ICS65.020.01CCSB05IDB13/T6103—2025本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由河北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本文件主要起草單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)、河北匯珍食用菌有限公司、唐山市農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)監(jiān)測(cè)站、河北省農(nóng)業(yè)特色產(chǎn)業(yè)技術(shù)指導(dǎo)總站本文件主要起草人:李守勉、田景花、龐立新、亢銳鋒、李國(guó)杰、李肖、王俊玲、李曉峰、趙清、張艷明、王民樂(lè)、賈智麟、張世青、李梅。本文件為首次發(fā)布。DB13/T6103—20251羊肚菌菌種出菇特性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了羊肚菌菌種出菇特性評(píng)價(jià)的術(shù)語(yǔ)和定義、抽樣、出菇特性評(píng)價(jià)、綜合評(píng)價(jià)等要求。本文件適用于羊肚菌菌種出菇特性的評(píng)價(jià)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T12728食用菌術(shù)語(yǔ)GB/T30989高通量基因測(cè)序技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T1284食用菌菌種中雜菌及害蟲(chóng)的檢驗(yàn)NY/T1846食用菌菌種檢驗(yàn)規(guī)程DB13/T5170日光溫室羊肚菌栽培技術(shù)規(guī)程3術(shù)語(yǔ)和定義GB/T12728界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1萌發(fā)時(shí)間germinationtime適宜環(huán)境條件下，接種塊在培養(yǎng)基上恢復(fù)生長(zhǎng)的時(shí)間。3.2定植率colonizationrate接種塊轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基上后，萌發(fā)的接種塊數(shù)量占總接種塊數(shù)量的百分比。4抽樣菌種抽樣應(yīng)符合NY/T1846的規(guī)定。5菌種出菇特性評(píng)價(jià)方法5.1感官評(píng)價(jià)應(yīng)符合NY/T1846的規(guī)定，感官評(píng)價(jià)指標(biāo)參見(jiàn)附錄C。5.2雜菌及害蟲(chóng)評(píng)價(jià)應(yīng)符合NY/T1284的規(guī)定。5.3菌種真實(shí)性評(píng)價(jià)5.3.1基因組DNA提取采用CTAB法提取菌種菌絲體基因組DNA，DNA濃度應(yīng)≥50ng/μL，A260/A280應(yīng)為1.8～2.0。提取方法參見(jiàn)附錄A。5.3.2PCR擴(kuò)增采用真菌通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序參見(jiàn)附錄B。2DB13/T6103—20255.3.3電泳檢測(cè)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄電泳條帶，黑色羊肚菌類群（包括六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、梯棱羊肚菌等）條帶大小應(yīng)為800bp，且無(wú)其他雜帶，將樣品進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序方法應(yīng)符合GB/T30989的規(guī)定。5.3.4數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blastn比對(duì)（/），分析測(cè)序菌株的分類地位。5.3.5系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建下載已報(bào)道的羊肚菌ITS序列，用Bioedit、SequenceMatrix軟件將序列對(duì)比拼接，利用RAxML軟件進(jìn)行最大似然法(maximumlikelihood,ML)構(gòu)建羊肚菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，明確測(cè)序菌株的分類地位。羊肚菌生產(chǎn)用菌株分類地位應(yīng)為六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、梯棱羊肚菌等。5.4交配型基因檢測(cè)采用CTAB法提取羊肚菌菌種菌絲體基因組DNA，每個(gè)樣品應(yīng)設(shè)置三個(gè)重復(fù)，采用黑色羊肚菌類群交配型基因特異性引物MAT1-1、MAT1-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列、PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序參見(jiàn)附錄B。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄電泳條帶，MAT1-1和MAT1-2分別對(duì)應(yīng)的條帶大小分別為800bp和500bp，生產(chǎn)用菌種應(yīng)同時(shí)含有MAT1-1和MAT1-2兩種交配型基因。5.5菌種活力評(píng)價(jià)5.5.1平板繼代培養(yǎng)在培養(yǎng)皿PDA培養(yǎng)基中央接種抽檢菌種，接種塊約為（直徑）6mm×（厚）1mm～2mm，置于18℃避光培養(yǎng)2d～3d，當(dāng)菌絲生長(zhǎng)至距離培養(yǎng)皿邊緣約0.5cm時(shí)，用打孔器取菌落尖端直徑約6mm的菌絲圓片，每個(gè)樣品5個(gè)重復(fù)，轉(zhuǎn)接至新的PDA平板培養(yǎng)基中央繼代培養(yǎng)。5.5.2菌種萌發(fā)評(píng)價(jià)菌種塊應(yīng)在繼代培養(yǎng)6h～10h內(nèi)萌發(fā)。5.5.3定植率測(cè)定每個(gè)測(cè)試菌種數(shù)量為m，接種3d菌絲萌發(fā)且定植的數(shù)量為n，定植率X計(jì)算公式如下：………X——定植率，%n——定植的總瓶（袋）數(shù)量m——接種的總瓶（袋）數(shù)量，一般接種30瓶（袋）5.5.4菌絲生長(zhǎng)速率在繼代培養(yǎng)1d、2d、3d時(shí)，采用十字交叉法分別測(cè)量菌落直徑，菌絲生長(zhǎng)距離為S，生長(zhǎng)天數(shù)為D，菌絲平均生長(zhǎng)速率L計(jì)算公式如下：…………………L——母種菌絲生長(zhǎng)速率，mm/dS——菌絲生長(zhǎng)距離，mmDB13/T6103—20253D——長(zhǎng)天數(shù)為D，d5.5.5菌絲生長(zhǎng)勢(shì)評(píng)價(jià)在繼代培養(yǎng)5d～6d時(shí)，觀察菌落邊緣整齊度，菌絲濃密程度，尖端菌絲分支情況。5.5.6菌絲形態(tài)鏡檢繼代培養(yǎng)2d～3d后，采用400倍光學(xué)顯微鏡觀察菌絲分支角度，主干菌絲與二級(jí)分支菌絲夾角；采用DAPI（pH=7.5）染色，在100倍熒光顯微鏡下觀察尖端菌絲單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核數(shù)量。菌絲5.5.7菌核在PDA培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)7d～10d，觀察菌核發(fā)生情況，菌落表面應(yīng)產(chǎn)生白色顆粒或片狀菌核。5.5.8菌落顏色繼代培養(yǎng)10d～15d，觀察菌落顏色。5.6出菇評(píng)價(jià)5.6.1場(chǎng)地要求選擇溫度、濕度、光照、通風(fēng)等條件可控的出菇房、智能出菇箱或人工氣候培養(yǎng)箱等。5.6.2栽培方法采用塑料筐、塑料袋或床架覆土方式進(jìn)行出菇試驗(yàn)，每個(gè)樣品隨機(jī)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)小區(qū)栽培面積應(yīng)不少于3m2。栽培管理參照DB13/T5170執(zhí)行。5.6.3菌種萌發(fā)及分生孢子形成播種24h觀察菌種萌發(fā)情況，播種5d～10d觀察分生孢子形成情況。5.6.4外源營(yíng)養(yǎng)袋擺放外源營(yíng)養(yǎng)袋20d～25d，觀察營(yíng)養(yǎng)袋內(nèi)菌絲生長(zhǎng)情況。5.6.5羊肚菌原基形成澆催菇水后7d～10d，采用手機(jī)攝像頭放大5～10倍觀察原基形成情況。6綜合性評(píng)價(jià)羊肚菌菌種出菇特性評(píng)價(jià)按照