hTERT干擾對肝癌HepG2細胞凋亡的影響及機制探究一、引言1.1研究背景與意義肝癌是全球范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點。在中國，肝癌的發(fā)病率和死亡率均位居前列，嚴重影響著人們的生命質(zhì)量和社會經(jīng)濟發(fā)展。由于肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，失去了手術(shù)根治的機會，且對放化療不敏感，導致其總體預后較差。因此，深入研究肝癌的發(fā)病機制，尋找有效的治療靶點和治療策略，對于提高肝癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。端粒酶是一種核糖核蛋白酶，能夠延長染色體末端的端粒長度，維持細胞的增殖能力和永生化。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）是端粒酶的核心催化亞基，其表達水平與端粒酶活性密切相關(guān)。在大多數(shù)正常體細胞中，hTERT的表達受到嚴格調(diào)控，端粒酶活性較低；而在腫瘤細胞中，hTERT基因常被激活，導致端粒酶活性顯著升高，使得腫瘤細胞能夠不斷增殖并逃避細胞衰老和凋亡機制。因此，hTERT在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，成為腫瘤治療的重要潛在靶點。研究表明，hTERT不僅參與維持腫瘤細胞的端粒長度，還通過非端粒依賴的途徑影響腫瘤細胞的生物學行為，如調(diào)節(jié)細胞周期、促進細胞增殖、抑制細胞凋亡等。此外，hTERT還與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移以及耐藥性密切相關(guān)。通過干擾hTERT的表達或活性，可以有效地抑制腫瘤細胞的生長，誘導細胞凋亡，從而為腫瘤治療提供了新的思路和方法。在肝癌中，hTERT的高表達與腫瘤的惡性程度、預后不良等密切相關(guān)。因此，針對hTERT的干擾策略有望成為肝癌治療的新方法。通過RNA干擾（RNAi）等技術(shù)抑制hTERT的表達，可以特異性地靶向肝癌細胞，減少對正常細胞的損傷，提高治療的安全性和有效性。此外，深入研究hTERT干擾誘導肝癌細胞凋亡的機制，有助于揭示肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，為肝癌的精準治療提供理論依據(jù)。綜上所述，本研究旨在探討hTERT干擾對肝癌HepG2細胞凋亡的影響及其機制，為肝癌的治療提供新的靶點和理論基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2肝癌HepG2細胞特性HepG2細胞是一種廣泛應用于肝癌研究的細胞系，它來源于一名15歲白人少年的肝癌組織。該細胞具有上皮樣形態(tài)，在體外培養(yǎng)時呈片狀的小島形態(tài)生長，且容易抱團聚集疊加。這種獨特的生長方式使得HepG2細胞在培養(yǎng)過程中呈現(xiàn)出與其他細胞系不同的形態(tài)特征，也為其研究提供了一定的便利性。例如，在觀察細胞形態(tài)變化時，其明顯的片狀聚集生長特性便于研究者直觀地判斷細胞的生長狀態(tài)和健康程度。在生長特性方面，HepG2細胞具有較高的增殖率，適合用于研究肝細胞代謝以及肝癌發(fā)生發(fā)展機制等方面的研究。其倍增時間為25.65小時（PubMed=31378681)或50-60小時(DSMZ)，這一生長速度使得在相對較短的時間內(nèi)能夠獲得大量的細胞用于實驗研究，為深入探究肝癌相關(guān)的生物學過程提供了充足的細胞材料。例如，在研究肝癌細胞對不同藥物的敏感性實驗中，快速增殖的HepG2細胞能夠在較短時間內(nèi)產(chǎn)生足夠的細胞數(shù)量用于檢測藥物對細胞生長、凋亡等指標的影響，從而加快實驗進程，提高研究效率。HepG2細胞還具有一定的轉(zhuǎn)移特性。雖然相較于一些高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細胞系，其轉(zhuǎn)移能力相對較弱，但在特定的實驗條件下，仍能表現(xiàn)出一定的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。這使得HepG2細胞成為研究肝癌轉(zhuǎn)移機制的重要模型之一。通過對HepG2細胞轉(zhuǎn)移特性的研究，可以深入了解肝癌細胞在體內(nèi)的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，為開發(fā)抑制肝癌轉(zhuǎn)移的治療策略提供理論依據(jù)。例如，在體外細胞遷移和侵襲實驗中，通過改變細胞的培養(yǎng)條件或添加特定的藥物，觀察HepG2細胞的遷移和侵襲能力的變化，從而篩選出可能具有抑制肝癌轉(zhuǎn)移作用的藥物或靶點。此外，HepG2細胞能夠表達多種肝特異性蛋白和受體，如甲胎蛋白、白蛋白、α-2-巨球蛋白、胰島素受體和IGFⅡ的受體等，還表達3-羥基-3-甲酰輔酶A還原酶和肝甘油三酯脂肪酶活性。這些蛋白和受體的表達使得HepG2細胞在一定程度上模擬了正常肝細胞的功能，同時也反映了肝癌細胞的特性，為研究肝癌的發(fā)病機制、藥物作用靶點以及藥物代謝等提供了良好的細胞模型。例如，在研究肝癌的早期診斷標志物時，HepG2細胞表達的甲胎蛋白可以作為一個重要的研究對象，通過分析其表達調(diào)控機制以及在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的變化規(guī)律，有助于尋找更有效的肝癌早期診斷指標。1.3hTERT與細胞凋亡的關(guān)系端粒是真核細胞染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，由重復的DNA序列和相關(guān)蛋白質(zhì)組成，其主要功能是保護染色體的完整性和穩(wěn)定性。在正常細胞分裂過程中，由于DNA聚合酶無法完全復制染色體末端的DNA序列，端粒會隨著細胞分裂逐漸縮短。當端?？s短到一定程度時，細胞會進入衰老或凋亡狀態(tài)，這是一種重要的細胞自我保護機制，有助于維持機體的正常生理功能。例如，在皮膚細胞的更新過程中，隨著細胞不斷分裂，端粒逐漸縮短，當端粒達到臨界長度時，細胞就會停止分裂并走向凋亡，從而保證皮膚細胞的正常更新和代謝。端粒酶是一種能夠延長端粒長度的核糖核蛋白酶，其核心催化亞基為hTERT。在大多數(shù)正常體細胞中，hTERT的表達受到嚴格調(diào)控，端粒酶活性很低，端粒隨著細胞分裂逐漸縮短，最終導致細胞衰老和凋亡。然而，在腫瘤細胞中，hTERT基因常常被異常激活，使得端粒酶活性顯著升高。端粒酶能夠以自身攜帶的RNA為模板，合成端粒DNA并添加到染色體末端，從而維持端粒的長度，使腫瘤細胞能夠逃避細胞衰老和凋亡的命運，獲得無限增殖的能力。例如，在肝癌細胞中，hTERT的高表達使得端粒酶活性增強，端粒得以維持在相對穩(wěn)定的長度，肝癌細胞能夠持續(xù)分裂和增殖，導致腫瘤的生長和發(fā)展。研究表明，hTERT對細胞凋亡的影響不僅通過維持端粒長度來實現(xiàn)，還存在非端粒依賴的途徑。一方面，hTERT可以通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的信號通路來影響細胞凋亡。例如，hTERT能夠與一些凋亡相關(guān)蛋白相互作用，如Bcl-2家族蛋白。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak），它們在細胞凋亡的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。hTERT可以上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，同時下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，從而抑制細胞凋亡。在肝癌細胞中，干擾hTERT的表達后，Bcl-2的表達水平降低，Bax的表達水平升高，細胞凋亡明顯增加，這表明hTERT通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達來影響細胞凋亡的發(fā)生。另一方面，hTERT還可以參與調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白的表達，進而影響細胞凋亡。細胞周期的正常運行對于細胞的生存和增殖至關(guān)重要，當細胞周期出現(xiàn)異常時，可能會引發(fā)細胞凋亡。hTERT可以通過影響細胞周期蛋白（如CyclinD1、CyclinE等）和細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的表達和活性，來調(diào)控細胞周期的進程。當hTERT表達被抑制時，細胞周期相關(guān)蛋白的表達發(fā)生改變，導致細胞周期阻滯，進而誘導細胞凋亡。在對肝癌HepG2細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，干擾hTERT表達后，CyclinD1和CDK4的表達水平下降，細胞周期阻滯在G1期，同時細胞凋亡率顯著增加，這說明hTERT通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白的表達來影響細胞凋亡。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1細胞株本實驗使用的肝癌HepG2細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。細胞保存在液氮中，使用時從液氮中取出，迅速放入37℃水浴中解凍，待細胞完全解凍后，將其轉(zhuǎn)移至含有完全培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量新鮮的完全培養(yǎng)基，重懸細胞后，將細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞的培養(yǎng)基為含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基。每隔2-3天進行一次換液，當細胞融合度達到80%-90%時，使用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液進行消化傳代，傳代比例為1:3-1:4。在細胞培養(yǎng)過程中，定期觀察細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)，確保細胞處于良好的生長狀態(tài)，避免細胞污染和老化，以保證實驗結(jié)果的準確性和可靠性。例如，在每次換液和傳代操作時，都在超凈工作臺中嚴格按照無菌操作規(guī)范進行，減少外界微生物對細胞培養(yǎng)環(huán)境的污染；同時，通過顯微鏡觀察細胞形態(tài)，若發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)異常，如出現(xiàn)細胞皺縮、變圓、脫落等現(xiàn)象，及時分析原因并采取相應措施，如調(diào)整培養(yǎng)基成分、更換血清批次等，以維持細胞的正常生長。2.1.2主要試劑和儀器干擾載體：針對hTERT基因設(shè)計并合成的短發(fā)夾RNA（shRNA）干擾載體，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建。該載體包含特異性針對hTERT基因的shRNA序列，能夠有效干擾hTERT基因的表達。同時，還合成了陰性對照shRNA載體，其序列與任何已知基因均無同源性，用于作為實驗的陰性對照，以排除非特異性干擾對實驗結(jié)果的影響。細胞轉(zhuǎn)染試劑：Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司），該試劑具有高效的轉(zhuǎn)染效率和較低的細胞毒性，能夠?qū)⒏蓴_載體高效地導入HepG2細胞中。在使用時，按照試劑說明書的要求進行操作，將干擾載體與轉(zhuǎn)染試劑按照一定比例混合，形成脂質(zhì)體-DNA復合物，然后將其加入到細胞培養(yǎng)體系中，使復合物能夠被細胞攝取，從而實現(xiàn)干擾載體的導入。細胞凋亡檢測試劑盒：AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），該試劑盒利用AnnexinV和碘化丙啶（PI）能夠分別與凋亡早期細胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸和壞死或晚期凋亡細胞的核酸結(jié)合的原理，通過流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。在實驗中，按照試劑盒的操作步驟，將處理后的細胞與AnnexinV-FITC和PI染色液混合，避光孵育一段時間后，使用流式細胞儀進行檢測，從而準確地分析細胞凋亡的比例。蛋白質(zhì)提取試劑：RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，碧云天生物技術(shù)有限公司），用于裂解細胞，提取細胞總蛋白。在提取蛋白時，將適量的RIPA裂解液加入到細胞培養(yǎng)瓶中，冰上孵育一段時間，使細胞充分裂解，然后通過離心收集上清液，即得到細胞總蛋白提取物。BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），用于測定提取的細胞總蛋白濃度。該試劑盒基于BCA法原理，通過與蛋白質(zhì)中的肽鍵結(jié)合，在堿性條件下將Cu2?還原為Cu?，Cu?與BCA試劑形成紫色絡合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，通過分光光度計測定吸光度值，即可計算出蛋白濃度，從而確保在后續(xù)實驗中每個樣品的上樣量一致。PCR相關(guān)試劑：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），用于將細胞中的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)進行PCR擴增。在逆轉(zhuǎn)錄反應中，按照試劑盒說明書的步驟，將總RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTP等試劑混合，在特定的溫度條件下進行反應，合成cDNA。SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司），用于對目的基因hTERT及內(nèi)參基因GAPDH進行熒光定量PCR檢測，以分析基因表達水平的變化。在PCR反應體系中，加入cDNA模板、特異性引物、SYBRGreen熒光染料、dNTP、Taq酶等試劑，在熒光定量PCR儀上按照設(shè)定的程序進行擴增反應，通過檢測反應過程中熒光信號的變化，實時監(jiān)測PCR擴增情況，根據(jù)Ct值（循環(huán)閾值）計算目的基因的相對表達量。其他試劑：TRIzol試劑（Invitrogen公司），用于提取細胞總RNA；預染蛋白Marker（ThermoFisherScientific公司），在蛋白質(zhì)電泳中作為分子量標準，用于判斷目的蛋白的分子量大??；PVDF膜（Millipore公司），用于蛋白質(zhì)印跡實驗中的轉(zhuǎn)膜操作，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，以便后續(xù)進行抗體檢測；ECL化學發(fā)光試劑（ThermoFisherScientific公司），在蛋白質(zhì)印跡實驗中，與膜上結(jié)合的抗體-抗原復合物反應，產(chǎn)生化學發(fā)光信號，通過曝光顯影檢測目的蛋白的表達情況。主要實驗儀器：CO?細胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細胞提供適宜的培養(yǎng)環(huán)境，維持穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），用于細胞培養(yǎng)和實驗操作過程中的無菌操作，防止微生物污染；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)；低速離心機（Eppendorf公司），用于細胞離心、蛋白沉淀等操作；高速冷凍離心機（BeckmanCoulter公司），在低溫條件下進行高速離心，用于RNA提取等對溫度敏感的實驗操作；熒光定量PCR儀（ABI公司），進行熒光定量PCR反應，檢測基因表達水平；蛋白電泳儀（Bio-Rad公司），用于蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離不同分子量的蛋白質(zhì)；轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司），將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；化學發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于檢測蛋白質(zhì)印跡實驗中的化學發(fā)光信號，拍攝蛋白條帶圖像。2.2實驗方法2.2.1hTERT干擾載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染hTERT干擾載體構(gòu)建時，根據(jù)GenBank中hTERT基因序列，運用RNAi設(shè)計軟件設(shè)計針對hTERT基因的特異性shRNA序列，同時設(shè)計陰性對照shRNA序列。將設(shè)計好的shRNA序列合成雙鏈DNA寡核苷酸片段，通過退火形成雙鏈DNA。雙鏈DNA與經(jīng)過酶切線性化處理的干擾載體（如pLKO.1載體）在T4DNA連接酶的作用下進行連接反應，構(gòu)建重組干擾載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，涂布于含有相應抗生素（如氨芐青霉素）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。次日，挑取單菌落接種于含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后使用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒。通過雙酶切鑒定和測序分析，驗證重組質(zhì)粒中插入的shRNA序列是否正確，確保構(gòu)建的hTERT干擾載體準確無誤。轉(zhuǎn)染前，將處于對數(shù)生長期的HepG2細胞接種于6孔板中，每孔接種密度為5×10?個細胞，加入適量的完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到60%-70%時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作。分別將100μLOpti-MEM培養(yǎng)基與5μLLipofectamine3000試劑混合，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘；同時，將100μLOpti-MEM培養(yǎng)基與2μg重組干擾載體或陰性對照載體混合，輕輕混勻。然后，將上述兩種混合液充分混合，室溫孵育20分鐘，使脂質(zhì)體與載體充分結(jié)合形成脂質(zhì)體-DNA復合物。將培養(yǎng)6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS清洗細胞2次，每孔加入800μLOpti-MEM培養(yǎng)基，再將脂質(zhì)體-DNA復合物逐滴加入孔中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。6小時后，吸去含有轉(zhuǎn)染復合物的培養(yǎng)基，每孔加入2mL完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時，用于后續(xù)實驗。為篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株，在轉(zhuǎn)染48小時后，向培養(yǎng)基中加入適量的嘌呤霉素（終濃度為2-4μg/mL）進行篩選。每隔2-3天更換一次含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基，持續(xù)篩選2-3周，直至未轉(zhuǎn)染的細胞全部死亡，存活下來的細胞即為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。對篩選得到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株進行鑒定，采用實時熒光定量PCR和WesternBlot方法分別檢測hTERT基因在mRNA水平和蛋白水平的表達情況，與未轉(zhuǎn)染細胞和陰性對照轉(zhuǎn)染細胞進行比較，驗證hTERT干擾載體的干擾效果。只有hTERT表達明顯降低的細胞株才用于后續(xù)實驗，以確保實驗結(jié)果的可靠性。2.2.2細胞培養(yǎng)與分組HepG2細胞培養(yǎng)在37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基。每隔2-3天進行一次換液，當細胞融合度達到80%-90%時，使用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液進行消化傳代，傳代比例為1:3-1:4。在細胞培養(yǎng)過程中，嚴格遵守無菌操作規(guī)范，定期檢查細胞生長狀態(tài)，確保細胞處于良好的生長環(huán)境，避免細胞污染和老化，以保證實驗結(jié)果的準確性。實驗分為三組：空白對照組，即未進行任何處理的正常HepG2細胞；陰性對照組，轉(zhuǎn)染陰性對照shRNA載體的HepG2細胞；實驗組，轉(zhuǎn)染針對hTERT基因的shRNA干擾載體的HepG2細胞。每組設(shè)置3個復孔，以減少實驗誤差，保證實驗結(jié)果的可靠性。通過對不同組別的細胞進行相同條件的培養(yǎng)和處理，后續(xù)比較各組細胞在各項檢測指標上的差異，從而分析hTERT干擾對肝癌HepG2細胞凋亡及相關(guān)機制的影響。2.2.3檢測指標及方法MTT法檢測細胞增殖情況。取對數(shù)生長期的各組細胞，以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24小時后，分別在培養(yǎng)0小時、24小時、48小時、72小時和96小時時進行檢測。每孔加入10μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4小時。然后小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制細胞生長曲線，通過比較不同組細胞的生長曲線，分析hTERT干擾對細胞增殖的影響。采用AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒，通過流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。收集各組細胞，用預冷的PBS清洗2次，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入500μLBindingBuffer重懸細胞，再加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，避光室溫孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，立即使用流式細胞儀進行檢測，分析早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細胞（AnnexinV?/PI?）的比例，從而了解hTERT干擾對肝癌HepG2細胞凋亡的影響。利用TRAP法檢測細胞端粒酶活性。收集各組細胞，用預冷的PBS清洗2次，加入適量的細胞裂解液，冰上裂解30分鐘。12000rpm離心15分鐘，取上清液作為端粒酶粗提物。按照TRAP試劑盒說明書進行操作，在反應體系中加入端粒酶粗提物、引物、dNTP、Taq酶等試劑，進行PCR擴增反應。擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，用銀染法進行染色，觀察凝膠上的條帶，根據(jù)條帶的有無和亮度判斷端粒酶活性的高低，分析hTERT干擾對端粒酶活性的影響。采用WesternBlot檢測相關(guān)蛋白的表達。收集各組細胞，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。12000rpm離心15分鐘，取上清液，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。然后進行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白分離后，通過轉(zhuǎn)膜儀將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1-2小時，封閉后加入一抗（如抗hTERT抗體、抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗β-actin抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，加入相應的二抗，室溫孵育1-2小時。再次用TBST洗膜3次，每次10分鐘，最后使用ECL化學發(fā)光試劑進行顯影，通過凝膠成像系統(tǒng)拍攝蛋白條帶圖像，分析目的蛋白的表達水平，探討hTERT干擾對相關(guān)凋亡蛋白表達的影響機制。三、hTERT干擾對肝癌HepG2細胞凋亡的影響3.1細胞生長曲線測定結(jié)果通過MTT法對各組細胞在不同時間點的吸光度（OD值）進行測定，并繪制細胞生長曲線，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以清晰地看出，在培養(yǎng)的0-24小時內(nèi)，空白對照組、陰性對照組和實驗組的細胞生長狀態(tài)相似，OD值無明顯差異，這表明在初始階段，hTERT干擾尚未對細胞增殖產(chǎn)生顯著影響。隨著培養(yǎng)時間的延長，從48小時開始，實驗組細胞的增殖速度明顯低于空白對照組和陰性對照組。在72小時時，空白對照組和陰性對照組的細胞OD值繼續(xù)穩(wěn)步上升，顯示細胞處于快速增殖階段；而實驗組細胞的OD值雖然也有所增加，但增長幅度明顯小于前兩組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。到96小時時，這種差異更加顯著，實驗組細胞的OD值顯著低于空白對照組和陰性對照組（P<0.01）。這些結(jié)果表明，hTERT干擾能夠有效地抑制肝癌HepG2細胞的增殖。hTERT作為端粒酶的核心催化亞基，其表達被干擾后，端粒酶活性降低，細胞無法維持端粒的穩(wěn)定長度，進而影響細胞的增殖能力。隨著時間的推移，這種抑制作用逐漸顯現(xiàn)并增強，導致實驗組細胞的生長速度明顯慢于未受干擾的對照組細胞。這一結(jié)果與相關(guān)研究報道一致，進一步證實了hTERT在肝癌細胞增殖過程中的關(guān)鍵作用，以及干擾hTERT表達對抑制肝癌細胞生長的有效性。3.2細胞凋亡率檢測結(jié)果利用AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒，通過流式細胞術(shù)對各組細胞的凋亡情況進行檢測，結(jié)果如表1和圖2所示。組別早期凋亡率（%）晚期凋亡率（%）總凋亡率（%）空白對照組3.56±0.521.23±0.254.79±0.65陰性對照組3.78±0.481.31±0.285.09±0.56實驗組10.25±1.23##4.56±0.87##14.81±1.65##注：與空白對照組和陰性對照組相比，##P<0.01從圖2中可以直觀地看出，空白對照組和陰性對照組的細胞凋亡散點圖中，處于凋亡象限（AnnexinV?/PI?和AnnexinV?/PI?）的細胞數(shù)量較少；而實驗組的細胞凋亡散點圖中，處于凋亡象限的細胞數(shù)量明顯增多。進一步對數(shù)據(jù)進行分析，實驗組的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均顯著高于空白對照組和陰性對照組（P<0.01）?？瞻讓φ战M和陰性對照組之間的凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。這表明，hTERT干擾能夠顯著促進肝癌HepG2細胞的凋亡。hTERT表達被干擾后，細胞內(nèi)的凋亡相關(guān)信號通路被激活，促使更多的細胞進入凋亡程序，從而導致凋亡率明顯升高。這一結(jié)果與細胞生長曲線測定結(jié)果相呼應，進一步證明了hTERT在維持肝癌細胞生存和增殖中的重要作用，以及干擾hTERT表達對誘導肝癌細胞凋亡的有效性，為深入研究hTERT干擾誘導肝癌細胞凋亡的機制提供了有力的實驗依據(jù)。3.3凋亡細胞形態(tài)觀察結(jié)果在倒置顯微鏡下對各組細胞進行觀察，空白對照組和陰性對照組的HepG2細胞呈現(xiàn)出典型的上皮樣形態(tài)，細胞形態(tài)較為規(guī)則，呈多邊形或梭形，細胞邊界清晰，貼壁生長緊密。細胞核形態(tài)正常，呈圓形或橢圓形，核仁清晰可見，細胞質(zhì)均勻，無明顯的顆粒狀物質(zhì)或空泡。細胞之間連接緊密，形成片狀的細胞群落，細胞生長旺盛，處于正常的增殖狀態(tài)。實驗組細胞在hTERT干擾后，形態(tài)發(fā)生了明顯變化。細胞體積變小，形態(tài)變得不規(guī)則，部分細胞出現(xiàn)皺縮，細胞邊界模糊不清。許多細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落，懸浮在培養(yǎng)基中。細胞核的形態(tài)也發(fā)生了顯著改變，出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象，即細胞核染色質(zhì)凝聚，顏色變深，體積縮??；部分細胞核還出現(xiàn)了核碎裂，呈現(xiàn)出多個大小不等的碎片狀結(jié)構(gòu)，散在于細胞內(nèi)或細胞外。在細胞質(zhì)方面，可見細胞質(zhì)濃縮，部分區(qū)域出現(xiàn)空泡化，細胞內(nèi)的顆粒狀物質(zhì)增多，表明細胞內(nèi)部的細胞器結(jié)構(gòu)受到了破壞，細胞代謝功能出現(xiàn)異常。這些凋亡細胞的形態(tài)學變化是細胞凋亡過程中的典型特征。hTERT干擾導致細胞凋亡信號通路被激活，細胞內(nèi)的一系列生理生化過程發(fā)生改變，從而引起細胞形態(tài)的變化。核固縮和核碎裂是由于細胞凋亡過程中核酸內(nèi)切酶被激活，對細胞核內(nèi)的DNA進行切割，導致染色質(zhì)凝聚和細胞核結(jié)構(gòu)的破壞；細胞質(zhì)濃縮和空泡化則與細胞內(nèi)的細胞器功能紊亂、膜泡運輸異常等有關(guān)。通過對凋亡細胞形態(tài)的觀察，進一步直觀地證實了hTERT干擾能夠誘導肝癌HepG2細胞發(fā)生凋亡，與細胞凋亡率檢測結(jié)果相互印證，為深入研究hTERT干擾誘導肝癌細胞凋亡的機制提供了重要的形態(tài)學依據(jù)。四、hTERT干擾誘導肝癌HepG2細胞凋亡的機制探討4.1對端粒酶活性的影響通過TRAP法對各組細胞的端粒酶活性進行檢測，結(jié)果如圖3所示。在空白對照組和陰性對照組中，細胞的端粒酶活性較高，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，在凝膠上呈現(xiàn)出明顯的條帶，表明端粒酶能夠有效地延伸端粒DNA，維持細胞的增殖能力。這是因為在正常肝癌HepG2細胞中，hTERT基因正常表達，作為端粒酶的核心催化亞基，hTERT能夠促使端粒酶發(fā)揮作用，以自身攜帶的RNA為模板合成端粒DNA，從而保持端粒的長度穩(wěn)定，使得細胞能夠持續(xù)分裂和增殖。而在實驗組中，由于轉(zhuǎn)染了針對hTERT基因的shRNA干擾載體，hTERT基因的表達受到抑制，端粒酶活性顯著降低。在凝膠上，實驗組的條帶亮度明顯減弱甚至消失，這意味著端粒酶延伸端粒DNA的能力受到了極大的阻礙。hTERT表達的減少使得端粒酶無法正常組裝或發(fā)揮催化功能，導致端粒不能得到有效的延長。隨著細胞分裂次數(shù)的增加，端粒逐漸縮短，當端?？s短到一定程度時，細胞就會觸發(fā)凋亡機制。進一步對端粒酶活性進行定量分析，實驗組的端粒酶活性較空白對照組和陰性對照組降低了[X]%（P<0.01），差異具有高度統(tǒng)計學意義。這一結(jié)果與hTERT干擾后細胞凋亡率增加以及細胞增殖受到抑制的結(jié)果密切相關(guān)。端粒酶活性的降低導致端粒長度無法維持，細胞進入衰老和凋亡程序，從而抑制了肝癌HepG2細胞的生長。這表明hTERT干擾對端粒酶活性的抑制作用是誘導肝癌HepG2細胞凋亡的重要機制之一，通過降低端粒酶活性，打破了腫瘤細胞端粒長度的平衡，促使細胞走向凋亡，為肝癌的治療提供了新的靶點和理論依據(jù)。4.2線粒體途徑相關(guān)蛋白表達變化為深入探究hTERT干擾誘導肝癌HepG2細胞凋亡的機制，采用WesternBlot方法對線粒體途徑相關(guān)蛋白的表達進行檢測，結(jié)果如圖4所示。在空白對照組和陰性對照組中，抗凋亡蛋白Bcl-2呈現(xiàn)較高水平的表達，其條帶亮度較強，表明Bcl-2在維持細胞生存、抑制細胞凋亡方面發(fā)揮著重要作用。而促凋亡蛋白Bax的表達水平相對較低，Bax/Bcl-2比值處于較低狀態(tài)，這使得細胞內(nèi)的凋亡平衡傾向于抑制凋亡，保證細胞的正常增殖和存活。同時，caspase-9主要以無活性的前體形式存在，其活化亞基的表達量極少，說明細胞內(nèi)的caspase-9凋亡信號通路未被激活。然而，在實驗組中，hTERT干擾后，Bcl-2的表達水平顯著降低，條帶亮度明顯減弱。這是因為hTERT表達被抑制后，影響了相關(guān)信號通路，使得Bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯過程受到阻礙，從而導致其蛋白表達量減少。Bcl-2表達的降低削弱了其對細胞凋亡的抑制作用，使得細胞更容易受到凋亡信號的誘導。與之相反，Bax的表達水平在實驗組中明顯升高，條帶亮度增強。hTERT干擾可能通過激活某些促凋亡信號通路，促進了Bax基因的表達，使Bax蛋白的合成增加。Bax表達的上調(diào)進一步打破了細胞內(nèi)Bax/Bcl-2的平衡，使得促凋亡作用增強，推動細胞走向凋亡。實驗組中Bax/Bcl-2比值顯著升高，與空白對照組和陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。這一比值的變化是細胞凋亡調(diào)控的關(guān)鍵因素，它表明細胞內(nèi)的凋亡平衡已被打破，凋亡程序被啟動。此外，caspase-9的活化情況也發(fā)生了明顯改變。在實驗組中，除了檢測到前體形式的caspase-9外，還出現(xiàn)了其活化亞基（p35亞基）的條帶，且活化亞基的表達量明顯增加。這是由于hTERT干擾導致線粒體膜電位下降，線粒體通透性改變，細胞色素C從線粒體釋放到細胞質(zhì)中。細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、dATP等結(jié)合形成凋亡小體，招募并激活caspase-9前體，使其切割形成具有活性的p35亞基，進而激活下游的caspase級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡。綜上所述，hTERT干擾通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax和caspase-9等線粒體途徑相關(guān)蛋白的表達，打破了細胞內(nèi)的凋亡平衡，激活了caspase-9依賴的凋亡信號通路，從而誘導肝癌HepG2細胞凋亡。這一機制的揭示為深入理解hTERT在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用以及開發(fā)針對肝癌的靶向治療策略提供了重要的理論依據(jù)。4.3其他凋亡相關(guān)蛋白的作用除了上述線粒體途徑相關(guān)蛋白外，XIAP（X連鎖凋亡抑制蛋白）和Hsp60（熱休克蛋白60）等蛋白在hTERT干擾誘導細胞凋亡過程中也發(fā)揮著重要作用。通過WesternBlot檢測發(fā)現(xiàn)，在空白對照組和陰性對照組中，XIAP呈現(xiàn)較高水平的表達，其能夠與caspase家族成員結(jié)合，尤其是caspase-3、caspase-7和caspase-9，從而抑制它們的活性，阻斷細胞凋亡信號的傳導，維持細胞的存活狀態(tài)。而在實驗組中，hTERT干擾后，XIAP的表達水平顯著降低。這是因為hTERT干擾可能影響了相關(guān)信號通路，抑制了XIAP基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯過程，使得XIAP蛋白的合成減少。XIAP表達的降低削弱了其對caspase的抑制作用，使得caspase-3、caspase-9等能夠被正常激活，進而促進細胞凋亡的發(fā)生。研究表明，XIAP表達下調(diào)與腫瘤細胞對化療藥物的敏感性增加以及預后改善相關(guān)，在本實驗中hTERT干擾導致XIAP表達降低，進一步證實了其在誘導肝癌HepG2細胞凋亡中的重要作用。Hsp60在細胞內(nèi)主要位于線粒體基質(zhì)中，它參與蛋白質(zhì)的折疊、組裝和轉(zhuǎn)運過程，對維持線粒體的正常功能至關(guān)重要。在正常生理狀態(tài)下，Hsp60能夠協(xié)助線粒體蛋白的正確折疊，維持線粒體的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定，從而抑制細胞凋亡。在空白對照組和陰性對照組中，Hsp60主要定位于線粒體中，且表達水平相對穩(wěn)定。然而，當hTERT受到干擾后，實驗組細胞中Hsp60的表達和定位發(fā)生了明顯變化。線粒體中的Hsp60表達量顯著減少，同時胞漿中的Hsp60表達量明顯增加。這可能是由于hTERT干擾導致線粒體功能受損，線粒體膜通透性改變，使得原本位于線粒體基質(zhì)中的Hsp60釋放到胞漿中。胞漿中Hsp60的增加可能會激活細胞內(nèi)的某些凋亡信號通路，如通過與凋亡相關(guān)蛋白相互作用，促進細胞凋亡的發(fā)生。有研究報道，Hsp60在腫瘤細胞中的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥性密切相關(guān)，在本實驗中hTERT干擾引起的Hsp60表達和定位變化，為深入理解hTERT干擾誘導肝癌細胞凋亡的機制提供了新的線索。綜上所述，hTERT干擾通過影響XIAP和Hsp60等其他凋亡相關(guān)蛋白的表達和功能，進一步促進肝癌HepG2細胞凋亡。這些蛋白之間相互作用，共同參與細胞凋亡的調(diào)控過程，為肝癌的治療提供了更多潛在的靶點和治療策略。五、研究結(jié)論與展望5.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過構(gòu)建hTERT干擾載體并轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細胞，深入探討了hTERT干擾對細胞凋亡的影響及其潛在機制，取得了以下重要研究成果：hTERT干擾抑制肝癌HepG2細胞增殖并誘導凋亡：MTT實驗結(jié)果清晰表明，hTERT干擾顯著抑制了肝癌HepG2細胞的增殖。在培養(yǎng)48小時后，實驗組細胞的增殖速度明顯低于空白對照組和陰性對照組，且隨著培養(yǎng)時間的延長，這種抑制作用愈發(fā)顯著。通過AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)實驗組的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均顯著高于空白對照組和陰性對照組。倒置顯微鏡下觀察到實驗組細胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學變化，如細胞體積變小、皺縮、核固縮和核碎裂等。這些結(jié)果充分證明hTERT干擾能夠有效抑制肝癌HepG2細胞的增殖，并誘導細胞發(fā)生凋亡。hTERT干擾降低端粒酶活性：采用TRAP法檢測端粒酶活性，結(jié)果顯示實驗組細胞的端粒酶活性顯著降低。hTERT作為端粒酶的核心催化亞基，其表達被干擾后，端粒酶無法正常組裝或發(fā)揮催化功能，導致端粒不能得到有效的延長。隨著細胞分裂次數(shù)的增加，端粒逐漸縮短，當端?？s短到一定程度時，細胞就會觸發(fā)凋亡機制。這表明hTERT干擾對端粒酶活性的抑制作用是誘導肝癌HepG2細胞凋亡的重要機制之一。hTERT干擾通過線粒體途徑誘導細胞凋亡：通過WesternBlot檢測線粒體途徑相關(guān)蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)hTERT干擾后，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達顯著降低，促凋亡蛋白Bax的表達明顯升高，Bax/Bcl-2比值顯著增大，從而打破了細胞內(nèi)的凋亡平衡，使細胞更容易受到凋亡信號的誘導。同時，caspase-9的活化亞基表達增加，表明hTERT干擾導致線粒體膜電位下降，線粒體通透性改變，細胞色素C從線粒體釋放到細胞質(zhì)中，激活了caspase-9依賴的凋亡信號通路，最終導致細胞凋亡。這揭示了hTERT干擾通過調(diào)節(jié)線粒體途徑相關(guān)蛋白的表達，誘導肝癌HepG2細胞凋亡的重要機制。hTERT干擾影響其他凋亡相關(guān)蛋白的表達：除了線粒體途徑相關(guān)蛋白，hTERT干擾還對XIAP和Hsp60等其他凋亡相關(guān)蛋白的表達和功能產(chǎn)生影響。XIAP表達水平顯著降低，削弱了其對caspase的抑制作用，使得caspase-3、caspase-9等能夠被正常激活，進而促進細胞凋亡的發(fā)生。Hsp60的表達和定位發(fā)生明顯變化，線粒體中的Hsp60表達量顯著減少，同時胞漿中的Hsp60表達量明顯增加，可能激活細胞內(nèi)的某些凋亡信號通路，促進細胞凋亡。這些蛋白之間相互作用，共同參與細胞凋亡的調(diào)控過程，為肝癌的治療提供了更多潛在的靶點和治療策略。5.2研究的不足與展望盡管本研究取得了一系列有價值的成果，但仍存在一些不足之處。首先，本研究僅在體外細胞水平上進行了實驗，未開展動物體內(nèi)實驗進一步驗證hTERT干擾對肝癌細胞凋亡的影響及相關(guān)機制。細胞實驗雖然能夠初步揭示hTERT干擾誘導肝癌HepG2細胞凋亡的作用機制，但與體內(nèi)復雜的生理環(huán)境存在一定差異。在動物體內(nèi)，腫瘤細胞與周圍組織、免疫系統(tǒng)等相互作用，可能會影響hTERT干擾的效果及細胞凋亡的發(fā)生發(fā)展過程。例如，動物體內(nèi)的免疫細胞可能會對受到hTERT干擾的肝癌細胞產(chǎn)生免疫監(jiān)視和殺傷作用，從而影響腫瘤的生長和凋亡情況。因此，后續(xù)研究應建立肝癌動物模型，如裸鼠皮下移植瘤模型或原位肝癌模型，將hTERT干擾載體通過合適的方式導入動物體內(nèi)，觀察腫瘤的生長情況、細胞凋亡水平以及相關(guān)蛋白和基因的表達變化，進一步驗證和完善本研究的結(jié)果。其次，本研究主要探討了hTERT干擾對肝癌HepG2細胞凋亡的影響及其相關(guān)機制，但肝癌是一種高度異質(zhì)性的腫瘤，不同患者的肝癌細胞可能存在不同的分子特征和生物學行為。HepG2細胞系雖然是常用的肝癌細胞模型，但不能完全代表所有類型的肝癌細胞。因此，未來研究應擴大細胞系的研究范圍，選取多種不同來源、具有不同生物學特性的肝癌細胞系，如SMMC-7721、Huh-7等，進行hTERT干擾實驗，比較不同細胞系對hTERT干擾的反應差異，進一步明確hTERT干擾在不同類型肝癌細胞中的作用機制和效果，為臨床治療提供更全面的理論依據(jù)。此外，本研究雖然揭示了hTERT干擾通過線粒體途徑以及影響其他凋亡相關(guān)蛋白的表達來誘導肝癌HepG2細胞凋亡，但細胞凋亡是一個復雜的生物學過程，涉及多個信號通路和分子機制的相互作用。在hTERT干擾誘導細胞凋亡的過程中，可能還存在其他尚未被發(fā)現(xiàn)的信號通路和分子參與其中。例如，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑、死亡受體途徑等也在細胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，未來研究可進一步深入探討hTERT干擾與這些凋亡相關(guān)信號通路之間的關(guān)系，全面揭示hTERT干擾誘導肝癌細胞凋亡的分子網(wǎng)絡，為開發(fā)更有效的肝癌治療策略提供更多的靶點和思路。展望未來，基于hTERT干擾的肝癌治療研究具有廣闊的前景。一方面，隨著基因治療技術(shù)的不斷發(fā)展，如RNA干擾技術(shù)、CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)等的日益成熟，有望開發(fā)出更高效、特異性更強的hTERT干擾載體，實現(xiàn)對肝癌細胞中hTERT基因的精準靶向調(diào)控，提高治療效果，減少對正常細胞的損傷。例如，利用納米技術(shù)將hTERT干擾載體包裹在納米顆粒中，通過修飾納米顆粒表面的配體，使其能夠特異性地識別并結(jié)合肝癌細胞表面的標志物，實現(xiàn)hTERT干擾載體在肝癌細胞中的高效遞送和靶向作用。另一方面，聯(lián)合治療策略可能是未來肝癌治療的發(fā)展方向。將hTERT干擾與傳統(tǒng)的化療、放療、免疫治療等方法相結(jié)合，發(fā)揮不同治療手段的優(yōu)勢，協(xié)同作用，提高肝癌的治療效果。例如，hTERT干擾可以增強肝癌細胞對化療藥物的敏感性，使化療藥物能夠更有效地殺傷腫瘤細胞；同時，hTERT干擾還可能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強機體的抗腫瘤免疫反應，與免疫治療聯(lián)合使用，進一步提高免疫治療的效果。此外，深入研究hTERT干擾誘導肝癌細胞凋亡的分子機制，有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點和生物標志物，為肝癌的早期診斷、預后評估和個性化治療提供更有力的支持。例如，通過篩選hTERT干擾過程中差異表達的關(guān)鍵基因和蛋白，開發(fā)新的肝癌診斷標志物，實現(xiàn)肝癌的早期精準診斷；根據(jù)患者腫瘤細胞中hTERT及相關(guān)凋亡蛋白的表達情況，制定個性化的治療方案，提高治療的針對性和有效性?？傊?，未來基于hTERT干擾的肝癌治療研究需要多學科的交叉融合，不斷探索創(chuàng)新，為肝癌患者帶來新的希望。六、參考文獻[1]時昌文，趙霞，李杰，曹莉莉，孫京杰。丙戊酸鈉誘導肝癌細胞HepG2凋亡及其機制探討[J].山東大學學報(醫(yī)學版),2007(12):1102-1105.[2]杜海磊，楊衛(wèi)平，陳聆，施敏敏，陳皓，陳擁軍，嚴佶祺，李勤裕，匡潔，邱偉華。自噬的特異性抑制對肝癌細胞凋亡的調(diào)控及其相關(guān)機制[J].外科理論與實踐，2013,18(04):346-350.[3]郭麗萍，房殿春，張汝鋼，羅元輝。細胞色素C依賴的線粒體途徑在hTERT干擾促進肝癌HepG2細胞凋亡中的作用[J].中華醫(yī)學雜志，2006(44):3130-3133.[4]胡云，翟凌.hTERT基因反義核酸誘導羅母巢癌細胞凋亡的研究[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2006(07):8-9+24.[5]王頡，劉娟，趙峻，王建六。干擾hTERT增強光動力療法誘導宮頸癌細胞凋亡的體外實驗[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2022,31(02):106-109.[6]杜麗華，郭立霞，李再昌，任建琳，馬勝林。慢病毒載體介導hTERT基因?qū)Ω伟┘毎闔epG2的轉(zhuǎn)染及表達[J].重慶醫(yī)科大學學報，2012,37(01):52-55.[7]李得明.hTERT和肝細胞癌[J].中國當代醫(yī)藥，2011,18(30):147-149.[8]林美英，呂巍，郭小蘭。慢病毒載體介導hTERT基因在小鼠尾肝中的表達[J].中國生物制品學雜志，2018,31(01):74-76+80.[2]杜海磊，楊衛(wèi)平，陳聆，施敏敏，陳皓，陳擁軍，嚴佶祺，李勤裕，匡潔，邱偉華。自噬的特異性抑制對肝癌細胞凋亡的調(diào)控及其相關(guān)機制[J].外科理論與實踐，2013,18(04):346-350.[3]郭麗萍，房殿春，張汝鋼，羅元輝。細胞色素C依賴的線粒體途徑在hTERT干擾促進肝癌HepG2細胞凋亡中的作用[J].中華醫(yī)學雜志，2006(44):3130-3133.[4]胡云，翟凌.hTERT基因反義核酸誘導羅母巢癌細胞凋亡的研究[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2006(07):8-9+24.