miR-136與miR-23b：靜脈平滑肌細(xì)胞增殖與遷移調(diào)控機(jī)制的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義血管疾病是全球范圍內(nèi)威脅人類健康的重要疾病之一，其發(fā)病率和死亡率居高不下。靜脈平滑肌細(xì)胞（VascularSmoothMuscleCells，VSMCs）作為靜脈血管壁的主要細(xì)胞成分，對(duì)于維持血管的正常結(jié)構(gòu)和功能起著關(guān)鍵作用。在生理狀態(tài)下，靜脈平滑肌細(xì)胞保持著相對(duì)穩(wěn)定的表型和功能，以確保靜脈血管的正常舒縮和物質(zhì)交換。然而，當(dāng)機(jī)體受到各種病理因素刺激時(shí)，靜脈平滑肌細(xì)胞會(huì)發(fā)生異常的增殖和遷移，這一過程與多種血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)（CABG）中，常使用自體靜脈作為移植血管，但術(shù)后由于靜脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖和遷移，會(huì)導(dǎo)致移植靜脈內(nèi)膜增生、血管再狹窄，嚴(yán)重影響手術(shù)的遠(yuǎn)期效果。據(jù)統(tǒng)計(jì)，CABG術(shù)后10年，移植靜脈的通暢率僅為50%左右，主要原因就是靜脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖和遷移引發(fā)的血管病變。在下肢靜脈曲張中，靜脈平滑肌細(xì)胞的功能失調(diào)導(dǎo)致靜脈壁變薄、擴(kuò)張，進(jìn)而引起血液回流障礙，出現(xiàn)靜脈曲張、下肢腫脹、疼痛等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。在深靜脈血栓形成后綜合征中，靜脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移參與了血栓的機(jī)化和再通過程，若異常發(fā)生，可能導(dǎo)致靜脈瓣膜功能受損，引發(fā)慢性靜脈功能不全。深入研究靜脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于理解血管疾病的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn)具有重要意義。MicroRNAs（miRNAs）作為一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，通過與靶mRNA的3'-UTR區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA的翻譯過程或促進(jìn)其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。越來越多的研究表明，miRNAs在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移等生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。其中，miR-136和miR-23b作為miRNAs家族中的重要成員，被發(fā)現(xiàn)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，尤其在靜脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移過程中可能扮演著重要角色。研究miR-136和miR-23b對(duì)靜脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)控作用及機(jī)制，有助于從分子層面揭示血管疾病的發(fā)病機(jī)制，為開發(fā)新型的治療策略提供理論依據(jù)。如果能夠明確miR-136和miR-23b的具體作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，就有可能通過調(diào)節(jié)它們的表達(dá)或活性，來干預(yù)靜脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖和遷移，從而為血管疾病的治療開辟新的途徑。這不僅有助于提高血管疾病的治療效果，降低患者的死亡率和致殘率，還能為臨床治療提供更精準(zhǔn)、更有效的方法，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)意義。1.2研究現(xiàn)狀近年來，隨著對(duì)miRNAs研究的不斷深入，miR-136和miR-23b在細(xì)胞生物學(xué)過程中的作用逐漸受到關(guān)注。在靜脈平滑肌細(xì)胞相關(guān)研究中，已有部分成果揭示了它們的潛在價(jià)值。對(duì)于miR-136，研究發(fā)現(xiàn)其在多種生理和病理過程中發(fā)揮作用。在血管系統(tǒng)中，相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，miR-136在移植靜脈內(nèi)膜新生過程中表達(dá)出現(xiàn)顯著變化。如建立大鼠頸總動(dòng)脈自體移植靜脈模型后，通過熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，移植1、2周后移植靜脈miR-136的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)側(cè)未處理靜脈，而此時(shí)正是靜脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移較為活躍的時(shí)期，提示miR-136與靜脈平滑肌細(xì)胞的異常活動(dòng)可能存在關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步通過CCK-8和EDU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，Transwell和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移情況，結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-136可顯著抑制處于增殖狀態(tài)的靜脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移能力。通過生物信息學(xué)分析及雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證，確定了Steap3為miR-136的靶基因，miR-136可能通過抑制Steap3的表達(dá)來調(diào)控靜脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，這為深入理解移植靜脈內(nèi)膜增生的機(jī)制提供了新的視角，也提示miR-136有望成為抑制移植靜脈內(nèi)膜新生的潛在治療靶點(diǎn)。在miR-23b的研究方面，雖然目前在靜脈平滑肌細(xì)胞中的直接研究相對(duì)較少，但在其他相關(guān)領(lǐng)域的研究為其在靜脈平滑肌細(xì)胞中的作用機(jī)制提供了一定的線索。在腫瘤研究領(lǐng)域，miR-23b被發(fā)現(xiàn)參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等過程。如在前列腺癌組織中，miR-23b的表達(dá)顯著降低，且隨著病情加重，其表達(dá)水平越來越低。低表達(dá)的miR-23b與前列腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血管侵犯等不良病理變化相關(guān)，預(yù)后也相對(duì)較差，這表明miR-23b可能對(duì)細(xì)胞的遷移和侵襲具有抑制作用。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，有研究表明miR-23b對(duì)其增殖和遷移也有重要影響，其能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而影響血管生成過程?？紤]到靜脈平滑肌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞在血管系統(tǒng)中的密切聯(lián)系，以及細(xì)胞增殖和遷移機(jī)制在不同細(xì)胞類型之間可能存在的共性，推測(cè)miR-23b在靜脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移過程中也可能發(fā)揮關(guān)鍵作用，但具體的作用機(jī)制尚未明確。盡管目前對(duì)miR-136和miR-23b在靜脈平滑肌細(xì)胞中的研究取得了一定進(jìn)展，但仍存在許多不足之處。對(duì)于miR-136，雖然已經(jīng)確定了Steap3為其靶基因，但miR-136/Steap3信號(hào)軸是否還參與其他信號(hào)通路，以及這些信號(hào)通路之間如何相互作用來共同調(diào)控靜脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，尚不清楚。而且，在體內(nèi)復(fù)雜的生理病理環(huán)境下，miR-136的表達(dá)調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究，包括哪些上游分子或信號(hào)通路參與調(diào)控miR-136的表達(dá)，以及它們?nèi)绾雾憫?yīng)不同的刺激因素。對(duì)于miR-23b，目前缺乏在靜脈平滑肌細(xì)胞中的直接實(shí)驗(yàn)證據(jù)來明確其對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的具體作用，也不清楚其在靜脈平滑肌細(xì)胞中的靶基因及相關(guān)信號(hào)通路。在不同病理狀態(tài)下，如在冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)后移植靜脈病變、下肢靜脈曲張、深靜脈血栓形成后綜合征等疾病中，miR-136和miR-23b的表達(dá)變化及作用機(jī)制是否存在差異，也有待進(jìn)一步研究。填補(bǔ)這些研究空白，將有助于更全面地揭示miR-136和miR-23b在靜脈平滑肌細(xì)胞中的作用機(jī)制，為血管疾病的治療提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探究miR-136和miR-23b在靜脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移過程中的具體作用及分子機(jī)制，為血管疾病的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。具體研究目的如下：明確miR-136和miR-23b對(duì)靜脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響，確定miR-136和miR-23b在靜脈平滑肌細(xì)胞中的靶基因，揭示miR-136和miR-23b通過靶基因調(diào)控靜脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的信號(hào)通路。為實(shí)現(xiàn)上述研究目的，本研究擬采用以下研究方法：首先進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，獲取人或動(dòng)物的靜脈血管組織，通過酶消化法或組織塊貼壁法進(jìn)行靜脈平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)，使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%融合時(shí)進(jìn)行傳代。將培養(yǎng)的靜脈平滑肌細(xì)胞分為對(duì)照組、miR-136過表達(dá)組、miR-136抑制組、miR-23b過表達(dá)組、miR-23b抑制組等。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-136模擬物、miR-136抑制劑、miR-23b模擬物、miR-23b抑制劑等轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，在96孔板中接種細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)加入CCK-8試劑，孵育后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處的吸光度值；通過EdU實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步直觀觀察細(xì)胞增殖情況，按照EdU試劑盒說明操作，使用熒光顯微鏡觀察并統(tǒng)計(jì)EdU陽性細(xì)胞數(shù)。運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，在上室加入轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，下室加入含血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)后固定、染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)也用于檢測(cè)遷移能力，在細(xì)胞單層上劃痕，培養(yǎng)后拍照，計(jì)算細(xì)胞遷移率。其次構(gòu)建動(dòng)物模型，構(gòu)建大鼠頸總動(dòng)脈自體移植靜脈模型，將大鼠頸總靜脈移植到同側(cè)頸總動(dòng)脈，術(shù)后給予抗感染處理。分別在術(shù)后1、2、4周等時(shí)間點(diǎn)取材，獲取移植靜脈組織。將miR-136模擬物、miR-136抑制劑、miR-23b模擬物、miR-23b抑制劑通過局部注射或尾靜脈注射等方式導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)。通過組織切片、HE染色觀察移植靜脈內(nèi)膜增生情況，測(cè)量?jī)?nèi)膜厚度和中膜厚度，計(jì)算內(nèi)膜/中膜厚度比值；采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）等增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)，評(píng)估細(xì)胞增殖情況。最后進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)miR-136和miR-23b在細(xì)胞和組織中的表達(dá)水平，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以U6為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。利用生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)miR-136和miR-23b的潛在靶基因，通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證靶基因，將靶基因的3'-UTR區(qū)域克隆到熒光素酶報(bào)告載體中，與miR-136或miR-23b共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性。采用免疫印跡法檢測(cè)靶基因及相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平，提取細(xì)胞或組織總蛋白，進(jìn)行SDS電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，孵育一抗和二抗，使用化學(xué)發(fā)光法顯影，分析蛋白表達(dá)量變化。通過以上多種研究方法的綜合運(yùn)用，全面深入地研究miR-136和miR-23b對(duì)靜脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的作用與機(jī)制。二、miR-136與miR-23b及靜脈平滑肌細(xì)胞相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1microRNA概述MicroRNA（miRNA）是一類由內(nèi)源性基因組編碼產(chǎn)生的非編碼小分子RNA，其長(zhǎng)度通常僅約22個(gè)核苷酸。20世紀(jì)90年代初，VictorAmbros和GaryRuvkun在研究線蟲時(shí)發(fā)現(xiàn)了首個(gè)miRNA——lin-4，它能夠?qū)α硪粋€(gè)基因lin-14進(jìn)行調(diào)控，自此開啟了miRNA研究的新紀(jì)元。2024年，VictorAmbros和GaryRuvkun因揭示miRNA在基因調(diào)控中的關(guān)鍵作用獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，這也彰顯了miRNA研究對(duì)生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重大貢獻(xiàn)。miRNA具有諸多獨(dú)特的特點(diǎn)。它是DNA轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，首先在細(xì)胞核中被轉(zhuǎn)錄成一種長(zhǎng)鏈的初級(jí)形態(tài)（pri-miRNA），初級(jí)形態(tài)的miRNA具有復(fù)雜的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。隨后，在核酸酶Drosha等的作用下，pri-miRNA被加工成具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、長(zhǎng)度約為70-100個(gè)核苷酸的前體miRNA（pre-miRNA）。前體miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核，在細(xì)胞質(zhì)中，由核酸酶Dicer進(jìn)一步切割，最終形成成熟的、長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的miRNA。miRNA不直接參與蛋白質(zhì)的合成，卻在基因表達(dá)調(diào)控中扮演著舉足輕重的角色，這一非編碼特性使其區(qū)別于其他參與蛋白質(zhì)合成的RNA，是生物體內(nèi)一種重要的調(diào)控分子。而且，miRNA在不同物種間具有高度的保守性，從線蟲、果蠅等低等生物到人類等高等生物，許多miRNA的序列和功能都相對(duì)穩(wěn)定。如let-7miRNA在動(dòng)物界廣泛存在，且其序列和功能在進(jìn)化過程中高度保守，它參與了細(xì)胞分化、發(fā)育時(shí)序調(diào)控等多種生物學(xué)過程。這種保守性暗示了miRNA在生物進(jìn)化過程中的重要性，是維持生物基本生命活動(dòng)和遺傳穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素之一。此外，一個(gè)miRNA可以通過與多個(gè)mRNA的3'-UTR區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)靶基因的調(diào)控，反之，多個(gè)miRNA也可以共同作用于同一個(gè)mRNA，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。例如，miR-133在心肌細(xì)胞中，既可以通過抑制SRF、MEF2等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，調(diào)控心肌細(xì)胞的增殖和分化，又能通過靶向調(diào)節(jié)其他與心肌收縮功能相關(guān)的基因，影響心肌的生理功能。這種“一對(duì)多”或“多對(duì)多”的調(diào)控模式，使得miRNA能夠精細(xì)地調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的各種生物學(xué)過程，確保細(xì)胞功能的穩(wěn)定和平衡。miRNA主要通過兩種作用機(jī)制在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。一種是當(dāng)miRNA與靶mRNA的3'-UTR區(qū)域完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，miRNA會(huì)介導(dǎo)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）識(shí)別并切割靶mRNA，導(dǎo)致靶mRNA降解，從而直接阻斷基因的表達(dá)。以植物中的miR-171為例，它與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)程度高，能夠精確地指導(dǎo)RISC對(duì)靶mRNA進(jìn)行切割，有效抑制靶基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程。另一種機(jī)制是當(dāng)miRNA與靶mRNA的3'-UTR區(qū)域不完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，miRNA-RISC復(fù)合物會(huì)結(jié)合到靶mRNA上，阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，干擾蛋白質(zhì)翻譯的起始過程，或者在翻譯延伸階段阻礙肽鏈的延伸，最終抑制蛋白質(zhì)的合成，但并不影響mRNA的穩(wěn)定性。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，大多數(shù)miRNA與靶mRNA是不完全互補(bǔ)配對(duì)的，通過這種翻譯抑制機(jī)制來調(diào)控基因表達(dá)。例如，在腫瘤細(xì)胞中，miR-21可以通過與靶mRNA的不完全互補(bǔ)配對(duì)，抑制多個(gè)與腫瘤抑制相關(guān)基因的翻譯過程，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。miRNA在細(xì)胞的各種生理病理過程中發(fā)揮著廣泛的調(diào)節(jié)作用。在胚胎發(fā)育過程中，miRNA參與了細(xì)胞的分化和組織器官的形成。如miR-1、miR-133等在心臟發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用，它們通過調(diào)控心臟相關(guān)基因的表達(dá)，確保心肌細(xì)胞的正常分化和心臟的正常發(fā)育。在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中，miRNA也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。miR-21通過抑制凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖；而miR-34家族則通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡，抑制細(xì)胞的增殖。在免疫調(diào)節(jié)方面，miRNA參與了免疫細(xì)胞的分化、活化和免疫應(yīng)答的調(diào)控。miR-155在T細(xì)胞和B細(xì)胞的分化和活化過程中發(fā)揮重要作用，它可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，影響機(jī)體的免疫應(yīng)答。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，miRNA既可以作為抑癌基因，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，也可以作為癌基因，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。miR-34a可以通過靶向多個(gè)癌基因，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和存活；而miR-106b等則可以通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制凋亡，發(fā)揮癌基因的作用。在心血管疾病中，miRNA參與了動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、心律失常等疾病的發(fā)生發(fā)展過程。miR-126通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生；而miR-208則與心肌梗死和心律失常的發(fā)生密切相關(guān)。這些研究表明，miRNA在細(xì)胞的生理病理過程中具有不可或缺的作用，深入研究miRNA的功能和機(jī)制，對(duì)于理解生命過程和疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。2.2miR-136和miR-23b簡(jiǎn)介miR-136是一種在多種組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)的miRNA，其成熟序列長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸。從結(jié)構(gòu)上看，它由特定的核苷酸序列構(gòu)成，這些序列在不同物種間具有一定的保守性。在人類、小鼠等哺乳動(dòng)物中，miR-136的核心序列高度相似，這暗示了其在進(jìn)化過程中具有重要且保守的生物學(xué)功能。在組織分布方面，miR-136在心臟、肝臟、腎臟、肌肉等多種組織中均有表達(dá)。在心臟組織中，miR-136參與了心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和功能調(diào)節(jié)過程。研究表明，在心肌肥厚模型中，miR-136的表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，它可以通過靶向調(diào)控相關(guān)基因，抑制心肌細(xì)胞的肥大和增殖，維持心臟的正常結(jié)構(gòu)和功能。在肝臟組織中，miR-136也發(fā)揮著重要作用，它參與了肝臟細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)和應(yīng)激反應(yīng)過程。當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，miR-136的表達(dá)會(huì)發(fā)生改變，進(jìn)而影響肝臟細(xì)胞的修復(fù)和再生能力。在已報(bào)道的其他細(xì)胞或生理過程中，miR-136展現(xiàn)出多樣的功能。在腫瘤細(xì)胞中，miR-136通常發(fā)揮抑癌作用。在乳腺癌細(xì)胞中，miR-136的表達(dá)水平明顯低于正常乳腺組織，過表達(dá)miR-136可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。通過生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-136可以靶向多個(gè)與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因，如MMP9、VEGF等，通過抑制這些基因的表達(dá)，阻斷腫瘤細(xì)胞的遷移和血管生成信號(hào)通路，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在神經(jīng)細(xì)胞中，miR-136參與了神經(jīng)細(xì)胞的分化和神經(jīng)突觸的形成過程。在神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的過程中，miR-136的表達(dá)逐漸升高，它可以通過調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化，增加神經(jīng)元的數(shù)量和功能。在炎癥反應(yīng)過程中，miR-136也具有重要的調(diào)節(jié)作用。在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥模型中，miR-136的表達(dá)受到抑制，而過表達(dá)miR-136可以抑制炎癥因子如TNF-α、IL-6等的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。這表明miR-136在維持機(jī)體免疫平衡和炎癥調(diào)節(jié)方面具有關(guān)鍵作用。miR-23b同樣是一種重要的miRNA，其成熟體也是約22個(gè)核苷酸的短鏈RNA。從結(jié)構(gòu)特點(diǎn)上，它擁有獨(dú)特的核苷酸排列順序，這種序列特征決定了其與靶mRNA的特異性結(jié)合能力。在組織分布上，miR-23b在人體的各個(gè)組織中廣泛存在，包括但不限于肺、胃、腸、生殖系統(tǒng)等組織。在肺組織中，miR-23b參與了肺部的發(fā)育和免疫調(diào)節(jié)過程。在肺部發(fā)育過程中，miR-23b的表達(dá)水平動(dòng)態(tài)變化，它通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響肺泡上皮細(xì)胞的分化和增殖，對(duì)肺部的正常結(jié)構(gòu)和功能的形成至關(guān)重要。在胃和腸組織中，miR-23b參與了胃腸道黏膜的修復(fù)和炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)。當(dāng)胃腸道黏膜受到損傷時(shí)，miR-23b的表達(dá)會(huì)發(fā)生改變，它可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)胃腸道黏膜細(xì)胞的增殖和修復(fù)，同時(shí)抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)胃腸道黏膜的完整性。在生殖系統(tǒng)中，miR-23b在卵巢、睪丸等組織中均有表達(dá)，參與了生殖細(xì)胞的發(fā)育和生殖激素的調(diào)節(jié)過程。在卵巢中，miR-23b可以影響卵泡的發(fā)育和排卵過程，通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，維持卵巢的正常生殖功能。在其他細(xì)胞或生理過程中，miR-23b的功能也十分廣泛。在腫瘤領(lǐng)域，如前文所述，在前列腺癌組織中，miR-23b的表達(dá)顯著降低，且與患者的不良病理變化和預(yù)后相關(guān)，提示其可能對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲具有抑制作用。在心血管系統(tǒng)中，除了對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移有影響外，在心肌細(xì)胞中，miR-23b也參與了心肌肥厚和心肌纖維化的過程。在心肌肥厚模型中，miR-23b的表達(dá)上調(diào)，它可以通過靶向調(diào)控相關(guān)基因，促進(jìn)心肌細(xì)胞的肥大和纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而參與心肌肥厚和心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。在神經(jīng)系統(tǒng)中，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院范玉華團(tuán)隊(duì)和中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院何志義團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體中的miR-23b可通過靶向抑制PTEN而發(fā)揮抗氧化作用，并緩解NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，從而促進(jìn)腦出血大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)。這表明miR-23b在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程中具有重要作用，可能成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在靶點(diǎn)。在免疫細(xì)胞中，miR-23b參與了T細(xì)胞和B細(xì)胞的分化和活化過程。它可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，影響免疫細(xì)胞的功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答。2.3靜脈平滑肌細(xì)胞的生理功能與病理變化靜脈平滑肌細(xì)胞作為靜脈血管壁的重要組成部分，在維持血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著不可或缺的正常生理功能。在正常生理狀態(tài)下，靜脈平滑肌細(xì)胞呈現(xiàn)收縮型表型，細(xì)胞形態(tài)細(xì)長(zhǎng)，富含肌絲和致密體，具有較強(qiáng)的收縮能力。其收縮和舒張功能對(duì)于調(diào)節(jié)靜脈血管的管徑和血流阻力起著關(guān)鍵作用。當(dāng)機(jī)體需要調(diào)節(jié)靜脈回心血量時(shí)，靜脈平滑肌細(xì)胞可通過收縮或舒張來改變靜脈血管的管徑，從而調(diào)節(jié)靜脈血流速度和回心血量。在運(yùn)動(dòng)時(shí)，交感神經(jīng)興奮，釋放去甲腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)，作用于靜脈平滑肌細(xì)胞上的腎上腺素能受體，使靜脈平滑肌細(xì)胞收縮，靜脈血管管徑減小，促進(jìn)靜脈血液回流，以滿足機(jī)體對(duì)氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的需求。靜脈平滑肌細(xì)胞還參與維持血管壁的結(jié)構(gòu)完整性。它們合成和分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、彈性蛋白和纖連蛋白等。這些細(xì)胞外基質(zhì)成分相互交織，形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，為血管壁提供機(jī)械支撐，增強(qiáng)血管壁的強(qiáng)度和彈性。膠原蛋白賦予血管壁一定的韌性，使其能夠承受一定的壓力和張力；彈性蛋白則賦予血管壁彈性，使其在受到壓力時(shí)能夠擴(kuò)張，壓力解除后又能恢復(fù)原狀。靜脈平滑肌細(xì)胞還通過細(xì)胞間連接與相鄰細(xì)胞緊密相連，形成一個(gè)緊密的細(xì)胞層，防止血液中的有害物質(zhì)侵入血管壁，維持血管內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。在病理狀態(tài)下，靜脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖和遷移在血管疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。在冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)后，移植靜脈暴露于動(dòng)脈血流環(huán)境中，受到血流動(dòng)力學(xué)因素的改變以及炎癥因子等的刺激，靜脈平滑肌細(xì)胞會(huì)發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，從收縮型表型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚捅硇?。合成型靜脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移能力增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)肌絲和致密體減少，而合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力增強(qiáng)。這些細(xì)胞會(huì)大量增殖并遷移到血管內(nèi)膜下，導(dǎo)致內(nèi)膜增生，血管管腔狹窄，最終引起移植靜脈再狹窄。研究表明，在冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)后1年，約有20%-30%的患者會(huì)出現(xiàn)移植靜脈再狹窄，嚴(yán)重影響手術(shù)效果和患者的預(yù)后。在下肢靜脈曲張中，靜脈平滑肌細(xì)胞的功能失調(diào)也起到了關(guān)鍵作用。長(zhǎng)期的靜脈高壓、靜脈瓣膜功能不全等因素會(huì)導(dǎo)致靜脈平滑肌細(xì)胞受到損傷，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路異常激活。這些異常激活的信號(hào)通路會(huì)促進(jìn)靜脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，同時(shí)抑制其收縮功能。靜脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移導(dǎo)致靜脈壁增厚、擴(kuò)張，而收縮功能的抑制則使得靜脈血管失去正常的彈性和收縮能力，無法有效促進(jìn)血液回流。隨著病情的進(jìn)展，靜脈血管逐漸迂曲、擴(kuò)張，形成靜脈曲張。下肢靜脈曲張不僅會(huì)影響患者的美觀，還會(huì)導(dǎo)致下肢疼痛、腫脹、皮膚潰瘍等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。在深靜脈血栓形成后綜合征中，靜脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖和遷移參與了血栓的機(jī)化和再通等病理過程。深靜脈血栓形成后，血栓部位會(huì)釋放多種生長(zhǎng)因子和炎癥介質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)刺激靜脈平滑肌細(xì)胞發(fā)生增殖和遷移。靜脈平滑肌細(xì)胞遷移到血栓部位，參與血栓的機(jī)化過程，將血栓逐漸轉(zhuǎn)化為纖維組織。在血栓機(jī)化過程中，如果靜脈平滑肌細(xì)胞過度增殖和遷移，會(huì)導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)破壞，靜脈瓣膜功能受損，影響靜脈血液的正?；亓?。靜脈血液回流障礙又會(huì)進(jìn)一步加重靜脈高壓，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致深靜脈血栓形成后綜合征的發(fā)生。深靜脈血栓形成后綜合征患者常出現(xiàn)下肢腫脹、疼痛、皮膚色素沉著、潰瘍等癥狀，病程遷延不愈，給患者帶來極大的痛苦。綜上所述，靜脈平滑肌細(xì)胞的正常生理功能對(duì)于維持血管穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，而其在病理狀態(tài)下的異常增殖和遷移則是多種血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)。深入研究靜脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于揭示血管疾病的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn)具有重要意義。三、miR-136對(duì)靜脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的作用研究3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理本研究選用人臍靜脈平滑肌細(xì)胞（HUVSMCs）作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，其來源為健康產(chǎn)婦分娩后的臍帶。在獲取臍帶后，迅速將其置于含雙抗（青霉素100U/mL和鏈霉素100μg/mL）的PBS緩沖液中，于4℃條件下保存并盡快送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。在超凈工作臺(tái)中，用含雙抗的PBS反復(fù)沖洗臍帶3-5次，以去除表面的血跡和雜質(zhì)。隨后，采用改良的組織塊貼壁法進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)。將臍帶剪切成約1mm3大小的組織塊，均勻地鋪在T25培養(yǎng)瓶底部，加入適量含20%胎牛血清（FBS）、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使組織塊均勻分布。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)2-3天，期間避免晃動(dòng)培養(yǎng)瓶。待組織塊周圍有細(xì)胞爬出后，每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，去除未貼壁的組織塊和雜質(zhì)，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用不含鈣、鎂離子的PBS沖洗細(xì)胞1-2次，然后加入適量0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并開始脫落時(shí)，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液，然后按照1:2-1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。為研究miR-136對(duì)靜脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的影響，需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、miR-136模擬物組、miR-136抑制劑組。miR-136模擬物是人工合成的雙鏈RNA，其序列與內(nèi)源性miR-136成熟體序列相同，能夠模擬miR-136的功能，促進(jìn)其表達(dá)；miR-136抑制劑是經(jīng)過化學(xué)修飾的單鏈RNA，能夠特異性地與miR-136結(jié)合，抑制其功能。轉(zhuǎn)染前一天，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVSMCs以合適的密度接種到6孔板中，每孔加入2mL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到50%-70%的融合度。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。分別取適量的miR-136模擬物、miR-136抑制劑和陰性對(duì)照（NC），用無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋至終濃度為50nmol/L，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘。同時(shí)，取適量的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，也用無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，室溫孵育5分鐘。然后將稀釋后的miR-136模擬物、miR-136抑制劑和NC分別與稀釋后的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑混合，輕輕吹打均勻，室溫孵育20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用無血清的DMEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞2次，然后每孔加入1.5mL無血清的DMEM培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到6孔板中，輕輕搖晃孔板，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻分布。將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育4-6小時(shí)后，吸出含轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，每孔加入2mL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。3.1.2細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)CCK-8實(shí)驗(yàn)是一種基于WST-8的細(xì)胞增殖檢測(cè)方法，其原理是WST-8在電子耦合試劑1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓（1-MethoxyPMS）的作用下，能夠被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物?；罴?xì)胞數(shù)量越多，線粒體中的脫氫酶活性越高，還原產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物就越多，在450nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD值）也就越高，因此可以通過檢測(cè)OD值來間接反映細(xì)胞的增殖情況。在進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)時(shí)，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞按照每孔5000-10000個(gè)的密度接種到96孔板中，每孔加入100μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，即只加入100μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，不含細(xì)胞。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0h、24h、48h、72h后進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，從培養(yǎng)箱中取出96孔板，每孔加入10μLCCK-8試劑，輕輕搖晃孔板，使試劑與培養(yǎng)基充分混勻。將96孔板放回培養(yǎng)箱中，繼續(xù)孵育1-4小時(shí)。孵育結(jié)束后，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)各孔的OD值，繪制細(xì)胞增殖曲線，比較對(duì)照組、miR-136模擬物組和miR-136抑制劑組細(xì)胞的增殖情況。EdU實(shí)驗(yàn)是一種新型的細(xì)胞增殖檢測(cè)方法，其原理是EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖過程中代替胸腺嘧啶（T）摻入到新合成的DNA中。EdU可以與熒光染料疊氮化物通過Click化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行特異性結(jié)合，從而可以在熒光顯微鏡下直接觀察到增殖細(xì)胞。與傳統(tǒng)的BrdU檢測(cè)方法相比，EdU檢測(cè)不需要進(jìn)行DNA變性處理，操作更加簡(jiǎn)便，且對(duì)細(xì)胞的損傷較小。在進(jìn)行EdU實(shí)驗(yàn)時(shí)，按照EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒的說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以每孔5×10?個(gè)的密度接種到24孔板中，每孔加入500μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將24孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，進(jìn)行EdU標(biāo)記。取出24孔板，吸去培養(yǎng)基，每孔加入500μL含50μMEdU的培養(yǎng)基，輕輕搖晃孔板，使EdU均勻分布。將24孔板放回培養(yǎng)箱中，繼續(xù)孵育2小時(shí)。孵育結(jié)束后，吸去含EdU的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞3次，每次5分鐘，以去除未摻入的EdU。每孔加入500μL4%多聚甲醛固定液，室溫固定細(xì)胞30分鐘。固定結(jié)束后，吸去固定液，用PBS清洗細(xì)胞3次，每次5分鐘。每孔加入500μL0.5%TritonX-100通透液，室溫通透細(xì)胞10分鐘。通透結(jié)束后，吸去通透液，用PBS清洗細(xì)胞3次，每次5分鐘。每孔加入100μLClick反應(yīng)混合液，室溫避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，吸去Click反應(yīng)混合液，用PBS清洗細(xì)胞3次，每次5分鐘。每孔加入100μLHoechst33342染色液，室溫避光染色10分鐘。染色結(jié)束后，吸去染色液，用PBS清洗細(xì)胞3次，每次5分鐘。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)EdU陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU陽性細(xì)胞百分比，比較對(duì)照組、miR-136模擬物組和miR-136抑制劑組細(xì)胞的增殖情況。3.1.3細(xì)胞遷移檢測(cè)實(shí)驗(yàn)Transwell實(shí)驗(yàn)是一種常用的細(xì)胞遷移檢測(cè)方法，其原理是利用Transwell小室（一種帶有微孔膜的小室），將細(xì)胞接種在上室，下室加入含有趨化因子（如胎牛血清）的培養(yǎng)基。由于膜具有通透性，下室中的趨化因子可以吸引細(xì)胞遷移，細(xì)胞會(huì)通過膜上的微孔從上層培養(yǎng)液遷移到下層培養(yǎng)液中。通過計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量，可以評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。在進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)時(shí)，選用8μm孔徑的Transwell小室，將其置于24孔板中。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL。在上室中加入200μL細(xì)胞懸液，下室中加入500μL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基作為趨化因子。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將24孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)，具體時(shí)間根據(jù)細(xì)胞遷移速度而定。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞。將Transwell小室放入4%多聚甲醛固定液中，室溫固定20分鐘。固定結(jié)束后，取出Transwell小室，用PBS清洗3次，每次5分鐘。將Transwell小室放入0.1%結(jié)晶紫染液中，室溫染色15分鐘。染色結(jié)束后，取出Transwell小室，用PBS清洗3次，每次5分鐘，以去除多余的染液。將Transwell小室置于倒置顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量，比較對(duì)照組、miR-136模擬物組和miR-136抑制劑組細(xì)胞的遷移能力。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是一種簡(jiǎn)單直觀的細(xì)胞遷移檢測(cè)方法，其原理是在體外培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上，用槍頭或其他硬物在細(xì)胞生長(zhǎng)的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細(xì)胞，形成一個(gè)“劃痕”。然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，隨著時(shí)間的推移，劃痕邊緣的細(xì)胞會(huì)逐漸遷移進(jìn)入空白區(qū)域，使劃痕愈合。通過觀察劃痕愈合的情況，可以評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。在進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)時(shí)，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以每孔1×10?個(gè)的密度接種到6孔板中，每孔加入2mL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%-100%時(shí)，進(jìn)行劃痕處理。用200μL無菌槍頭垂直于6孔板底部，在細(xì)胞單層上均勻地劃出3-5條直線劃痕。劃痕時(shí)盡量保持力度一致，劃痕寬度均勻。劃痕完成后，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，以去除劃下的細(xì)胞碎片。每孔加入2mL含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)0h、12h、24h、48h后，在倒置顯微鏡下對(duì)劃痕區(qū)域進(jìn)行拍照，拍照時(shí)盡量保持拍照位置和角度一致。使用圖像分析軟件（如ImageJ）測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=（0h劃痕寬度-th劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%，其中t為培養(yǎng)時(shí)間。通過比較對(duì)照組、miR-136模擬物組和miR-136抑制劑組細(xì)胞的遷移率，評(píng)估m(xù)iR-136對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1miR-136對(duì)細(xì)胞增殖的影響數(shù)據(jù)展示在CCK-8實(shí)驗(yàn)中，對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組、miR-136模擬物組和miR-136抑制劑組細(xì)胞的吸光度（OD值）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果呈現(xiàn)出明顯的差異。在培養(yǎng)0h時(shí)，三組細(xì)胞的OD值無顯著差異，表明初始細(xì)胞數(shù)量和活性基本一致。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組細(xì)胞的OD值逐漸升高，在72h時(shí)達(dá)到0.96±0.03，顯示出正常的細(xì)胞增殖趨勢(shì)。而miR-136模擬物組細(xì)胞的OD值增長(zhǎng)較為緩慢，在72h時(shí)為0.76±0.08，顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），這表明過表達(dá)miR-136能夠抑制靜脈平滑肌細(xì)胞的增殖能力。相反，miR-136抑制劑組細(xì)胞的OD值增長(zhǎng)速度明顯加快，在72h時(shí)達(dá)到1.12±0.05，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），說明抑制miR-136的表達(dá)可促進(jìn)靜脈平滑肌細(xì)胞的增殖。根據(jù)這些OD值繪制的細(xì)胞增殖曲線清晰地展示了三組細(xì)胞增殖能力的差異，進(jìn)一步直觀地表明miR-136對(duì)靜脈平滑肌細(xì)胞增殖具有抑制作用。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣驗(yàn)證了miR-136對(duì)細(xì)胞增殖的影響。在熒光顯微鏡下觀察，對(duì)照組細(xì)胞中EdU陽性細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞核呈現(xiàn)出紅色熒光（EdU標(biāo)記）和藍(lán)色熒光（Hoechst33342標(biāo)記）共染的現(xiàn)象。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，對(duì)照組EdU陽性細(xì)胞百分比為（52.71±2.57）%。而miR-136模擬物組中，EdU陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，EdU陽性細(xì)胞百分比為（32.56±3.26）%，顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），這表明過表達(dá)miR-136后，進(jìn)入DNA合成期（S期）的細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞增殖受到抑制。在miR-136抑制劑組中，EdU陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多，EdU陽性細(xì)胞百分比高達(dá)（70.12±4.15）%，顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），說明抑制miR-136的表達(dá)能夠促進(jìn)更多細(xì)胞進(jìn)入S期，從而增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力。通過對(duì)不同組EdU陽性細(xì)胞百分比的比較，從直觀的細(xì)胞層面進(jìn)一步證實(shí)了miR-136對(duì)靜脈平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用。3.2.2miR-136對(duì)細(xì)胞遷移的影響數(shù)據(jù)展示Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組下室遷移的細(xì)胞數(shù)量較多，經(jīng)計(jì)數(shù)，對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)為（53.13±16.36）個(gè)/視野。而miR-136模擬物組下室遷移的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，僅為（8.08±0.85）個(gè)/視野，顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），這表明過表達(dá)miR-136能夠有效抑制靜脈平滑肌細(xì)胞的遷移能力。相反，miR-136抑制劑組下室遷移的細(xì)胞數(shù)量顯著增加，達(dá)到（85.25±18.76）個(gè)/視野，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），說明抑制miR-136的表達(dá)可促進(jìn)靜脈平滑肌細(xì)胞的遷移。在顯微鏡下觀察染色后的Transwell小室，對(duì)照組下室的細(xì)胞呈現(xiàn)出密集的分布，而miR-136模擬物組下室的細(xì)胞則較為稀疏，miR-136抑制劑組下室的細(xì)胞分布更為密集，這些直觀的現(xiàn)象進(jìn)一步支持了細(xì)胞遷移數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明了miR-136對(duì)細(xì)胞遷移的調(diào)控作用。在劃痕后0h，三組細(xì)胞的劃痕寬度基本一致。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組細(xì)胞逐漸遷移進(jìn)入劃痕區(qū)域，在24h時(shí)劃痕寬度明顯減小，細(xì)胞遷移率為（45.40±1.17）%。miR-136模擬物組細(xì)胞的遷移速度較慢，24h時(shí)劃痕寬度減小不明顯，細(xì)胞遷移率僅為（22.36±5.55）%，顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），表明過表達(dá)miR-136抑制了細(xì)胞的遷移能力。miR-136抑制劑組細(xì)胞的遷移速度明顯加快，24h時(shí)劃痕寬度顯著減小，細(xì)胞遷移率高達(dá)（68.32±3.45）%，顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），說明抑制miR-136的表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞的遷移。通過對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度的測(cè)量和細(xì)胞遷移率的計(jì)算，以及對(duì)劃痕愈合過程的直觀觀察，充分證明了miR-136對(duì)靜脈平滑肌細(xì)胞遷移具有抑制作用。3.2.3結(jié)果總結(jié)與初步討論綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，miR-136對(duì)靜脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移均具有顯著的抑制作用。過表達(dá)miR-136可使細(xì)胞增殖能力明顯減弱，表現(xiàn)為CCK-8實(shí)驗(yàn)中OD值增長(zhǎng)緩慢，EdU陽性細(xì)胞百分比降低；同時(shí)，細(xì)胞遷移能力也顯著下降，Transwell實(shí)驗(yàn)中遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞遷移率降低。相反，抑制miR-136的表達(dá)則能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移，使CCK-8實(shí)驗(yàn)中OD值升高，EdU陽性細(xì)胞百分比增加，Transwell實(shí)驗(yàn)中遷移細(xì)胞數(shù)增多，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞遷移率提高。從這些結(jié)果可以初步推測(cè)，miR-136可能作為一種負(fù)調(diào)控因子，參與了靜脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的生理病理過程。在正常生理狀態(tài)下，靜脈平滑肌細(xì)胞保持相對(duì)穩(wěn)定的表型和功能，miR-136可能維持在一定的表達(dá)水平，抑制細(xì)胞的過度增殖和遷移，從而維持血管壁的正常結(jié)構(gòu)和功能。當(dāng)機(jī)體受到病理因素刺激時(shí)，如在冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)后、下肢靜脈曲張、深靜脈血栓形成后綜合征等疾病中，miR-136的表達(dá)可能發(fā)生異常變化，導(dǎo)致其對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用減弱或喪失，進(jìn)而引發(fā)靜脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖和遷移，促進(jìn)血管疾病的發(fā)生發(fā)展。然而，目前的研究結(jié)果僅揭示了miR-136對(duì)靜脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響，其具體的作用機(jī)制尚不完全明確。miR-136可能通過靶向作用于某些關(guān)鍵基因，調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，從而影響細(xì)胞的增殖和遷移。已有研究表明，Steap3是miR-136的靶基因之一，miR-136可能通過抑制Steap3的表達(dá)來調(diào)控靜脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。但miR-136是否還存在其他靶基因，以及這些靶基因如何相互作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為，仍有待進(jìn)一步深入研究。后續(xù)研究將通過生物信息學(xué)分析、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、免疫印跡法等技術(shù)手段，深入探究miR-136的靶基因及相關(guān)信號(hào)通路，以全面揭示miR-136對(duì)靜脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的作用機(jī)制。四、miR-136調(diào)控靜脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的機(jī)制探究4.1靶基因預(yù)測(cè)與驗(yàn)證4.1.1利用生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)靶基因?yàn)樯钊胩骄縨iR-136調(diào)控靜脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的分子機(jī)制，本研究借助生物信息學(xué)工具對(duì)其潛在靶基因展開預(yù)測(cè)。選用目前應(yīng)用廣泛且準(zhǔn)確性較高的生物信息學(xué)分析軟件，如TargetScan、miRanda和PicTar。這些軟件基于miRNA與mRNA3'-UTR區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)的原理，通過對(duì)大量已知miRNA-mRNA相互作用數(shù)據(jù)的學(xué)習(xí)和分析，構(gòu)建出相應(yīng)的預(yù)測(cè)模型。在預(yù)測(cè)過程中，首先將miR-136的成熟序列輸入到各個(gè)軟件中，軟件會(huì)在人類基因組數(shù)據(jù)庫中搜索與miR-136種子序列（通常指miR-1365'端第2-8個(gè)核苷酸）互補(bǔ)配對(duì)的mRNA3'-UTR區(qū)域。同時(shí)，各軟件還會(huì)綜合考慮多種因素來評(píng)估預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，如miRNA與mRNA結(jié)合位點(diǎn)的保守性、結(jié)合自由能等。在結(jié)合位點(diǎn)保守性方面，TargetScan會(huì)分析不同物種間mRNA3'-UTR區(qū)域中與miR-136結(jié)合位點(diǎn)的保守程度，若該位點(diǎn)在多個(gè)物種中都高度保守，那么預(yù)測(cè)其為靶基因的可信度就更高；結(jié)合自由能則反映了miRNA與mRNA結(jié)合的穩(wěn)定性，結(jié)合自由能越低，表明二者結(jié)合越穩(wěn)定，該mRNA作為靶基因的可能性也就越大。經(jīng)過各軟件的預(yù)測(cè)分析，綜合篩選出多個(gè)miR-136可能的靶基因。其中，Steap3基因在多個(gè)軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果中均被高度提示為miR-136的潛在靶基因。Steap3（Six-transmembraneepithelialantigenoftheprostate3）是一種跨膜蛋白，在細(xì)胞的鐵代謝、增殖和分化等過程中發(fā)揮重要作用。已有研究表明，Steap3參與了腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移過程，在多種腫瘤組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度相關(guān)。考慮到靜脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移與腫瘤細(xì)胞在某些生物學(xué)行為上存在相似性，以及Steap3在細(xì)胞生理病理過程中的重要作用，推測(cè)Steap3可能是miR-136調(diào)控靜脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的關(guān)鍵靶基因。此外，還篩選出其他一些潛在靶基因，如MAP3K1（Mitogen-activatedproteinkinasekinasekinase1）、VEGF（Vascularendothelialgrowthfactor）等。MAP3K1是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路中的關(guān)鍵激酶，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程的信號(hào)傳導(dǎo)；VEGF是一種重要的血管生成因子，不僅在血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管新生中起關(guān)鍵作用，也被發(fā)現(xiàn)與靜脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移密切相關(guān)。這些潛在靶基因的篩選為后續(xù)深入研究miR-136的作用機(jī)制提供了重要線索。4.1.2雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證為了驗(yàn)證miR-136與預(yù)測(cè)靶基因之間的靶向關(guān)系，本研究設(shè)計(jì)并實(shí)施了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。該實(shí)驗(yàn)以螢火蟲熒光素酶（Fireflyluciferase）作為報(bào)告基因，海腎熒光素酶（Renillaluciferase）作為內(nèi)參基因。實(shí)驗(yàn)的核心原理在于，若miR-136能夠與靶基因的3'-UTR區(qū)域特異性結(jié)合，就會(huì)抑制熒光素酶的翻譯過程，導(dǎo)致熒光素酶活性降低。在實(shí)驗(yàn)操作過程中，首先進(jìn)行靶基因3'-UTR區(qū)域的克隆。以Steap3基因?yàn)槔?，從人基因組DNA中擴(kuò)增出包含Steap3基因3'-UTR完整序列的片段，引物設(shè)計(jì)時(shí)在片段兩端引入合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增采用高保真PCR技術(shù)，以確保擴(kuò)增序列的準(zhǔn)確性。PCR反應(yīng)體系包括模板DNA、上下游引物、dNTPs、高保真DNA聚合酶和緩沖液等。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收目的片段。將回收的Steap3基因3'-UTR片段與經(jīng)過相同限制性內(nèi)切酶酶切處理的熒光素酶報(bào)告載體（如pGL3-Basic載體）進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系包括目的片段、載體、T4DNA連接酶和連接緩沖液等，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序分析，篩選出含有正確插入片段的重組質(zhì)粒，命名為pGL3-Steap3-3'UTR。同時(shí)，為了驗(yàn)證結(jié)合位點(diǎn)的特異性，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)Steap3基因3'-UTR中miR-136結(jié)合位點(diǎn)的突變引物，通過定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建突變型重組質(zhì)粒pGL3-Steap3-mut-3'UTR，突變后的結(jié)合位點(diǎn)不能與miR-136互補(bǔ)配對(duì)。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒（如pRL-TK質(zhì)粒，表達(dá)海腎熒光素酶）共轉(zhuǎn)染至人臍靜脈平滑肌細(xì)胞（HUVSMCs）中。轉(zhuǎn)染前一天，將HUVSMCs以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種到24孔板中，每孔加入500μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到70%-80%的融合度。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。分別取適量的pGL3-Steap3-3'UTR、pGL3-Steap3-mut-3'UTR和pRL-TK質(zhì)粒，用無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋至終濃度分別為100ng/μL、100ng/μL和50ng/μL，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘。同時(shí)，取適量的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，也用無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，室溫孵育5分鐘。然后將稀釋后的質(zhì)粒分別與稀釋后的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑混合，輕輕吹打均勻，室溫孵育20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將24孔板中的培養(yǎng)基吸出，用無血清的DMEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞2次，然后每孔加入400μL無血清的DMEM培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到24孔板中，輕輕搖晃孔板，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻分布。將24孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育4-6小時(shí)后，吸出含轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，每孔加入500μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)。雙熒光素酶活性檢測(cè)采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。從培養(yǎng)箱中取出24孔板，吸去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2次。每孔加入100μL的1×PLB（PassiveLysisBuffer），室溫孵育15分鐘，期間輕輕搖晃孔板，使細(xì)胞充分裂解。將裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至EP管中，12000rpm離心5分鐘，取上清液用于檢測(cè)。按照試劑盒說明書，先將螢火蟲熒光素酶檢測(cè)試劑（FireflyLuciferaseAssayReagent）加入到酶標(biāo)板的檢測(cè)孔中，每孔20μL，然后加入20μL細(xì)胞裂解上清液，立即用酶標(biāo)儀檢測(cè)螢火蟲熒光素酶的活性，記錄熒光值（RLU?）。接著，向同一檢測(cè)孔中加入20μL海腎熒光素酶檢測(cè)試劑（RenillaLuciferaseAssayReagent），再次用酶標(biāo)儀檢測(cè)海腎熒光素酶的活性，記錄熒光值（RLU?）。計(jì)算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值（RLU?/RLU?），以消除細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞裂解程度等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了多個(gè)對(duì)照組，包括轉(zhuǎn)染pGL3-Basic和pRL-TK質(zhì)粒的空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染pGL3-Steap3-3'UTR和pRL-TK質(zhì)粒但不轉(zhuǎn)染miR-136模擬物的陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染pGL3-Steap3-mut-3'UTR和pRL-TK質(zhì)粒以及miR-136模擬物的突變對(duì)照組。在空白對(duì)照組中，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值作為基礎(chǔ)值，用于后續(xù)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理。陰性對(duì)照組用于檢測(cè)重組質(zhì)粒本身對(duì)熒光素酶活性的影響。突變對(duì)照組中，由于Steap3基因3'-UTR中miR-136結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變，若miR-136與Steap3的靶向關(guān)系是特異性的，那么miR-136模擬物對(duì)該組的熒光素酶活性應(yīng)無明顯影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pGL3-Steap3-3'UTR和pRL-TK質(zhì)粒以及miR-136模擬物的實(shí)驗(yàn)組中，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值顯著降低（P＜0.05），表明miR-136能夠與Steap3基因的3'-UTR區(qū)域特異性結(jié)合，抑制熒光素酶的表達(dá)，從而驗(yàn)證了Steap3是miR-136的靶基因。而在突變對(duì)照組中，轉(zhuǎn)染pGL3-Steap3-mut-3'UTR和pRL-TK質(zhì)粒以及miR-136模擬物后，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值與陰性對(duì)照組相比無顯著差異（P＞0.05），進(jìn)一步證明了miR-136與Steap3基因3'-UTR結(jié)合的特異性，即只有野生型的結(jié)合位點(diǎn)才能與miR-136相互作用，突變后的結(jié)合位點(diǎn)則失去了這種能力。通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，明確了miR-136與Steap3之間的靶向關(guān)系，為后續(xù)深入研究miR-136通過Steap3調(diào)控靜脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的信號(hào)通路奠定了基礎(chǔ)。4.2相關(guān)信號(hào)通路研究4.2.1通路初步篩選與確定在明確Steap3為miR-136的靶基因后，為深入探究miR-136通過Steap3調(diào)控靜脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的具體機(jī)制，對(duì)相關(guān)信號(hào)通路展開了初步篩選與確定。通過廣泛的文獻(xiàn)調(diào)研，發(fā)現(xiàn)Steap3在細(xì)胞生理病理過程中與多條信號(hào)通路存在關(guān)聯(lián)。在腫瘤細(xì)胞中，Steap3參與了Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的調(diào)控，該通路在細(xì)胞增殖、分化、遷移和存活等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Ras蛋白被激活后，會(huì)依次激活Raf激酶、MEK激酶和ERK激酶，磷酸化的ERK進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移。考慮到靜脈平滑肌細(xì)胞在增殖和遷移行為上與腫瘤細(xì)胞有一定相似性，推測(cè)Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路可能參與了miR-136/Steap3對(duì)靜脈平滑肌細(xì)胞的調(diào)控過程。PI3K/Akt信號(hào)通路也引起了關(guān)注。該通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、存活和代謝等方面具有重要作用。在血管平滑肌細(xì)胞中，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子等刺激時(shí)，PI3K被激活，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3招募Akt到細(xì)胞膜上并使其磷酸化激活，激活的Akt通過磷酸化下游底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。由于Steap3與細(xì)胞的增殖和遷移密切相關(guān)，且PI3K/Akt信號(hào)通路在血管平滑肌細(xì)胞中具有重要功能，因此推測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路也可能參與其中。結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果中miR-136對(duì)靜脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的顯著抑制作用，以及對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)中各信號(hào)通路在細(xì)胞增殖和遷移調(diào)控中的作用分析，初步確定Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路和PI3K/Akt信號(hào)通路為重點(diǎn)研究對(duì)象，后續(xù)將通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證這兩條信號(hào)通路在miR-136調(diào)控靜脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移過程中的具體作用。4.2.2通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)檢測(cè)為了深入探究miR-136對(duì)初步篩選出的Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，采用Westernblot方法對(duì)這兩條信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。在實(shí)驗(yàn)過程中，將培養(yǎng)的人臍靜脈平滑肌細(xì)胞（HUVSMCs）分為對(duì)照組、miR-136模擬物組和miR-136抑制劑組。對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)，不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染處理；miR-136模擬物組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-136模擬物，以過表達(dá)miR-136；miR-136抑制劑組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-136抑制劑，抑制miR-136的表達(dá)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集各組細(xì)胞，提取總蛋白。在提取總蛋白時(shí)，首先將細(xì)胞用預(yù)冷的PBS沖洗2-3次，以去除培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后向細(xì)胞中加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上孵育30分鐘，期間輕輕搖晃培養(yǎng)板，使裂解液與細(xì)胞充分接觸。孵育結(jié)束后，將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清液即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)提取的總蛋白進(jìn)行定量，以確保各組蛋白上樣量一致。將定量后的蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘，使蛋白充分變性。進(jìn)行SDS電泳時(shí)，根據(jù)目的蛋白的分子量大小選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。將變性后的蛋白樣品加入到上樣孔中，同時(shí)加入蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品作為參照。電泳時(shí)，先在濃縮膠中以80V的電壓電泳30分鐘，使蛋白樣品在濃縮膠中濃縮成一條窄帶，然后在分離膠中以120V的電壓電泳1-2小時(shí)，使不同分子量的蛋白充分分離。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作。采用濕法轉(zhuǎn)膜的方法，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜時(shí)，按照“負(fù)極（黑色）-海綿墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿墊-正極（白色）”的順序依次放置，確保各層之間無氣泡。在冰浴條件下，以200mA的電流轉(zhuǎn)膜1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1-2小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入一抗稀釋液中，4℃孵育過夜。一抗分別為針對(duì)Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白R(shí)as、Raf、MEK、ERK以及磷酸化形式p-Ras、p-Raf、p-MEK、p-ERK的抗體，和針對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白PI3K、Akt以及磷酸化形式p-PI3K、p-Akt的抗體。這些抗體均經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，確保其特異性和靈敏度。次日，將PVDF膜從一抗稀釋液中取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜放入二抗稀釋液中，室溫孵育1-2小時(shí)。二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG抗體，與一抗特異性結(jié)合。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，采用化學(xué)發(fā)光法（ECL）進(jìn)行顯色。將PVDF膜放入ECL發(fā)光液中孵育1-2分鐘，然后放入化學(xué)發(fā)光成像儀中曝光，獲取蛋白條帶圖像。通過ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算各信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-136模擬物組中Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白p-Ras、p-Raf、p-MEK、p-ERK的相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），表明過表達(dá)miR-136抑制了該信號(hào)通路的激活。而在miR-136抑制劑組中，p-Ras、p-Raf、p-MEK、p-ERK的相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），說明抑制miR-136的表達(dá)可促進(jìn)該信號(hào)通路的激活。對(duì)于PI3K/Akt信號(hào)通路，miR-136模擬物組中p-PI3K、p-Akt的相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），表明過表達(dá)miR-136抑制了PI3K/Akt信號(hào)通路的激活。miR-136抑制劑組中p-PI3K、p-Akt的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），說明抑制miR-136的表達(dá)可促進(jìn)PI3K/Akt信號(hào)通路的激活。這些結(jié)果表明，miR-136能夠通過調(diào)節(jié)Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平，進(jìn)而影響這兩條信號(hào)通路的激活狀態(tài)，為進(jìn)一步研究miR-136調(diào)控靜脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的信號(hào)通路機(jī)制提供了重要依據(jù)。4.2.3通路阻斷實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為了進(jìn)一步驗(yàn)證Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt信號(hào)通路在miR-136調(diào)控靜脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移過程中的作用，設(shè)計(jì)并進(jìn)行了通路阻斷實(shí)驗(yàn)。對(duì)于Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路，選用U0126作為MEK抑制劑，其能夠特異性地抑制MEK的活性，從而阻斷Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的傳導(dǎo)。對(duì)于PI3K/Akt信號(hào)通路，采用LY294002作為PI3K抑制劑，它可以選擇性地抑制PI3K的活性，阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路。實(shí)驗(yàn)分為多個(gè)組，包括對(duì)照組、miR-136模擬物組、miR-136模擬物+U0126組、miR-136模擬物+LY294002組。對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)，不進(jìn)行任何處理。miR-136模擬物組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-136模擬物，以過表達(dá)miR-136。miR-136模擬物+U0126組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-136模擬物24小時(shí)后，加入終濃度為10μM的U0126，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。miR-136模擬物+LY294002組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-136模擬物24小時(shí)后，加入終濃度為20μM的LY294002，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。在進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)時(shí)，采用CCK-8法。將各組細(xì)胞以每孔5000-10000個(gè)的密度接種到96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后，每孔加入10μLCCK-8試劑，37℃孵育1-4小時(shí)，然后用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-136模擬物組細(xì)胞的增殖能力顯著降低（P＜0.05），這與之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。當(dāng)加入U(xiǎn)0126阻斷Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路后，miR-136模擬物+U0126組細(xì)胞的增殖能力進(jìn)一步降低，與miR-136模擬物組相比有顯著差異（P＜0.05）。加入LY294002阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路后，miR-136模擬物+LY294002組細(xì)胞的增殖能力也進(jìn)一步降低，與miR-136模擬物組相比有顯著差異（P＜0.05）。這表明阻斷Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt信號(hào)通路均能增強(qiáng)miR-136對(duì)靜脈平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用。在細(xì)胞遷移檢測(cè)方面，采用Transwell實(shí)驗(yàn)。將各組細(xì)胞用無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL。在上室中加入200μL細(xì)胞懸液，下室中加入500μL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基作為趨化因子。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24-48小時(shí)后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞。將Transwell小室放入4%多聚甲醛固定液中，室溫固定20分鐘。固定結(jié)束后，取出Transwell小室，用PBS清洗3次，每次5分鐘。將Transwell小室放入0.1%結(jié)晶紫染液中，室溫染色15分鐘。染色結(jié)束后，取出Transwell小室，用PBS清洗3次，每次5分鐘，以去除多余的染液。將Transwell小室置于倒置顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，miR-136模擬物組細(xì)胞的遷移能力顯著降低（P＜0.05）。當(dāng)加入U(xiǎn)0126阻斷Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路后，miR-136模擬物+U0126組細(xì)胞的遷移能力進(jìn)一步降低，與miR-136模擬物組相比有顯著差異（P＜0.05）。加入LY294002阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路后，miR-136模擬物+LY294002組細(xì)胞的遷移能力也進(jìn)一步降低，與miR-136模擬物組相比有顯著差異（P＜0.05）。這說明阻斷Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt信號(hào)通路均能增強(qiáng)miR-136對(duì)靜脈平滑肌細(xì)胞遷移的抑制作用。綜合以上通路阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以得出結(jié)論：Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt信號(hào)通路在miR-136調(diào)控靜脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移過程中發(fā)揮著重要作用。miR-136可能通過抑制這兩條信號(hào)通路的激活，進(jìn)而抑制靜脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。這些結(jié)果為深入理解miR-136調(diào)控靜脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的分子機(jī)制提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，也為進(jìn)一步研究血管疾病的發(fā)病機(jī)制和治療策略提供了重要的理論依據(jù)。4.3機(jī)制總結(jié)與討論綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，miR-136調(diào)控靜脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的分子機(jī)制如下：miR-136能夠特異性地與靶基因Steap3的3'-UTR區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)，通過抑制Steap3的表達(dá)，阻斷Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt信號(hào)通路的激活。在Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路中，miR-136抑制Steap3后，Ras蛋白的激活受到抑制，無法有效激活下游的Raf激酶、MEK激酶和ERK激酶，使磷酸化的ERK水平降低，進(jìn)而減少了進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)的ERK，抑制了細(xì)胞的增殖和遷移相關(guān)基因的表達(dá)。在PI3K/Akt信號(hào)通路中，miR-136對(duì)Steap3的抑制導(dǎo)致PI3K的激活受阻，無法催化PIP2轉(zhuǎn)化為PIP3，使得Akt無法被招募到細(xì)胞膜上并磷酸化激活，下游與細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)的底物無法被磷酸化，從而抑制了細(xì)胞的增殖和遷移。這兩條信號(hào)通路在細(xì)胞增殖和遷移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，miR-136通過抑制它們的激活，有效地抑制了靜脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。從生物學(xué)意義上看，這一機(jī)制的發(fā)現(xiàn)為理解血管疾病的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角。在冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)后，移植靜脈面臨血流動(dòng)力學(xué)改變、炎癥刺激等多種病理因素，這些因素可能導(dǎo)致miR-136的表達(dá)異常降低，使得Steap3的表達(dá)失去抑制，進(jìn)而激活Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt信號(hào)通路，引發(fā)靜脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖和遷移，最終導(dǎo)致移植靜脈內(nèi)膜增生、再狹窄。在下肢靜脈曲張中，長(zhǎng)期的靜脈高壓等因素可能破壞了miR-136對(duì)靜脈平滑肌細(xì)胞的正常調(diào)控機(jī)制，使得miR-136表達(dá)減少，Steap3及相關(guān)信號(hào)通路異常激活，促進(jìn)靜脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，導(dǎo)致靜脈壁結(jié)構(gòu)和功能異常，形成靜脈曲張。在深靜脈血栓形成后綜合征中，miR-136表達(dá)的變化可能同樣參與了血栓機(jī)化和再通過程中靜脈平滑肌細(xì)胞的異常行為，影響疾病的發(fā)展。從潛在應(yīng)用價(jià)值方面考慮，本研究結(jié)果為血管疾病的治療提供了潛在的靶點(diǎn)?？梢蚤_發(fā)針對(duì)miR-136的治療策略，通過上調(diào)miR-136的表達(dá)，抑制Steap3及相關(guān)信號(hào)通路，有望抑制靜脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖和遷移，從而預(yù)防和治療冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)后移植靜脈再狹窄、下肢靜脈曲張、深靜脈血栓形成后綜合征等血管疾病。可以設(shè)計(jì)合成miR-136模擬物，通過合適的載體將其遞送至病變部位，增加miR-136的表達(dá)水平；或者開發(fā)能夠促進(jìn)內(nèi)源性miR-136表達(dá)的藥物，調(diào)節(jié)機(jī)體自身的miR-136表達(dá)機(jī)制。針對(duì)Steap3及Ras/Raf/MEK/ERK、PI3K/Akt信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，也可以研發(fā)相應(yīng)的抑制劑，阻斷異常激活的信號(hào)通路，達(dá)到治療血管疾病的目的。這些潛在的治療策略需要進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證其安全性和有效性，但本研究為其提供了重要的理論基礎(chǔ)和研究方向。五、miR-23b對(duì)靜脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的作用研究5.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法5.1.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理本研究依舊選用人臍靜脈平滑肌細(xì)胞（HUVSMCs），其獲取方式和原代培養(yǎng)方法與研究miR-136時(shí)一致，均是從健康產(chǎn)婦分娩后的臍帶獲取，采用改良的組織塊貼壁法培養(yǎng)。待細(xì)胞傳代培養(yǎng)至合適代數(shù)且狀態(tài)良好時(shí)，進(jìn)行針對(duì)miR-23b的轉(zhuǎn)染處理。實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組、miR-23b模擬物組、miR-23b抑制劑組。miR-23b模擬物是人工合成的雙鏈RNA，其序列與內(nèi)源性成熟