1細(xì)胞凍存袋本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了細(xì)胞凍存袋的性能要求。細(xì)胞凍存袋經(jīng)滅菌后，用于細(xì)胞治療產(chǎn)品的凍存和輸注。本標(biāo)準(zhǔn)適用于以乙烯-乙酸乙烯酯共聚物（EVA）膜材為主體材料，經(jīng)熱合工藝制得，公稱容量不大于500mL的單腔包裝袋系統(tǒng)，包括軟袋及其附屬的輸注插口和轉(zhuǎn)移管。本標(biāo)準(zhǔn)也適用于由數(shù)個上述單腔包裝袋組合成的多連包裝系統(tǒng)。本標(biāo)準(zhǔn)不適用于多腔包裝袋系統(tǒng)，以及公稱容量大于500mL的單腔包裝袋系統(tǒng)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件?！吨腥A人民共和國藥典》四部GB/T2828.1計數(shù)抽樣檢驗程序第1部分：按接收質(zhì)量限(AQL)檢索的逐批檢驗抽樣計劃GB8369.1-2019一次性使用輸血器第1部分：重力輸血式GB/T16886.4醫(yī)療器械生物學(xué)評價第4部分：與血液相互作用試驗選擇GB/T16886.5醫(yī)療器械生物學(xué)評價第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗GB/T16886.11醫(yī)療器械生物學(xué)評價第11部分：全身毒性試驗3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1細(xì)胞治療產(chǎn)品celltherapyproduct是指應(yīng)用人自體或異體來源的細(xì)胞經(jīng)體外操作后輸入（或植入）人體，用于疾病治療的產(chǎn)品。體外操作包括但不限于分離、純化、培養(yǎng)、擴(kuò)增、活化、細(xì)胞（系）的建立、誘導(dǎo)、遺傳操作、凍存復(fù)蘇等。3.2細(xì)胞凍存袋bagforcellcryopreservation帶輸注插口以及轉(zhuǎn)移管的袋式塑料包裝系統(tǒng)，滅菌后可用于盛納需凍存的細(xì)胞治療產(chǎn)品（3.1）。3.3膜材sheeting用于生產(chǎn)軟袋袋體的薄片狀材料，通常以卷膜形式供應(yīng)。3.4空袋emptybag具有適當(dāng)標(biāo)識，待滅菌的細(xì)胞凍存袋（3.2），可用于試驗。3.5定型樣品typesample經(jīng)過評估滿足使用要求的確定配方及穩(wěn)定工藝下生產(chǎn)的產(chǎn)品。批量生產(chǎn)產(chǎn)品的配方、工藝及用途與其一致。4基本結(jié)構(gòu)圖1給出了細(xì)胞凍存袋基本結(jié)構(gòu)的示例。只要能達(dá)到相同的效果，可以采用其他結(jié)構(gòu)形式。2說明：1―轉(zhuǎn)移管2―有打開痕跡的保護(hù)裝置3―軟袋熱合部位4―懸掛孔眼5―軟袋6―輸注插口圖1細(xì)胞凍存袋示例5性能要求5.1物理要求物理測試方法見附錄A。5.1.1通用要求應(yīng)符合表1的相關(guān)要求。表1通用要求5.1.2凍存適用性要求照A.6處理后進(jìn)行試驗時，應(yīng)符合表2的相關(guān)要求。表2凍存適用性要求3A.6.2漏A.6.3A.6.4A.6.5A.6.65.2化學(xué)要求5.2.1材料要求軟袋應(yīng)符合表3的相關(guān)要求。表3材料要求）；5.2.2浸提液要求照B.6制備的浸提液進(jìn)行試驗時，軟袋應(yīng)符合表4的相關(guān)要求。表4浸提液要求5.3生物學(xué)要求經(jīng)滅菌工藝處理的細(xì)胞凍存袋應(yīng)符合表5的要求。表5生物學(xué)要求注：細(xì)胞毒性合格，一般不再進(jìn)行急性全身毒性檢查；如不合格，應(yīng)進(jìn)行急性全身6檢驗規(guī)則46.1抽樣方法按GB/T2828.1隨機抽樣，逐批檢驗抽樣計劃，在每批中抽取足夠檢驗用的樣品。6.2抽樣方案檢驗項目、檢驗水平及接收質(zhì)量限（AQL）見表6。表6檢驗項目、檢驗水平及接收質(zhì)量限6.3出廠檢驗出廠檢驗項目為5.1.1通用要求的全部項目，5.2.2浸提液要求的全部項目，以及5.3生物學(xué)要求中的無菌、細(xì)菌內(nèi)毒素項目。對每批產(chǎn)品進(jìn)行出廠檢驗。6.4型式檢驗型式檢驗為全項檢驗，包括第5章規(guī)定的全部檢驗項目。有以下情況之一時，應(yīng)進(jìn)行型式檢驗。1)新產(chǎn)品試制定型鑒定時；2)原材料及工藝有較大改變，可能影響產(chǎn)品性能時；3)產(chǎn)品停產(chǎn)半年以上，恢復(fù)生產(chǎn)時；4)出廠檢驗結(jié)果與上次型式檢驗（歷史檢驗數(shù)據(jù)）有較大差異時；5)國家主管部門提出要求時；6)正常生產(chǎn)時，每年進(jìn)行一次。5（規(guī)范性）物理試驗方法A.1外觀檢查取空袋適量，在自然光線明亮處，正視目測袋體及熱封部位、管路。A.2透明度檢查取空袋適量，加入標(biāo)示容量的純化水后，另取空細(xì)胞凍存袋一個，裝入4號濁度標(biāo)準(zhǔn)液（《中國藥典》四部通則0902），作為對照袋。在黑色背景下，用白熾燈以20001x~30001x照射（避免照射試驗人員的眼睛），目測觀察。A.3不溶性微粒測定取空袋適量，加入標(biāo)示容量的微粒檢查用水后密封，照藥包材不溶性微粒測定法（《中國藥典》四部通則4206第一法（2）注射液用塑料容器）測定。A.4可見異物測定取空袋適量，加入標(biāo)示容量的純化水后密封，照可見異物檢查法（《中國藥典》四部通則0904第一法）檢查。A.5熱合強度測定取空袋適量，照藥包材熱合強度測定法（《中國藥典》四部通則4008袋）測定。A.6凍存適用性試驗取空袋適量，加入標(biāo)示容量的純化水后密封，于（4±2）℃放置2h后，完全浸沒于液氮中貯存24h，隨后浸入（37±2）℃的水浴中60min，取出恢復(fù)至室溫，作為供試品，在（23±5）℃條件下進(jìn)行以下試驗。注：可按照規(guī)定的預(yù)處理、凍存及復(fù)融條件進(jìn)行操作，并進(jìn)行以下試驗。A.6.1抗泄露試驗取供試品適量，放在兩平板之間進(jìn)行擠壓，使內(nèi)部壓力升至高于大氣壓強50kPa，持續(xù)10min，目測觀察。A.6.2抗跌落試驗取供試品適量平放，從1.00m高度自由跌落于硬質(zhì)剛性的光滑表面，目測觀察。A.6.3穿刺器保持性試驗取供試品適量，用符合GB8369.1-2019的穿刺器插入輸注插口后，施加15N的軸向拉力，持續(xù)15s，目測觀察穿刺器及穿刺部位。A.6.4管路連接試驗取供試品適量，對輸注插口、轉(zhuǎn)移管分別施加20N軸向拉力，持續(xù)15s，目測觀察連接部位。A.6.5懸掛試驗取供試品適量，沿軸向施加20N拉力，持續(xù)60min，目測觀察懸掛部位。A.6.6標(biāo)識試驗取供試品適量，目測觀察標(biāo)識部位。6（規(guī)范性）化學(xué)試驗方法B.1紅外光譜測定取樣品，照包裝材料紅外光譜測定法（《中國藥典》四部通則4002第二法）測定，與定型樣品紅外光譜圖進(jìn)行比較。B.2熾灼殘渣測定取樣品約5.0g，剪碎，精密稱定，置于已熾灼至恒重的坩堝中，在（100～105）℃干燥1小時后，轉(zhuǎn)移至（550±25）℃下熾灼至恒重，移置干燥器中，放冷，精密稱定，由殘渣的重量和取樣量計算百分含量。B.3酚類抗氧劑的測定根據(jù)樣品材料實際使用的酚類抗氧劑，照高效液相色譜法（《中國藥典》四部通則0512）測定。B.3.1試劑B.3.1.1二氯甲烷（色譜純B.3.1.2丙酮（色譜純B.3.1.3甲苯（色譜純B.3.1.4甲醇（色譜純B.3.1.5乙腈（色譜純B.3.1.6異丙醇（色譜純B.3.1.7四氫呋喃（色譜純B.3.1.8純化水（《中國藥典》四部通則0261B.3.1.9稀釋液：二氯甲烷（B.3.1.1）與丙酮（B.3.1.2）體積比為20:80的混合溶液；B.3.1.10洗滌液：甲苯（B.3.1.3）與甲醇（B.3.1.4）體積比為40:60的混合溶液。B.3.2標(biāo)準(zhǔn)品2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（抗氧劑BHT）、四[β-(3,5-二叔丁基-4-羥基苯基)丙酸]季戊四醇酯（抗氧劑1010）、1,3,5-三甲基-2,4,6-三(3,5-二叔丁基-4-羥基芐基)苯（抗氧劑330）、β-(3,5-二叔丁基-4-羥基苯基)丙酸十八碳醇酯（抗氧劑1076）與三(2,4-二叔丁基苯基)亞磷酸酯（抗氧劑168）。B.3.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制取待測酚類抗氧劑標(biāo)準(zhǔn)品各適量，加稀釋劑溶解并稀釋制成每1mL中含抗氧劑BHT0.1mg/mL，抗氧劑1010、抗氧劑330、抗氧劑1076與抗氧劑168各0.16mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。B.3.4供試液的制備取樣品約2g，剪碎，精密稱定，置于250mL硼硅玻璃錐形瓶中，加入80mL甲苯（B.3.1.3），持續(xù)攪拌狀態(tài)下回流1.5h；冷卻至約60℃,并在持續(xù)攪拌狀態(tài)下，加入120mL甲醇（B.3.1.4）；用玻璃垂熔漏斗過濾溶液，用25mL洗滌液（B.3.1.10）洗滌燒瓶和漏斗，過濾后合并，用洗滌液（B.3.1.10）定容至250mL，作為提取液。取提取液50mL，45℃真空減壓至近干，用稀釋液（B.3.1.9）溶解殘渣并定容至5mL，作為供試液；同法制備空白液。B.3.5色譜條件B.3.5.1色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，柱長：5cm，內(nèi)徑：2.1mm，粒徑：0.25μm；7B.3.5.2柱溫：40℃;B.3.5.3進(jìn)樣量：3μL；B.3.5.4流動相：水（B.3.1.8）、乙腈（B.3.1.5）和異丙醇（B.3.1.6）的三元洗脫體系；梯度洗脫程序表B.1梯度洗脫設(shè)置B.3.6供試液的測定將空白液、供試液、標(biāo)準(zhǔn)溶液注入液相色譜儀中，將供試液中待測酚類抗氧劑各組分峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液中相應(yīng)酚類抗氧劑峰面積進(jìn)行比較。B.3.7系統(tǒng)適用性B.3.7.1分離度抗氧劑1010與抗氧劑330的分離度不低于2.0，抗氧劑1076與抗氧劑168的分離度不低于2.0。B.3.7.2理論塔板數(shù)理論板數(shù)按抗氧劑BHT峰計算不低于2500。B.4硬脂酸鹽與酰胺的測定照薄層色譜法（《中國藥典》四部通則0502）測定。取酚類抗氧劑項下提取溶液100mL，45℃真空減壓至近干，用2mL經(jīng)酸化的二氯甲烷溶液（100mL二氯甲烷中加入10mL鹽酸，振搖后靜置，取下層溶液待用）溶解殘渣，作為供試液。另取硬脂酸適量，用二氯甲烷制成每1mL中含硬脂酸2.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》四部通則0502）試驗，吸取上述兩種溶液各10μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以無水乙醇-三甲基戊烷（25:75）混合溶液為展開劑，展開距離大于10cm，取出，晾干，噴以2,6-二氯靛酚鈉無水乙醇溶液（2g/L），在120°C加熱數(shù)分鐘至顯色，比較供試液所顯硬脂酸斑點顏色與標(biāo)準(zhǔn)溶液所顯的斑點。另取油酸酰胺和芥酸酰胺各適量，分別用二氯甲烷制成每1mL中含量分別為0.8mg/mL的油酸酰胺和芥酸酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取供試液、油酸酰胺和芥酸酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液各10μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以正己烷為展開劑，展開距離大于13cm，取出，晾干，再以甲醇-二氯甲烷（5:95）混合溶液為展開劑，展開距離大于10cm，取出，晾干，噴以磷鉬酸無水乙醇溶液（40g/L在120°C加熱數(shù)分鐘至顯色，比較供試液所顯油酸酰胺和芥酸酰胺斑點顏色與標(biāo)準(zhǔn)溶液所顯的斑點。B.5乙酸乙烯酯的測定取樣品0.5g（可根據(jù)乙酸乙烯酯含量，在0.25~1.0g范圍內(nèi)調(diào)整）至300mL錐形瓶中，加入40mL二甲苯，磁力攪拌下回流4h后，放冷并持續(xù)攪拌至沉淀出現(xiàn)，緩慢加入25.0mL氫氧化鉀乙醇溶液（將6.6g氫氧化鉀溶于50mL純化水中，用無水乙醇稀釋至1000mL）。再次磁力攪拌回流3h后，持續(xù)攪拌下冷卻，用50mL純化水洗冷凝管，燒瓶中加入0.05M硫酸溶液30mL。將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至400mL燒杯，用2份50mL硫酸鈉溶液（200g/L）和3份20mL純化水沖洗燒瓶，洗液合并至燒杯。照電位滴定法與永停滴定法（《中國藥典》四部通則0701用0.1M氫氧化鈉滴定液滴定至電位終點。同法空白測試。以1mL硫酸（0.05M）相當(dāng)于8.609mg乙酸乙烯酯，計算乙酸乙烯酯含量。8B.6浸提液的測定取樣品適量，照溶出物測定法（《中國藥典》四部通則4204）表1方法一，采用（100±2）℃浸提2h條件，制備供試液和空白液。B.6.1澄清度取供試液，照澄清度檢查法（《中國藥典》四部通則0902）檢查；如顯渾濁，與2號濁度標(biāo)準(zhǔn)液（《中國藥典》四部通則0902）比較。B.6.2顏色取供試液，照溶液顏色檢查法（《中國藥典》四部通則0901）檢查。B.6.3酸堿度取供試液100mL，加入BRP指示液（溴麝香草酚藍(lán)為1.0mg/mL，甲基紅為0.2mg/mL，酚酞為2.0mg/mL的乙醇溶液，過濾后使用）0.15mL，記錄指示劑變?yōu)樗{(lán)色所需NaOH滴定液（0.01mol/L）的體積。另取100mL供試液，加入甲基橙指示液0.2mL，記錄指示劑從黃色開始變?yōu)槌壬鐷Cl滴定液（0.01mol/L）的體積。B.6.4紫外吸光度取供試液適量，以空白液為對照。照紫外-可見分光光度法（《中國藥典》四部通則0401）測定，在波長220～340nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。B.6.5不揮發(fā)物取供試液與空白液各50mL，分別置于已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，在105℃干燥至恒重，計算兩者之差。B.6.6易氧化物精密量取供試液20mL，精密加入0.002mol/L高錳酸鉀溶液20mL與稀硫酸1mL，煮沸3min，迅速冷卻至室溫，加碘化鉀0.1g，在暗處放置5min，用硫代硫酸鈉滴定液（0.01mol/L）滴定至淺棕色，再加入5滴淀粉指示液后滴定至無色。另取空白液同法操作。按下式計算，供試液與空白液消耗硫代硫酸鈉滴定液（0.01mol/L）之差。式中：V——二者消耗硫代硫酸鈉滴定液（0.01mol/L）的體積之差，mL；Vs——供試液消耗硫代硫酸鈉滴定液的體積，mL；Vo——空白液消耗硫代硫酸鈉滴定液的體積，mL；Cs——硫代硫酸鈉滴定液的實際濃度，mol/L；0.01——標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的硫代硫酸鈉滴定液的濃度，mol/L。B.6.7總有機碳取供試液與空白液各適量，照制藥用水中總有機碳測定法（《中國藥典》四部通則0682