第51課時(shí)基因工程的基本工具和操作程序課標(biāo)要求1.闡明DNA重組技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要利用限制性?xún)?nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因的檢測(cè)與鑒定等步驟。考情分析1.重組DNA技術(shù)的基本工具2024·山東卷，5；2024·江西卷，12；2023·新課標(biāo)卷，62.基因工程的基本操作程序2024·重慶卷，19；2024·湖南卷，21；2024·甘肅卷，24；2024·安徽卷，20；2024·河北卷，22；2024·山東卷，25；2024·全國(guó)甲卷，38；2024·新課標(biāo)卷，35；2024·黑吉遼卷，25；2023·全國(guó)乙卷，38；2023·全國(guó)甲卷，38；2023·湖北卷，4；2023·廣東卷，20命題點(diǎn)一重組DNA技術(shù)的基本工具1.基因工程的概念[認(rèn)知覺(jué)醒]基因工程是指按照人們的愿望，通過(guò)轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類(lèi)型和生物產(chǎn)品。下列關(guān)于基因工程的敘述，錯(cuò)誤的有________。①基因工程的原理是基因突變②從操作層面看，基因工程是在細(xì)胞水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的③基因工程能克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，定向改造生物的遺傳性狀④基因工程是在生物化學(xué)、分子生物學(xué)和微生物學(xué)等學(xué)科的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的2.基因工程的工具[認(rèn)知覺(jué)醒]EcoRⅠ限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)為5′－G↓AATTC－3′，SmaⅠ限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)為5′－CCC↓GGG－3′。下列關(guān)于限制酶(限制性?xún)?nèi)切核酸酶)的敘述，正確的是________。①限制酶只存在于原核生物中②限制酶能識(shí)別DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開(kāi)③EcoRⅠ限制酶切割DNA分子后形成平末端④SmaⅠ限制酶切割DNA分子后形成黏性末端⑤EcoRⅠ限制酶是從大腸桿菌R型菌株中分離出來(lái)的第一種限制酶1967年，世界上幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了一種能夠?qū)蓚€(gè)DNA片段連接起來(lái)的酶，稱(chēng)之為DNA連接酶。下列關(guān)于DNA連接酶的敘述，錯(cuò)誤的有________。①DNA連接酶催化磷酸二酯鍵的斷裂②T4DNA連接酶只能將具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段連接起來(lái)，不能連接具有平末端的DNA片段③E.coliDNA連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端④T4DNA連接酶連接具有平末端的DNA片段的效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于E.coliDNA連接酶⑤DNA連接酶與DNA聚合酶是同一種酶，作用相同思維升華(1)DNA連接酶連接的是兩個(gè)DNA片段，而DNA聚合酶是把單個(gè)的脫氧核苷酸連接到已有的DNA片段上。(2)DNA聚合酶起作用時(shí)需要以一條DNA鏈為模板，而DNA連接酶不需要模板?；蚬こ讨械妮d體，能攜帶外源DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，被稱(chēng)為“分子運(yùn)輸車(chē)”。(1)基因工程中通常是利用________作為載體，將基因送入細(xì)胞。除此以外，常用的載體還有________________________等。(2)作為基因工程的載體，應(yīng)滿足哪些主要條件？____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________題型基因工程的兩大工具酶(科學(xué)思維)[例1](2023·新課標(biāo)卷，6)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn))和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是()A.質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B.質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C.質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D.質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接1.根據(jù)限制酶切割位點(diǎn)的位置確定限制酶的種類(lèi)(1)應(yīng)選擇切割位點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。(2)不能選擇切割位點(diǎn)位于目的基因和標(biāo)記基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲、乙不能選擇SmaⅠ。(3)為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化及隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切割位點(diǎn))。2.根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類(lèi)3.根據(jù)Ti質(zhì)粒的T－DNA片段選擇限制酶圖中甲、乙、丁Ti質(zhì)粒均不宜選取，而丙Ti質(zhì)粒宜選取(切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下：題型載體的作用及特點(diǎn)(科學(xué)思維)[例2](不定項(xiàng))(2025·山東青島模擬)下列有關(guān)基因工程中載體的說(shuō)法，正確的是()A.在進(jìn)行基因工程操作中，被用作載體的質(zhì)粒都是天然質(zhì)粒B.所有的質(zhì)粒都可以作為基因工程中的載體C.質(zhì)粒是一種獨(dú)立于細(xì)菌染色體外的環(huán)狀DNA分子D.作為載體的質(zhì)粒DNA分子上應(yīng)有對(duì)重組DNA進(jìn)行鑒定和選擇的標(biāo)記基因[例3](2025·陜西漢中模擬)質(zhì)粒是基因工程中常用的一種載體。下列關(guān)于質(zhì)粒的說(shuō)法，錯(cuò)誤的是()A.質(zhì)粒中的嘌呤堿基數(shù)和嘧啶堿基數(shù)是相等的B.一些質(zhì)?？梢哉系侥康募?xì)胞的染色體上，隨受體DNA同步復(fù)制C.可以利用質(zhì)粒上的特殊標(biāo)記基因?qū)δ康幕蜻M(jìn)行篩選D.質(zhì)粒至少應(yīng)有三個(gè)限制酶識(shí)別切割位點(diǎn)，便于目的基因插入命題點(diǎn)二基因工程的基本操作程序1.目的基因的篩選與獲取[認(rèn)知覺(jué)醒]利用PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增目的基因是基因工程中獲取目的基因的重要方法之一，其每個(gè)循環(huán)的過(guò)程如下圖所示。(1)PCR技術(shù)的原理是______________________________________________。(2)變性時(shí)，需要將溫度升高到________℃以上，目的是破壞模板DNA分子之間的________，使模板雙鏈DNA解聚成________。(3)復(fù)性時(shí)，溫度下降到________℃左右，目的是讓____________通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。(4)延伸時(shí)，需要將溫度上升到________℃左右，溶液中的4種脫氧核苷酸在____________________酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。[深度思考](1)在PCR過(guò)程中實(shí)際加入的原料為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，其有何作用？_________________________________________________________________________________________________________________(2)為擴(kuò)增目的基因，應(yīng)選擇下圖所示引物中的________________________。(3)設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理(如圖)，請(qǐng)分別說(shuō)明理由。①第1組：______________________________________________________；②第2組：_______________________________________________________。(4)若一個(gè)DNA分子在PCR中經(jīng)過(guò)n輪循環(huán)，理論上需要消耗多少個(gè)引物？第n輪循環(huán)需要消耗多少個(gè)引物數(shù)？___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________思維升華體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR技術(shù)的比較PCR技術(shù)體內(nèi)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原則堿基互補(bǔ)配對(duì)條件DNA母鏈作為模板、引物(體內(nèi)引物RNA、體外引物DNA)、4種脫氧核苷酸為原料延伸方向新鏈都是從5′端向3′端延伸不同點(diǎn)解旋方式90℃以上高溫解旋解旋酶催化場(chǎng)所PCR擴(kuò)增儀主要在細(xì)胞核延伸用酶耐高溫的DNA聚合酶DNA聚合酶溫度控制溫度、需要在不同溫度下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)溫和條件過(guò)程結(jié)果大量的DNA片段(或目的基因)形成完整的子代DNA2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心[認(rèn)知覺(jué)醒]構(gòu)建基因表達(dá)載體是基因工程的核心工作。如圖表示基因表達(dá)載體的一般構(gòu)成，請(qǐng)回答問(wèn)題：(1)構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的是什么？______________________________________________________________________________________________________________________________________(2)啟動(dòng)子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的________游，緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)，它是________________識(shí)別和結(jié)合的部位。(3)構(gòu)建因表達(dá)載體的過(guò)程分為酶切和連接兩個(gè)步驟。下圖為構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)所用的載體及目的基因所在DNA片段上限制酶的識(shí)別切割位點(diǎn)情況。①構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)________(“能”或“不能”)選擇EcoRⅠ，原因是___________________________________________________________________。②選擇SpeⅠ進(jìn)行單酶切構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，容易出現(xiàn)目的基因和載體的自身環(huán)化，以及目的基因的反向鏈接，導(dǎo)致目的基因轉(zhuǎn)錄時(shí)________出現(xiàn)錯(cuò)誤，無(wú)法表達(dá)正常的蛋白質(zhì)。③選擇BamHⅠ與BglⅡ進(jìn)行雙酶切構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，能否避免單酶切時(shí)出現(xiàn)的目的基因和載體的自身環(huán)化，以及目的基因的反向鏈接？為什么？_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________④選擇BamHⅠ與HindⅢ進(jìn)行雙酶切構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，能否避免單酶切時(shí)出現(xiàn)的目的基因和載體的自身環(huán)化，以及目的基因的反向鏈接？為什么？_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________思維升華關(guān)于同尾酶及切割連接不同種限制性?xún)?nèi)切核酸酶識(shí)別序列各不相同，但切割后能產(chǎn)生相同的黏性末端，則稱(chēng)為同尾酶。如BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、Sau3AⅠ、XhoⅡ?yàn)橐唤M同尾酶，它們的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)依次分別是5′－G↓GATCC－3′、5′－T↓GATCA－3′、5′－A↓GATCT－3′、5′－↓GATC－3′、5′－R↓GATCY－3′，它們切割DNA后都形成由GATC組成的黏性末端。由同尾酶酶切產(chǎn)生的DNA片段，能夠通過(guò)黏性末端的互補(bǔ)作用而彼此連接起來(lái)。一般情況下，同尾酶產(chǎn)生的黏性末端連接后不能再被原來(lái)的限制酶切割，這是因?yàn)橥裁府a(chǎn)生的黏性末端連接后原來(lái)的酶切位點(diǎn)將不復(fù)存在，故不能被原來(lái)的限制酶切割，但可以被識(shí)別序列短的限制酶切割，如被上述Sau3AⅠ識(shí)別并切割。3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞[認(rèn)知覺(jué)醒]將構(gòu)建好的基因表達(dá)載體導(dǎo)入不同受體細(xì)胞，往往采取不同的方法。(1)將基因表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，常常采用________________法或________________法。(2)將基因表達(dá)載體導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞，受體細(xì)胞通常是動(dòng)物________，一般采用____________法。(3)將基因表達(dá)載體導(dǎo)入原核細(xì)胞時(shí)，應(yīng)用最為廣泛的受體細(xì)胞是____________，一般先用________處理受體細(xì)胞，使其處于一種___________________________的生理狀態(tài)，然后再將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中。(1)農(nóng)桿菌特點(diǎn)①能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有侵染能力。②農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上；兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。(3)導(dǎo)入的目的基因，可能存在于細(xì)胞質(zhì)中，也可能整合到染色體DNA上。存在于染色體DNA上的目的基因有可能通過(guò)花粉傳播進(jìn)入雜草或其他作物中，造成“基因污染”。4.目的基因的檢測(cè)與鑒定[認(rèn)知覺(jué)醒]3目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，還需要進(jìn)行檢測(cè)與鑒定。(1)分子水平的檢測(cè)，通常借助________等技術(shù)，檢測(cè)受體染色體DNA上是否插入目的基因或目的基因是否________________；從轉(zhuǎn)基因生物體內(nèi)提取出相關(guān)蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行____________________，檢測(cè)目的基因是否翻譯出相應(yīng)的蛋白質(zhì)。(2)________________水平的鑒定，通過(guò)抗蟲(chóng)、抗病接種實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物是否賦予了相關(guān)的遺傳特性以及這種特性的程度。題型基因工程的基本步驟(科學(xué)思維)[例1](2023·湖北卷，4)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)，并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是()A.若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切，可通過(guò)DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否D.若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落[例2](2024·江蘇卷，23)為了高效純化超氧化物歧化酶(SOD)，科研人員將ELP50片段插入pET－SOD構(gòu)建重組質(zhì)粒pET－SOD－ELP50，以融合表達(dá)SOD－ELP50蛋白，過(guò)程如圖1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列為：限制酶a識(shí)別序列－(GTTCCTGGTGTTGGC)50－限制酶b識(shí)別序列，50為重復(fù)次數(shù)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：圖1(1)步驟①雙酶切時(shí)，需使用的限制酶a和限制酶b分別是________________________。(2)步驟②轉(zhuǎn)化時(shí)，科研人員常用________處理大腸桿菌，使細(xì)胞處于感受態(tài)，轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌采用含有________的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。用PCR技術(shù)篩選成功導(dǎo)入pET－SOD－ELP50的大腸桿菌，應(yīng)選用的一對(duì)引物是___________________________________________________________________。圖2(3)步驟③大腸桿菌中RNA聚合酶與____________結(jié)合，驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄，翻譯SOD－ELP50蛋白。已知蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的平均相對(duì)分子質(zhì)量約為0.11kDa，將表達(dá)的蛋白先進(jìn)行凝膠電泳，然后用SOD抗體進(jìn)行雜交，顯示的條帶應(yīng)是________(從圖2的“A～D”中選填)。(4)步驟④為探尋高效純化SOD－ELP50蛋白的方法，科研人員研究了溫度、NaCl對(duì)SOD－ELP50蛋白純化效果的影響，部分結(jié)果如圖3。圖3①20℃時(shí)，加入NaCl后實(shí)驗(yàn)結(jié)果是______________________________________________________________________________________________________。②100℃時(shí)，導(dǎo)致各組中所有蛋白都沉淀的原因是___________________________________________________________________________________________。③據(jù)圖分析，融合表達(dá)SOD－ELP50蛋白的優(yōu)點(diǎn)有_______________________________________________________________________________________。1.(2023·重慶卷，12)某小組通過(guò)PCR(假設(shè)引物長(zhǎng)度為8個(gè)堿基，短于實(shí)際長(zhǎng)度)獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進(jìn)行酶切(如下圖)，再用所得片段成功構(gòu)建了基因表達(dá)載體。下列敘述錯(cuò)誤的是()A.實(shí)驗(yàn)所用引物，其中一個(gè)序列為5′－TGCGCAGT－3′B.步驟①所用酶是SpeⅠ和CfoⅠC.用步驟①的酶對(duì)載體進(jìn)行酶切至少獲得了2個(gè)片段D.酶切片段和載體連接時(shí)可使用E.coliDNA連接酶或T4DNA連接酶2.(2024·重慶卷，19)大豆是重要的糧油作物，提高大豆產(chǎn)量是我國(guó)農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的重要任務(wù)。我國(guó)研究人員發(fā)現(xiàn)，基因S在大豆品種DN(種子較大)中的表達(dá)量高于品種TL(種子較小)，然后克隆了該基因(兩品種中基因S序列無(wú)差異)及其上游的啟動(dòng)子序列，并開(kāi)展相關(guān)研究。①表達(dá)載體限制酶識(shí)別位點(diǎn)(HindⅢ，SpeⅠ，EcoRⅠ，XbaⅠ)②啟動(dòng)子D＋基因S