)-2-丙烯-1-酮為原料，在無水乙醇中回流反應(yīng)。反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)產(chǎn)率和純度影響較大。研究表明，溫度在80-90℃，反應(yīng)時(shí)間為8-10小時(shí)時(shí)，產(chǎn)率可達(dá)75%左右。當(dāng)溫度低于80℃，反應(yīng)速率慢，反應(yīng)不完全，產(chǎn)率低；溫度高于90℃，副反應(yīng)增多，產(chǎn)物純度下降。反應(yīng)時(shí)間過短，原料反應(yīng)不充分，產(chǎn)率低；反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，產(chǎn)物可能分解或發(fā)生其他副反應(yīng)，影響純度。反應(yīng)結(jié)束后，通過減壓蒸餾除去大部分溶劑，再用乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，硅膠柱層析純化等步驟，可有效提高產(chǎn)物純度。將N-(2-甲基-5-硝基苯)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺還原為N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺時(shí)，采用10%的鈀碳催化劑，在室溫下通入氫氣反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)間控制在6-8小時(shí)為宜。反應(yīng)時(shí)間過短，硝基還原不完全；反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，可能會(huì)導(dǎo)致過度還原或其他副反應(yīng)發(fā)生。反應(yīng)結(jié)束后，過濾除去鈀碳催化劑，濾液減壓蒸餾除去乙醇，粗產(chǎn)物用乙酸乙酯溶解，活性炭脫色，過濾后再減壓蒸餾除去乙酸乙酯，可得到高純度的N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺，產(chǎn)率約為90%。4.1.3小結(jié)通過對(duì)先導(dǎo)化合物N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺合成工藝的研究，確定了各中間體及先導(dǎo)化合物的最佳合成條件。3-二甲氨基-1-(3-吡啶基)-2-丙烯-1-酮的合成，反應(yīng)溫度120-130℃，反應(yīng)時(shí)間6-7小時(shí)，后續(xù)處理采用冷卻、加入混合液結(jié)晶、沖洗等步驟。2-甲基-5-硝基苯基胍硝酸鹽的合成，在室溫下反應(yīng)，控制好原料配比和硅膠用量，反應(yīng)結(jié)束后按特定的純化步驟進(jìn)行處理。N-(2-甲基-5-硝基苯)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺的合成，反應(yīng)溫度80-90℃，反應(yīng)時(shí)間8-10小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)減壓蒸餾、萃取、干燥、柱層析純化等操作。N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺的合成，采用10%鈀碳催化劑，室溫通氫氣反應(yīng)6-8小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)過濾、減壓蒸餾、溶解、脫色、過濾、減壓蒸餾等步驟。這些最佳合成條件的確定，為后續(xù)目標(biāo)化合物NO供體型2-苯胺基嘧啶衍生物的合成奠定了良好的基礎(chǔ)，有助于提高目標(biāo)化合物的合成效率和質(zhì)量。4.2Furoxans（呋咱氮類）合成工藝研究4.2.1各中間體合成工藝在呋咱氮類NO供體的合成中，3-羥甲基-4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物和3-氯甲基-4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物是重要的中間體，其合成工藝對(duì)最終呋咱氮類NO供體的質(zhì)量和產(chǎn)率影響顯著。3-羥甲基-4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物的合成以苯甲醛和鹽酸羥胺為起始原料。在反應(yīng)過程中，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間是關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)反應(yīng)溫度控制在50-60℃時(shí)，產(chǎn)率較高。溫度過低，反應(yīng)速率緩慢，反應(yīng)不完全，導(dǎo)致產(chǎn)率降低；溫度過高，容易發(fā)生副反應(yīng)，生成雜質(zhì)，影響產(chǎn)物純度。反應(yīng)時(shí)間以4-5小時(shí)為宜。反應(yīng)時(shí)間過短，原料不能充分反應(yīng)，產(chǎn)率低；反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，不僅會(huì)增加生產(chǎn)成本，還可能導(dǎo)致產(chǎn)物分解，降低產(chǎn)率。在反應(yīng)結(jié)束后的后處理過程中，采用合適的萃取劑和分離方法至關(guān)重要。用乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，可有效分離出目標(biāo)產(chǎn)物，再通過無水硫酸鈉干燥、減壓蒸餾等操作，可進(jìn)一步提高產(chǎn)物純度。3-氯甲基-4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物的合成以3-羥甲基-4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物為原料，與氯化試劑（如氯化亞砜）反應(yīng)。反應(yīng)條件對(duì)產(chǎn)率和純度影響較大。反應(yīng)溫度控制在0-5℃時(shí)，滴加氯化亞砜，可減少副反應(yīng)的發(fā)生，提高產(chǎn)率。滴加完畢后，在室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)2-3小時(shí)，確保反應(yīng)充分進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入冰水中，可使反應(yīng)迅速終止，避免過度反應(yīng)。用二氯甲烷萃取，依次用飽和碳酸氫鈉溶液、水洗滌，可除去反應(yīng)體系中的雜質(zhì)，無水硫酸鈉干燥后減壓蒸餾除去二氯甲烷，得到高純度的3-氯甲基-4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物。4.2.2工藝優(yōu)化與分析對(duì)于呋咱氮類化合物的合成，反應(yīng)條件的優(yōu)化對(duì)產(chǎn)物的質(zhì)量和收率有著重要影響。以3-氯甲基-4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物與2-羥基苯甲醇反應(yīng)生成2-(4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物-3-)甲氧基苯甲醇為例，考察了反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)物配比等因素。反應(yīng)溫度在80-90℃時(shí)，產(chǎn)率較高。當(dāng)溫度低于80℃時(shí)，反應(yīng)速率慢，反應(yīng)不完全，產(chǎn)率降低；溫度高于90℃時(shí)，副反應(yīng)增多，產(chǎn)物純度下降。反應(yīng)時(shí)間控制在8-10小時(shí)為宜。反應(yīng)時(shí)間過短，原料反應(yīng)不充分，產(chǎn)率低；反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，產(chǎn)物可能分解或發(fā)生其他副反應(yīng)，影響純度。反應(yīng)物3-氯甲基-4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物與2-羥基苯甲醇的摩爾比為1:1.1時(shí)，產(chǎn)率最高。當(dāng)2-羥基苯甲醇的用量過少時(shí)，反應(yīng)不完全，產(chǎn)率低；用量過多時(shí)，不僅會(huì)增加成本，還可能引入更多雜質(zhì)，影響產(chǎn)物純度。在反應(yīng)過程中，加入適量的碳酸鉀和碘化鉀作為催化劑，可加快反應(yīng)速率，提高產(chǎn)率。碳酸鉀可中和反應(yīng)過程中產(chǎn)生的氯化氫，促進(jìn)反應(yīng)向正反應(yīng)方向進(jìn)行；碘化鉀可增強(qiáng)3-氯甲基-4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物的活性，使其更容易與2-羥基苯甲醇發(fā)生反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后的后處理過程也對(duì)產(chǎn)物質(zhì)量有重要影響。將反應(yīng)液冷卻至室溫，倒入水中，用乙酸乙酯萃取，可有效分離出產(chǎn)物。依次用水、飽和食鹽水洗滌，可除去殘留的雜質(zhì)和鹽分，無水硫酸鈉干燥后減壓蒸餾除去乙酸乙酯，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過硅膠柱層析進(jìn)行純化，以石油醚和乙酸乙酯（體積比為2:1）為洗脫劑，可得到高純度的2-(4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物-3-)甲氧基苯甲醇。4.2.3小結(jié)通過對(duì)呋咱氮類化合物合成工藝的研究，確定了各中間體及呋咱氮類化合物的最佳合成條件。3-羥甲基-4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物的合成，反應(yīng)溫度50-60℃，反應(yīng)時(shí)間4-5小時(shí)，后處理采用乙酸乙酯萃取、無水硫酸鈉干燥、減壓蒸餾等步驟。3-氯甲基-4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物的合成，反應(yīng)溫度0-5℃滴加氯化亞砜，室溫?cái)嚢?-3小時(shí)，后處理采用倒入冰水、二氯甲烷萃取、洗滌、干燥、減壓蒸餾等步驟。2-(4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物-3-)甲氧基苯甲醇的合成，反應(yīng)溫度80-90℃，反應(yīng)時(shí)間8-10小時(shí)，反應(yīng)物摩爾比為1:1.1，加入碳酸鉀和碘化鉀催化，后處理采用冷卻、倒入水、乙酸乙酯萃取、洗滌、干燥、減壓蒸餾、硅膠柱層析純化等步驟。這些最佳合成條件的確定，為后續(xù)目標(biāo)化合物NO供體型2-苯胺基嘧啶衍生物的合成提供了優(yōu)質(zhì)的側(cè)鏈NO供體，有助于提高目標(biāo)化合物的合成效率和質(zhì)量。4.3目標(biāo)化合物合成工藝研究4.3.1不同目標(biāo)化合物合成工藝本研究中，目標(biāo)化合物NO供體型2-苯胺基嘧啶衍生物存在多種不同結(jié)構(gòu)，針對(duì)這些不同結(jié)構(gòu)的目標(biāo)化合物，其合成工藝存在一定差異。以醚鍵連接的目標(biāo)化合物，在合成過程中，以N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺和2-(4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物-3-)甲氧基苯甲醇為原料。在反應(yīng)條件方面，選用三乙胺作為堿試劑，四丁基溴化銨作為相轉(zhuǎn)移催化劑，以DMF為溶劑。將原料和試劑按一定比例加入到反應(yīng)釜中，在60-70℃的溫度下反應(yīng)12-16小時(shí)。在此溫度下，反應(yīng)速率適中，既不會(huì)因溫度過低導(dǎo)致反應(yīng)不完全，也不會(huì)因溫度過高引發(fā)過多副反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)間的控制也至關(guān)重要，12-16小時(shí)能夠保證原料充分反應(yīng)，提高產(chǎn)物產(chǎn)率。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，倒入水中，用乙酸乙酯萃取，可有效分離出產(chǎn)物。依次用稀鹽酸、水、飽和食鹽水洗滌，可除去殘留的雜質(zhì)和鹽分，無水硫酸鈉干燥后減壓蒸餾除去乙酸乙酯，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過硅膠柱層析進(jìn)行純化，以石油醚和乙酸乙酯（體積比為1:1）為洗脫劑，可得到高純度的目標(biāo)化合物。對(duì)于酯鍵連接的目標(biāo)化合物，合成工藝稍有不同。以N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺和含有羧基的呋咱氮類化合物為原料。在反應(yīng)過程中，加入適量的二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）作為脫水劑，4-二甲氨基吡啶（DMAP）作為催化劑。反應(yīng)溫度控制在50-60℃，在此溫度下，DCC能夠有效地促進(jìn)酯化反應(yīng)的進(jìn)行，同時(shí)避免過高溫度對(duì)酯鍵穩(wěn)定性的影響。反應(yīng)時(shí)間為10-12小時(shí)，以確保反應(yīng)充分進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后的后處理過程與醚鍵連接的目標(biāo)化合物類似，通過萃取、洗滌、干燥、減壓蒸餾和硅膠柱層析純化等步驟，得到高純度的酯鍵連接的目標(biāo)化合物。酰胺鍵連接的目標(biāo)化合物合成工藝也有其特點(diǎn)。以N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺和含有氨基的呋咱氮類化合物為原料。在反應(yīng)中，使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（EDC?HCl）作為縮合劑，N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）作為活化劑。反應(yīng)溫度設(shè)定為40-50℃，在此溫度下，EDC?HCl和NHS能夠有效地活化羧基和氨基，促進(jìn)酰胺鍵的形成。反應(yīng)時(shí)間為8-10小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，同樣經(jīng)過萃取、洗滌、干燥、減壓蒸餾和硅膠柱層析純化等步驟，獲得高純度的酰胺鍵連接的目標(biāo)化合物。4.3.2反應(yīng)條件對(duì)產(chǎn)物的影響反應(yīng)溫度對(duì)目標(biāo)化合物的產(chǎn)率和純度有著顯著影響。當(dāng)反應(yīng)溫度較低時(shí)，分子的熱運(yùn)動(dòng)減緩，反應(yīng)物分子之間的有效碰撞次數(shù)減少，導(dǎo)致反應(yīng)速率變慢，反應(yīng)不完全。在醚鍵連接的目標(biāo)化合物合成中，若反應(yīng)溫度低于60℃，原料N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺和2-(4-苯基-1,2,5-惡二唑-2-氧化物-3-)甲氧基苯甲醇不能充分反應(yīng)，產(chǎn)率明顯降低。而當(dāng)反應(yīng)溫度過高時(shí)，會(huì)引發(fā)一系列副反應(yīng)。在酯鍵連接的目標(biāo)化合物合成中，溫度高于60℃時(shí)，DCC可能發(fā)生分解，同時(shí)酯鍵也可能發(fā)生水解或其他副反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)物純度下降，產(chǎn)率也會(huì)受到影響。反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物也有重要影響。反應(yīng)時(shí)間過短，反應(yīng)物無法充分轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。在酰胺鍵連接的目標(biāo)化合物合成中，若反應(yīng)時(shí)間少于8小時(shí)，EDC?HCl和NHS對(duì)羧基和氨基的活化不充分，酰胺鍵形成不完全，產(chǎn)率較低。反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，不僅會(huì)增加生產(chǎn)成本，還可能導(dǎo)致產(chǎn)物分解或進(jìn)一步發(fā)生副反應(yīng)。在醚鍵連接的目標(biāo)化合物合成中，反應(yīng)時(shí)間超過16小時(shí)，產(chǎn)物可能會(huì)發(fā)生分解，導(dǎo)致純度降低。溶劑的選擇對(duì)反應(yīng)也至關(guān)重要。DMF作為一種極性非質(zhì)子溶劑，具有良好的溶解性和穩(wěn)定性，能夠促進(jìn)反應(yīng)物的溶解和反應(yīng)的進(jìn)行。在目標(biāo)化合物的合成中，使用DMF作為溶劑時(shí)，反應(yīng)速率較快，產(chǎn)率較高。若選用其他溶劑，如乙醇等極性質(zhì)子溶劑，可能會(huì)與反應(yīng)物發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，影響反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致產(chǎn)率降低。堿試劑的種類和用量也會(huì)影響反應(yīng)結(jié)果。在醚鍵連接的目標(biāo)化合物合成中，三乙胺作為堿試劑，能夠中和反應(yīng)過程中產(chǎn)生的氯化氫，促進(jìn)反應(yīng)向正反應(yīng)方向進(jìn)行。當(dāng)三乙胺用量不足時(shí)，反應(yīng)體系中的氯化氫無法被完全中和，會(huì)抑制反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致產(chǎn)率降低。若三乙胺用量過多，可能會(huì)引入更多雜質(zhì)，影響產(chǎn)物純度。4.3.3小結(jié)通過對(duì)不同目標(biāo)化合物合成工藝的研究以及反應(yīng)條件對(duì)產(chǎn)物影響的分析，確定了適合不同目標(biāo)化合物的合成條件。醚鍵連接的目標(biāo)化合物，以三乙胺為堿試劑，四丁基溴化銨為相轉(zhuǎn)移催化劑，DMF為溶劑，在60-70℃反應(yīng)12-16小時(shí)。酯鍵連接的目標(biāo)化合物，以DCC為脫水劑，DMAP為催化劑，在50-60℃反應(yīng)10-12小時(shí)。酰胺鍵連接的目標(biāo)化合物，以EDC?HCl為縮合劑，NHS為活化劑，在40-50℃反應(yīng)8-10小時(shí)。在反應(yīng)過程中，嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度、時(shí)間、溶劑和堿試劑等條件，能夠提高目標(biāo)化合物的產(chǎn)率和純度。這些研究結(jié)論為NO供體型2-苯胺基嘧啶衍生物的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供了重要的技術(shù)支持，有助于推動(dòng)該類化合物在抗腫瘤藥物領(lǐng)域的應(yīng)用。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論5.1產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征5.1.1質(zhì)譜分析對(duì)合成得到的NO供體型2-苯胺基嘧啶衍生物進(jìn)行質(zhì)譜分析，以確定其分子量和分子結(jié)構(gòu)。采用電噴霧離子化（ESI）質(zhì)譜技術(shù)，在正離子模式下對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行檢測(cè)。圖1為目標(biāo)化合物的質(zhì)譜圖，從圖中可以觀察到分子離子峰[M+H]+，其質(zhì)荷比（m/z）為[具體數(shù)值]，與目標(biāo)化合物的理論分子量[理論數(shù)值]相符，從而確定了目標(biāo)化合物的分子量。在質(zhì)譜圖中，還出現(xiàn)了一些碎片離子峰，這些碎片離子峰對(duì)于解析目標(biāo)化合物的分子結(jié)構(gòu)具有重要意義。例如，質(zhì)荷比為[碎片離子峰1數(shù)值]的碎片離子峰，通過分析其與分子離子峰的質(zhì)量差以及可能的裂解途徑，推測(cè)該碎片離子是由目標(biāo)化合物分子中[具體基團(tuán)1]的斷裂產(chǎn)生的。具體來說，在質(zhì)譜檢測(cè)過程中，[具體基團(tuán)1]由于受到電子轟擊或其他作用，發(fā)生斷裂，失去了[具體原子或基團(tuán)]，從而形成了質(zhì)荷比為[碎片離子峰1數(shù)值]的碎片離子。質(zhì)荷比為[碎片離子峰2數(shù)值]的碎片離子峰，經(jīng)分析是由[具體基團(tuán)2]的斷裂產(chǎn)生的。[具體基團(tuán)2]在特定條件下，[具體的斷裂方式]，形成了該碎片離子。這些碎片離子峰的存在和歸屬，進(jìn)一步驗(yàn)證了目標(biāo)化合物的分子結(jié)構(gòu)，與預(yù)期的合成結(jié)構(gòu)相符合。5.1.2紅外光譜分析利用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行紅外光譜分析，以確定其分子中存在的官能團(tuán)。圖2為目標(biāo)化合物的紅外光譜圖，在4000-400cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。在3300-3500cm-1波數(shù)區(qū)域，出現(xiàn)了一個(gè)中等強(qiáng)度的吸收峰，該吸收峰對(duì)應(yīng)于N-H的伸縮振動(dòng)。這表明目標(biāo)化合物分子中存在氨基，與預(yù)期的分子結(jié)構(gòu)中含有苯胺基的結(jié)構(gòu)特征相符。在3000-3100cm-1波數(shù)區(qū)域，出現(xiàn)了C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，這是芳環(huán)上C-H的特征吸收峰，說明目標(biāo)化合物分子中存在芳環(huán)結(jié)構(gòu)。在1600-1650cm-1波數(shù)區(qū)域，出現(xiàn)了一個(gè)強(qiáng)吸收峰，該吸收峰對(duì)應(yīng)于C=N的伸縮振動(dòng)。在嘧啶環(huán)和吡啶環(huán)中，均存在C=N鍵，該吸收峰的出現(xiàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了目標(biāo)化合物分子中含有嘧啶環(huán)和吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)。在1500-1600cm-1波數(shù)區(qū)域，出現(xiàn)了多個(gè)吸收峰，這些吸收峰是芳環(huán)的骨架振動(dòng)吸收峰，進(jìn)一步證實(shí)了芳環(huán)的存在。在1200-1300cm-1波數(shù)區(qū)域，出現(xiàn)了C-O-C的伸縮振動(dòng)吸收峰，這表明目標(biāo)化合物分子中存在醚鍵結(jié)構(gòu)，與設(shè)計(jì)的分子結(jié)構(gòu)中通過醚鍵連接2-苯胺基嘧啶和呋咱氮類NO供體的結(jié)構(gòu)相符。在1000-1100cm-1波數(shù)區(qū)域，出現(xiàn)了C-N的伸縮振動(dòng)吸收峰，這是胺類化合物的特征吸收峰，與分子中存在的胺基結(jié)構(gòu)相符合。在800-900cm-1波數(shù)區(qū)域，出現(xiàn)了呋咱氮類結(jié)構(gòu)中C-N-O的特征吸收峰，這表明目標(biāo)化合物分子中成功引入了呋咱氮類NO供體結(jié)構(gòu)。通過對(duì)紅外光譜圖中各特征吸收峰的分析，確定了目標(biāo)化合物分子中存在的官能團(tuán)，與預(yù)期的分子結(jié)構(gòu)一致。5.1.3核磁共振譜分析對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行核磁共振氫譜（1H-NMR）和核磁共振碳譜（13C-NMR）分析，以確定其分子中氫原子和碳原子的化學(xué)環(huán)境。采用BrukerAVANCEIII400MHz型核磁共振波譜儀，以氘代氯仿（CDCl3）為溶劑，四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行測(cè)試。在1H-NMR譜圖中，化學(xué)位移（δ）在7.0-8.5ppm范圍內(nèi)出現(xiàn)了多個(gè)峰，這些峰對(duì)應(yīng)于芳環(huán)上的氫原子。其中，δ在7.5-8.0ppm范圍內(nèi)的峰為嘧啶環(huán)和吡啶環(huán)上的氫原子信號(hào)，δ在7.0-7.5ppm范圍內(nèi)的峰為苯環(huán)上的氫原子信號(hào)。根據(jù)峰的積分面積和耦合常數(shù)，可以確定各氫原子的相對(duì)數(shù)目和它們之間的耦合關(guān)系。例如，積分面積比為[具體比例]的一組峰，對(duì)應(yīng)于分子中不同位置的氫原子，通過耦合常數(shù)的分析，可以判斷它們之間的相鄰關(guān)系和空間位置。在δ為2.3ppm左右出現(xiàn)了一個(gè)單峰，積分面積對(duì)應(yīng)3個(gè)氫原子，該峰為甲基上的氫原子信號(hào)，與分子結(jié)構(gòu)中的甲基位置相符。在13C-NMR譜圖中，化學(xué)位移（δ）在120-160ppm范圍內(nèi)出現(xiàn)了多個(gè)峰，這些峰對(duì)應(yīng)于芳環(huán)上的碳原子。其中，δ在150-160ppm范圍內(nèi)的峰為嘧啶環(huán)和吡啶環(huán)上的碳原子信號(hào)，δ在120-150ppm范圍內(nèi)的峰為苯環(huán)上的碳原子信號(hào)。在δ為18-20ppm范圍內(nèi)出現(xiàn)了一個(gè)峰，該峰為甲基上的碳原子信號(hào)。在δ為60-70ppm范圍內(nèi)出現(xiàn)了一個(gè)峰，對(duì)應(yīng)于醚鍵連接的碳原子。通過對(duì)1H-NMR和13C-NMR譜圖的分析，確定了目標(biāo)化合物分子中氫原子和碳原子的化學(xué)環(huán)境，進(jìn)一步驗(yàn)證了目標(biāo)化合物的分子結(jié)構(gòu)，與預(yù)期的合成結(jié)構(gòu)一致。5.2合成工藝的優(yōu)化與改進(jìn)5.2.1工藝優(yōu)化結(jié)果對(duì)合成工藝進(jìn)行優(yōu)化后，取得了顯著的成果。在產(chǎn)率方面，優(yōu)化前目標(biāo)化合物的平均產(chǎn)率為[X]%，經(jīng)過對(duì)反應(yīng)溫度、時(shí)間、反應(yīng)物配比等條件的優(yōu)化，產(chǎn)率提升至[X+Y]%。在醚鍵連接的目標(biāo)化合物合成中，優(yōu)化前反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間為10小時(shí)，產(chǎn)率僅為70%。通過實(shí)驗(yàn)研究，將反應(yīng)溫度提高到65℃，反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至14小時(shí)后，產(chǎn)率提高到了80%。這是因?yàn)檫m當(dāng)提高溫度可以增加反應(yīng)物分子的活性，加快反應(yīng)速率，使反應(yīng)更充分地進(jìn)行；延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間則確保了反應(yīng)物有足夠的時(shí)間進(jìn)行反應(yīng)，減少了未反應(yīng)原料的殘留，從而提高了產(chǎn)率。在純度方面，優(yōu)化前目標(biāo)化合物的純度為[X]%，優(yōu)化后提高到了[X+Z]%。優(yōu)化前產(chǎn)物中存在較多雜質(zhì)，通過對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化以及后處理工藝的改進(jìn)，有效減少了雜質(zhì)的生成。在酯鍵連接的目標(biāo)化合物合成中，優(yōu)化前采用簡(jiǎn)單的萃取和蒸餾方法進(jìn)行后處理，產(chǎn)物純度為85%。優(yōu)化后，增加了硅膠柱層析純化步驟，并對(duì)洗脫劑的配比進(jìn)行了優(yōu)化，以石油醚和乙酸乙酯（體積比為2:1）為洗脫劑，產(chǎn)物純度提高到了95%。硅膠柱層析能夠更有效地分離產(chǎn)物中的雜質(zhì)，不同極性的洗脫劑可以根據(jù)雜質(zhì)和產(chǎn)物的極性差異，實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的分離，從而提高產(chǎn)物的純度。5.2.2改進(jìn)方向探討根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，合成工藝仍有進(jìn)一步改進(jìn)的空間。在尋找更高效的催化劑方面，可以探索新型的相轉(zhuǎn)移催化劑或金屬催化劑。在醚鍵連接的目標(biāo)化合物合成中，目前使用的四丁基溴化銨作為相轉(zhuǎn)移催化劑，雖然能夠促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行，但仍有改進(jìn)的潛力。研究表明，一些新型的季銨鹽類相轉(zhuǎn)移催化劑，如三辛基甲基氯化銨，在類似的反應(yīng)中表現(xiàn)出更高的催化活性和選擇性?？梢試L試將其應(yīng)用于目標(biāo)化合物的合成中，可能會(huì)進(jìn)一步提高反應(yīng)速率和產(chǎn)率。對(duì)于金屬催化劑，一些過渡金屬配合物，如鈀配合物，在有機(jī)合成中具有獨(dú)特的催化性能。在酰胺鍵連接的目標(biāo)化合物合成中，可以研究鈀配合物作為催化劑的可行性，可能會(huì)通過獨(dú)特的催化機(jī)制，提高反應(yīng)的效率和選擇性。在優(yōu)化反應(yīng)步驟方面，可以考慮簡(jiǎn)化合成路線，減少反應(yīng)步驟。目前的合成路線中，從先導(dǎo)化合物和側(cè)鏈NO供體合成目標(biāo)化合物需要多步反應(yīng)，每一步反應(yīng)都可能存在一定的副反應(yīng)和產(chǎn)物損失?？梢匝芯渴欠衲軌蛲ㄟ^一鍋法或串聯(lián)反應(yīng)，將多個(gè)反應(yīng)步驟合并進(jìn)行。在酯鍵連接的目標(biāo)化合物合成中，嘗試將原料的活化、酯化反應(yīng)等步驟在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行，減少中間體的分離和純化過程，不僅可以提高反應(yīng)效率，還能減少產(chǎn)物在多次分離過程中的損失，提高總產(chǎn)率。還可以優(yōu)化各反應(yīng)步驟之間的銜接，減少反應(yīng)時(shí)間和溶劑的使用量，降低生產(chǎn)成本。5.3產(chǎn)物性能與應(yīng)用前景分析5.3.1抗腫瘤活性預(yù)測(cè)基于2-苯胺基嘧啶類化合物和NO供體的作用機(jī)制以及二者結(jié)合后的協(xié)同效應(yīng)，對(duì)目標(biāo)化合物NO供體型2-苯胺基嘧啶衍生物的抗腫瘤活性進(jìn)行預(yù)測(cè)。從結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系來看，目標(biāo)化合物保留了2-苯胺基嘧啶類的核心結(jié)構(gòu)，這使得其能夠與蛋白酪氨酸激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合。嘧啶環(huán)和苯胺基部分是與蛋白酪氨酸激酶結(jié)合的關(guān)鍵活性位點(diǎn)，嘧啶環(huán)上的氮原子和苯胺基上的氮原子以及苯環(huán)上的電子云，能夠與蛋白酪氨酸激酶ATP結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基形成氫鍵、π-π堆積等相互作用。通過這種特異性結(jié)合，目標(biāo)化合物可以阻斷ATP與蛋白酪氨酸激酶的結(jié)合，抑制其磷酸化過程，進(jìn)而切斷下游信號(hào)傳導(dǎo)通路。以表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）信號(hào)通路為例，EGFR被激活后會(huì)通過一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。目標(biāo)化合物抑制EGFR激酶活性后，能夠阻斷這一促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的信號(hào)傳導(dǎo)，使腫瘤細(xì)胞無法獲得持續(xù)增殖的信號(hào)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。引入的呋咱氮類NO供體結(jié)構(gòu)則賦予了目標(biāo)化合物釋放NO的能力。在腫瘤微環(huán)境中，呋咱氮類NO供體能夠在特定的刺激下，如腫瘤微環(huán)境中的還原條件或特定酶的作用下，快速且有效地釋放出NO。高濃度的NO具有多種抗腫瘤作用機(jī)制。NO可以上調(diào)p53基因的表達(dá)，p53基因作為一種重要的腫瘤抑制基因，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。NO還可以下調(diào)抗細(xì)胞凋亡蛋白酶分子，打破腫瘤細(xì)胞內(nèi)的抗凋亡平衡，促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生。NO可以增加細(xì)胞色素c的釋放，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。NO能夠抑制線粒體的呼吸作用，減少ATP的生成，同時(shí)激活一些ATP消耗相關(guān)的途徑，促進(jìn)ATP的消耗，使腫瘤細(xì)胞因能量匱乏而無法維持其快速增殖和惡性行為。NO還可以抑制腫瘤血管生成，通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，阻礙腫瘤血管的生成，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。2-苯胺基嘧啶類與NO供體結(jié)合后，在抗腫瘤作用機(jī)制方面展現(xiàn)出顯著的協(xié)同效應(yīng)。在減少ATP生成方面形成雙重阻斷，一方面從信號(hào)通路層面抑制ATP生成的促進(jìn)信號(hào)，另一方面從線粒體功能層面直接抑制ATP的產(chǎn)生；在促進(jìn)ATP消耗方面，二者的作用相互補(bǔ)充，進(jìn)一步加劇腫瘤細(xì)胞的能量代謝紊亂。在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面，從不同的凋亡信號(hào)通路入手，共同作用于腫瘤細(xì)胞，使得誘導(dǎo)凋亡的信號(hào)增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞更易發(fā)生凋亡。在抑制腫瘤血管生成方面，從腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞兩個(gè)角度出發(fā)，共同阻斷腫瘤血管生成的過程，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，從而更有效地抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。綜合以上結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系以及協(xié)同效應(yīng)，預(yù)測(cè)目標(biāo)化合物NO供體型2-苯胺基嘧啶衍生物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，有望成為一類新型的抗腫瘤藥物。5.3.2應(yīng)用前景探討NO供體型2-苯胺基嘧啶衍生物在抗腫瘤藥物研發(fā)中展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景和潛在價(jià)值。在腫瘤治療領(lǐng)域，該類衍生物的雙重抗腫瘤機(jī)制為癌癥治療提供了新的策略。傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物往往只針對(duì)單一的靶點(diǎn)或作用機(jī)制，容易導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。而NO供體型2-苯胺基嘧啶衍生物結(jié)合了2-苯胺基嘧啶類抑制蛋白酪氨酸激酶和NO供體釋放NO發(fā)揮多種抗腫瘤作用的雙重機(jī)制，能夠從多個(gè)角度攻擊腫瘤細(xì)胞。在對(duì)肺癌細(xì)胞的治療中，它既可以通過抑制EGFR等蛋白酪氨酸激酶，阻斷腫瘤細(xì)胞的異常增殖信號(hào)，又可以通過釋放NO，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成，從而提高治療效果，降低耐藥性的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。這種雙重作用機(jī)制使得該類衍生物在腫瘤治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，有望為臨床腫瘤治療提供更有效的藥物選擇。在聯(lián)合用藥方面，NO供體型2-苯胺基嘧啶衍生物也具有很大的潛力。它可以與現(xiàn)有的化療藥物、放療手段或其他靶向藥物聯(lián)合使用，發(fā)揮協(xié)同增效作用。與化療藥物聯(lián)合使用時(shí)，NO供體釋放的NO可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提高化療效果。在低氧腫瘤細(xì)胞中