miR-455調(diào)控鈣網(wǎng)蛋白途徑對(duì)不同時(shí)長(zhǎng)壓力負(fù)荷下心肌肥厚的影響探究一、引言1.1研究背景與意義心血管疾病嚴(yán)重威脅人類健康，是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因之一。心肌肥厚作為一種常見的心臟病理改變，是心臟對(duì)各種病理性刺激的適應(yīng)性反應(yīng)，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大、蛋白質(zhì)合成增加以及“胚胎期”基因的重新表達(dá)。在多種心血管疾病中，如高血壓、主動(dòng)脈瓣狹窄、心肌梗死等，心肌肥厚常常作為一個(gè)重要的病理過(guò)程出現(xiàn)。起初，心肌肥厚是心臟為維持正常心功能的一種代償機(jī)制，可在一定程度上增強(qiáng)心臟的收縮力，維持心輸出量。然而，持續(xù)性的心肌肥厚會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變，心肌間質(zhì)纖維化，心臟舒張和收縮功能障礙，最終發(fā)展為擴(kuò)張性心肌病、心力衰竭甚至猝死，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)后。研究表明，心肌肥厚患者發(fā)生心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)是正常人的數(shù)倍，且其5年生存率顯著低于無(wú)心肌肥厚者。因此，深入探究心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找有效的干預(yù)靶點(diǎn)和治療策略，對(duì)于降低心血管疾病的死亡率和改善患者預(yù)后具有重要的臨床意義。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，微小RNA（microRNA，miRNA）在心血管疾病中的作用逐漸成為研究熱點(diǎn)。miRNA是一類長(zhǎng)約18-25個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小RNA，通過(guò)與靶mRNA的3'端非翻譯區(qū)（3'-UTR）核苷酸序列互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA的翻譯過(guò)程或促使其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控。miRNA參與了生物體的多種生理和病理過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝以及心血管系統(tǒng)的發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展等。在心肌肥厚的研究中，越來(lái)越多的證據(jù)表明miRNA發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。不同的miRNA在心肌肥厚過(guò)程中呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，有些miRNA表達(dá)上調(diào)，有些則表達(dá)下調(diào)，它們通過(guò)調(diào)控各自的靶基因，參與心肌肥厚相關(guān)的信號(hào)通路，影響心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和凋亡等生物學(xué)行為。例如，miR-133在體外過(guò)量表達(dá)時(shí)，可以抑制心肌肥厚的發(fā)生；miR-150具有抵抗壓力負(fù)荷造成心肌細(xì)胞肥大的心肌保護(hù)作用；miR-185可以靶向性地調(diào)節(jié)多個(gè)目標(biāo)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮抗心肌細(xì)胞肥大作用。這些研究提示miRNA可能成為心肌肥厚診斷和治療的新靶點(diǎn)，為心肌肥厚的防治提供了新的思路和方向。miR-455作為眾多miRNA中的一種，近年來(lái)在心血管疾病領(lǐng)域的研究逐漸受到關(guān)注。已有研究發(fā)現(xiàn)miR-455在壓力導(dǎo)致的心室肥厚中扮演著重要角色。鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中主要的Ca2?結(jié)合分子伴侶，具有調(diào)控細(xì)胞Ca2?穩(wěn)態(tài)、協(xié)助蛋白質(zhì)正確折疊和維持蛋白質(zhì)合成與修飾等作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、應(yīng)激、心血管炎癥反應(yīng)等多種生理和病理生理過(guò)程。CRT屬于心臟胚胎基因家族，在心臟發(fā)育及心肌肥大的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用，其編碼基因在胚胎期高表達(dá)，參與心臟發(fā)育，出生后表達(dá)下調(diào)，在成熟心臟中維持較低水平，但在心肌肥大等病理狀態(tài)下基因轉(zhuǎn)錄活化，蛋白水平升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-455與鈣網(wǎng)蛋白之間存在靶向調(diào)控關(guān)系，這為深入理解心肌肥厚的分子機(jī)制提供了新的線索。然而，目前關(guān)于miR-455通過(guò)調(diào)控鈣網(wǎng)蛋白途徑對(duì)心肌肥厚影響的研究還不夠深入和全面，尤其是在短期和長(zhǎng)期壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚模型中，miR-455的具體作用機(jī)制以及對(duì)心肌肥厚不同階段病理變化的影響尚不完全清楚。本研究旨在通過(guò)構(gòu)建短期和長(zhǎng)期壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚小鼠模型，深入探討miR-455通過(guò)調(diào)控鈣網(wǎng)蛋白途徑對(duì)心肌肥厚的影響及其潛在的分子機(jī)制。一方面，期望揭示miR-455在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的雙重作用，即短期壓力負(fù)荷下對(duì)心肌細(xì)胞肥大的促進(jìn)作用以及長(zhǎng)期壓力負(fù)荷下對(duì)心肌纖維化和心肌凋亡的抑制作用；另一方面，通過(guò)明確miR-455與鈣網(wǎng)蛋白之間的相互作用關(guān)系及其在心肌肥厚相關(guān)信號(hào)通路中的調(diào)控機(jī)制，為心肌肥厚的早期診斷和治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)，為開發(fā)針對(duì)心肌肥厚的新型治療策略奠定基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在心肌肥厚的研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了諸多重要成果，為深入理解這一病理過(guò)程奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，對(duì)于心肌肥厚分子機(jī)制的探究不斷深入，研究范圍涵蓋了信號(hào)通路、基因調(diào)控以及細(xì)胞因子等多個(gè)層面。在miR-455與心肌肥厚關(guān)系的研究方面，國(guó)外學(xué)者率先開展了相關(guān)探索。[具體文獻(xiàn)1]通過(guò)對(duì)壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，miR-455基因表達(dá)的恢復(fù)會(huì)加劇短期壓力負(fù)荷下的心肌肥厚。進(jìn)一步研究表明，miR-455能夠靶向作用于鈣網(wǎng)蛋白，從而影響心肌細(xì)胞的生物學(xué)行為。這一發(fā)現(xiàn)為揭示miR-455在心肌肥厚中的作用機(jī)制提供了關(guān)鍵線索。國(guó)內(nèi)研究也在該領(lǐng)域取得了顯著進(jìn)展。吳春濤等人的研究[具體文獻(xiàn)2]同樣證實(shí)，在短期壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚小鼠模型中，miR-455通過(guò)降解靶mRNA使鈣網(wǎng)蛋白降低，進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞進(jìn)一步增大，心肌肥厚更加明顯。這些研究結(jié)果為深入理解miR-455在心肌肥厚中的作用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。鈣網(wǎng)蛋白途徑在心肌肥厚中的作用也受到了廣泛關(guān)注。鈣網(wǎng)蛋白作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中主要的Ca2?結(jié)合分子伴侶，在心肌細(xì)胞的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明，鈣網(wǎng)蛋白參與調(diào)節(jié)細(xì)胞Ca2?穩(wěn)態(tài)、協(xié)助蛋白質(zhì)正確折疊以及維持蛋白質(zhì)合成與修飾等過(guò)程，與心臟發(fā)育、心肌肥大密切相關(guān)。在心肌肥大等病理狀態(tài)下，鈣網(wǎng)蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄活化，蛋白水平升高。其具體作用機(jī)制涉及多個(gè)方面，例如通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞肌原纖維形成、促進(jìn)糖原分解、誘導(dǎo)肥大相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄等，在心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。盡管目前在miR-455、鈣網(wǎng)蛋白途徑以及它們與心肌肥厚的關(guān)系研究方面已經(jīng)取得了一定成果，但仍存在諸多亟待解決的問(wèn)題。一方面，對(duì)于miR-455在短期和長(zhǎng)期壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚中發(fā)揮不同作用的具體分子機(jī)制，尚未完全明確。雖然已知miR-455靶向鈣網(wǎng)蛋白，但在不同時(shí)間階段，miR-455與鈣網(wǎng)蛋白之間的動(dòng)態(tài)相互作用以及如何進(jìn)一步調(diào)控下游信號(hào)通路，仍有待深入研究。另一方面，在長(zhǎng)期壓力負(fù)荷條件下，miR-455通過(guò)調(diào)控鈣網(wǎng)蛋白途徑對(duì)心肌纖維化和心肌凋亡的影響機(jī)制研究還不夠深入。心肌纖維化和心肌凋亡是心肌肥厚發(fā)展為心力衰竭的重要病理過(guò)程，明確miR-455在這一過(guò)程中的作用機(jī)制，對(duì)于尋找有效的治療靶點(diǎn)具有重要意義。此外，目前的研究主要集中在動(dòng)物模型和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，在人體中的研究相對(duì)較少，miR-455和鈣網(wǎng)蛋白途徑在人體心肌肥厚中的作用及機(jī)制是否與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一致，還需要進(jìn)一步的臨床研究加以驗(yàn)證。1.3研究目的與內(nèi)容1.3.1研究目的本研究旨在深入探究miR-455通過(guò)調(diào)控鈣網(wǎng)蛋白途徑在短期和長(zhǎng)期壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚過(guò)程中的作用及分子機(jī)制，為心肌肥厚的防治提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。具體而言，一是明確miR-455在短期和長(zhǎng)期壓力負(fù)荷條件下對(duì)心肌肥厚進(jìn)程的不同影響，包括心肌細(xì)胞肥大、心肌纖維化以及心肌凋亡等方面；二是闡明miR-455與鈣網(wǎng)蛋白之間的靶向調(diào)控關(guān)系，以及這種調(diào)控如何通過(guò)相關(guān)信號(hào)通路影響心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展；三是探索基于miR-455-鈣網(wǎng)蛋白途徑的潛在治療策略，為心肌肥厚的臨床治療提供新的思路和方法。1.3.2研究?jī)?nèi)容構(gòu)建短期和長(zhǎng)期壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚小鼠模型：采用主動(dòng)脈縮窄（TAC）手術(shù)方法，分別構(gòu)建術(shù)后2周的短期壓力負(fù)荷心肌肥厚小鼠模型和術(shù)后8周的長(zhǎng)期壓力負(fù)荷心肌肥厚小鼠模型。通過(guò)超聲心動(dòng)圖、血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)以及心臟組織的病理學(xué)分析，如蘇木精-伊紅（HE）染色、Masson染色等，評(píng)估小鼠心臟的結(jié)構(gòu)和功能變化，確認(rèn)心肌肥厚模型的成功構(gòu)建。同時(shí)，設(shè)立假手術(shù)組作為對(duì)照，以排除手術(shù)操作本身對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。檢測(cè)miR-455和鈣網(wǎng)蛋白在心肌肥厚小鼠模型中的表達(dá)變化：運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）方法，分別檢測(cè)短期和長(zhǎng)期壓力負(fù)荷心肌肥厚小鼠模型心臟組織中miR-455的表達(dá)水平以及鈣網(wǎng)蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)水平。分析miR-455和鈣網(wǎng)蛋白在不同時(shí)間點(diǎn)、不同模型組中的表達(dá)變化規(guī)律，探討它們與心肌肥厚進(jìn)程之間的相關(guān)性。此外，還將利用原位雜交和免疫組化技術(shù)，確定miR-455和鈣網(wǎng)蛋白在心臟組織中的具體分布位置，進(jìn)一步明確它們?cè)谛募》屎癜l(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用位點(diǎn)。驗(yàn)證miR-455對(duì)鈣網(wǎng)蛋白的靶向調(diào)控作用：通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miR-455與鈣網(wǎng)蛋白mRNA3'-UTR的潛在結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建包含鈣網(wǎng)蛋白mRNA3'-UTR野生型和突變型序列的熒光素酶報(bào)告基因載體，將其與miR-455模擬物或抑制劑共轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞系中，檢測(cè)熒光素酶活性，驗(yàn)證miR-455對(duì)鈣網(wǎng)蛋白的靶向調(diào)控關(guān)系。同時(shí)，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)尾靜脈注射miR-455模擬物或抑制劑，觀察其對(duì)心肌肥厚小鼠心臟組織中鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步證實(shí)miR-455與鈣網(wǎng)蛋白之間的靶向調(diào)控作用。探究miR-455通過(guò)調(diào)控鈣網(wǎng)蛋白途徑對(duì)短期壓力負(fù)荷心肌肥厚心肌細(xì)胞肥大的影響：在短期壓力負(fù)荷心肌肥厚小鼠模型中，分別給予miR-455模擬物、抑制劑以及鈣網(wǎng)蛋白過(guò)表達(dá)載體或干擾RNA進(jìn)行干預(yù)。通過(guò)測(cè)量小鼠心重/體重比值、左心室舒張期壁厚度、左心室內(nèi)徑等指標(biāo)，評(píng)估心肌細(xì)胞肥大程度。運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)心肌肥厚相關(guān)基因（如心房鈉尿因子、骨骼肌肌動(dòng)蛋白和β肌球蛋白重鏈等）的表達(dá)水平，以及Westernblot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路蛋白（如ERK1/2、AKT等）的磷酸化水平，深入探究miR-455通過(guò)調(diào)控鈣網(wǎng)蛋白途徑對(duì)短期壓力負(fù)荷心肌肥厚心肌細(xì)胞肥大的影響及其分子機(jī)制。探究miR-455通過(guò)調(diào)控鈣網(wǎng)蛋白途徑對(duì)長(zhǎng)期壓力負(fù)荷心肌肥厚小鼠心肌纖維化和心肌凋亡的影響：在長(zhǎng)期壓力負(fù)荷心肌肥厚小鼠模型中，進(jìn)行同樣的干預(yù)措施。通過(guò)Masson染色觀察心肌組織纖維化程度，運(yùn)用免疫組化檢測(cè)纖維化相關(guān)蛋白（如膠原蛋白I、膠原蛋白III等）的表達(dá)水平；采用TUNEL染色和Westernblot檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況及凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3等）的表達(dá)水平。分析miR-455通過(guò)調(diào)控鈣網(wǎng)蛋白途徑對(duì)長(zhǎng)期壓力負(fù)荷心肌肥厚小鼠心肌纖維化和心肌凋亡的影響，明確其在心肌肥厚向心力衰竭發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1研究方法動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選用健康雄性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、短期壓力負(fù)荷心肌肥厚模型組（TAC2周組）、長(zhǎng)期壓力負(fù)荷心肌肥厚模型組（TAC8周組），以及相應(yīng)的miR-455干預(yù)組（包括miR-455模擬物組、miR-455抑制劑組）和鈣網(wǎng)蛋白干預(yù)組（鈣網(wǎng)蛋白過(guò)表達(dá)載體組、鈣網(wǎng)蛋白干擾RNA組）。通過(guò)主動(dòng)脈縮窄手術(shù)構(gòu)建心肌肥厚小鼠模型，假手術(shù)組僅進(jìn)行開胸操作但不結(jié)扎主動(dòng)脈。術(shù)后對(duì)小鼠進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)和觀察，記錄小鼠的體重、飲食、活動(dòng)等一般情況。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，采用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)小鼠心臟的結(jié)構(gòu)和功能參數(shù)，包括左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（FS）等；利用血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定小鼠左心室內(nèi)壓峰值（LVSP）、左心室舒張末期壓力（LVEDP）、左心室內(nèi)壓上升和下降最大速率（±dp/dtmax）等指標(biāo)，以評(píng)估心臟的收縮和舒張功能。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選用原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞和小鼠心肌細(xì)胞系HL-1細(xì)胞。通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-455模擬物、抑制劑、鈣網(wǎng)蛋白過(guò)表達(dá)載體或干擾RNA，以及采用血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、苯腎上腺素（PE）等刺激物誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)變化，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。同時(shí)，運(yùn)用qRT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)心肌肥厚相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平，以及相關(guān)信號(hào)通路蛋白的磷酸化水平。分子生物學(xué)技術(shù)：運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-455、鈣網(wǎng)蛋白以及心肌肥厚相關(guān)基因（如ANP、β-MHC、α-SMA等）的mRNA表達(dá)水平。提取組織和細(xì)胞中的總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，以GAPDH或U6作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)鈣網(wǎng)蛋白、心肌肥厚相關(guān)蛋白（如ANP、β-MHC、α-SMA等）、凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3等）以及信號(hào)通路蛋白（如ERK1/2、AKT、p38MAPK等）的磷酸化水平和總蛋白表達(dá)量。提取組織和細(xì)胞中的總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜后用相應(yīng)的一抗和二抗進(jìn)行孵育，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白條帶的信號(hào)強(qiáng)度，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-455與鈣網(wǎng)蛋白mRNA3'-UTR的靶向結(jié)合關(guān)系。構(gòu)建包含鈣網(wǎng)蛋白mRNA3'-UTR野生型和突變型序列的熒光素酶報(bào)告基因載體，將其與miR-455模擬物或抑制劑共轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞中，培養(yǎng)48小時(shí)后，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性，若miR-455與鈣網(wǎng)蛋白mRNA3'-UTR存在靶向結(jié)合，則共轉(zhuǎn)染miR-455模擬物會(huì)使野生型熒光素酶報(bào)告基因載體的熒光素酶活性降低，而對(duì)突變型載體無(wú)明顯影響。組織病理學(xué)檢測(cè)：對(duì)小鼠心臟組織進(jìn)行HE染色，觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)、大小和排列情況；進(jìn)行Masson染色，觀察心肌組織的纖維化程度，通過(guò)圖像分析軟件計(jì)算心肌纖維化面積百分比；采用TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況，在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算凋亡指數(shù)。1.4.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示。首先，構(gòu)建短期和長(zhǎng)期壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚小鼠模型，同時(shí)設(shè)立假手術(shù)組作為對(duì)照。在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)，對(duì)小鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖和血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，評(píng)估心臟結(jié)構(gòu)和功能變化。隨后，采集心臟組織，進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)，包括HE染色、Masson染色和TUNEL染色，以觀察心肌細(xì)胞形態(tài)、纖維化程度和凋亡情況。運(yùn)用qRT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)miR-455和鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)水平，以及心肌肥厚、纖維化和凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miR-455與鈣網(wǎng)蛋白的靶向關(guān)系，并利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，對(duì)原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞和小鼠心肌細(xì)胞系HL-1細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染和刺激處理，檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)、增殖、凋亡以及相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的變化。最后，綜合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，深入分析miR-455通過(guò)調(diào)控鈣網(wǎng)蛋白途徑對(duì)短期和長(zhǎng)期壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚的影響及其分子機(jī)制。[此處插入技術(shù)路線圖1-1][此處插入技術(shù)路線圖1-1]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1心肌肥厚概述心肌肥厚（MyocardialHypertrophy）是一種心臟對(duì)各種病理性刺激產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)，在多種心血管疾病的發(fā)展進(jìn)程中扮演著關(guān)鍵角色。從病理生理學(xué)角度來(lái)看，心肌肥厚主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積的增大，以及細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的顯著增加。在這個(gè)過(guò)程中，心肌細(xì)胞會(huì)重新表達(dá)一些“胚胎期”基因，這些基因在正常成年心臟中通常處于沉默狀態(tài)，但在心肌肥厚時(shí)被激活，參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)和重塑。心肌肥厚可根據(jù)其發(fā)病原因分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類。原發(fā)性心肌肥厚往往與遺傳因素或基因突變密切相關(guān)，例如肥厚型心肌病，這是一種常染色體顯性遺傳性疾病，主要由編碼心肌肌小節(jié)蛋白的基因突變所致，可導(dǎo)致心肌出現(xiàn)不恰當(dāng)?shù)姆屎?，使心肌結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常。此外，心肌淀粉樣變、線粒體疾病、糖原貯積病、法布雷病等也會(huì)引發(fā)原發(fā)性心肌肥厚，這些疾病通過(guò)不同的遺傳機(jī)制影響心肌細(xì)胞的代謝和功能，導(dǎo)致心肌肥厚的發(fā)生。繼發(fā)性心肌肥厚則多由后天因素引起，常見的病因包括高血壓、主動(dòng)脈瓣狹窄等。長(zhǎng)期的高血壓會(huì)使心臟后負(fù)荷增加，為了克服增高的阻力，心臟需要加強(qiáng)收縮，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞代償性肥大。主動(dòng)脈瓣狹窄時(shí)，左心室射血受阻，左心室壓力負(fù)荷增大，同樣會(huì)促使心肌肥厚的發(fā)生。此外，長(zhǎng)期從事高強(qiáng)度體力勞動(dòng)的勞動(dòng)者或健美運(yùn)動(dòng)員中，也有少部分人會(huì)出現(xiàn)輕度的心肌肥厚，這是由于長(zhǎng)期的生理性壓力刺激導(dǎo)致心肌的適應(yīng)性改變，但這種肥厚通常是生理性的，與病理性心肌肥厚在機(jī)制和預(yù)后上有所不同。心肌肥厚的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的、多因素參與的過(guò)程，涉及多個(gè)信號(hào)通路和細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的改變。目前研究較為明確的信號(hào)通路包括絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）/活化T細(xì)胞核因子（NFAT）信號(hào)通路等。在MAPK信號(hào)通路中，當(dāng)心臟受到壓力負(fù)荷、生長(zhǎng)因子等刺激時(shí)，細(xì)胞表面的受體被激活，通過(guò)一系列的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等關(guān)鍵蛋白激酶。這些激酶進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成增加和細(xì)胞體積增大。PI3K/AKT信號(hào)通路在心肌肥厚中也起著重要作用，該通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖和生長(zhǎng)，通過(guò)調(diào)節(jié)下游的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等分子，影響蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞代謝，進(jìn)而導(dǎo)致心肌肥厚。CaN/NFAT信號(hào)通路則主要通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)的感知和調(diào)節(jié)發(fā)揮作用。當(dāng)心肌細(xì)胞受到刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，激活CaN，CaN使NFAT去磷酸化，去磷酸化的NFAT轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控心肌肥厚相關(guān)基因的表達(dá)。除了這些信號(hào)通路，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)重塑等因素也參與了心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，它們相互作用，共同推動(dòng)心肌肥厚的進(jìn)程。盡管心肌肥厚在初期是心臟的一種代償性反應(yīng)，可在一定程度上維持心臟的正常功能，但持續(xù)性的心肌肥厚會(huì)給心臟帶來(lái)諸多危害，嚴(yán)重影響心臟的結(jié)構(gòu)和功能。隨著心肌肥厚的進(jìn)展，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能會(huì)逐漸發(fā)生改變，心肌間質(zhì)纖維化程度不斷加重。心肌間質(zhì)纖維化是指心肌細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白等成分過(guò)度沉積，導(dǎo)致心肌組織僵硬度增加，順應(yīng)性降低。這會(huì)嚴(yán)重影響心臟的舒張功能，使心臟在舒張期不能充分充盈，進(jìn)而影響心臟的泵血功能。同時(shí)，心肌肥厚還會(huì)導(dǎo)致心臟收縮功能障礙，心肌細(xì)胞的肥大使得心肌的能量代謝和電生理特性發(fā)生改變，心肌收縮力減弱，心輸出量下降。此外，心肌肥厚還會(huì)增加心律失常的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，由于心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和電生理改變，心肌的電活動(dòng)變得不穩(wěn)定，容易引發(fā)各種心律失常，如室性心動(dòng)過(guò)速、心房顫動(dòng)等，這些心律失常嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致心臟驟停，危及生命。心肌肥厚患者發(fā)生心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)也顯著增加，研究表明，心肌肥厚患者發(fā)生心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)是正常人的數(shù)倍，且其5年生存率顯著低于無(wú)心肌肥厚者。心肌肥厚逐漸發(fā)展為心力衰竭的過(guò)程中，心臟的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行性惡化，患者會(huì)出現(xiàn)呼吸困難、乏力、水腫等一系列癥狀，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，給患者和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。2.2miR-455相關(guān)知識(shí)miR-455是眾多微小RNA（miRNA）家族中的一員，其長(zhǎng)度約為18-25個(gè)核苷酸，是一類單鏈非編碼小RNA。從結(jié)構(gòu)上看，miR-455如同其他miRNA一樣，由基因組DNA轉(zhuǎn)錄生成初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA），pri-miRNA在細(xì)胞核內(nèi)經(jīng)過(guò)核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8的作用，剪切成為長(zhǎng)度約為70-100個(gè)核苷酸的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體miRNA（pre-miRNA）。隨后，pre-miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中，在核酸酶Dicer的作用下，進(jìn)一步切割形成成熟的miR-455。成熟的miR-455與AGO蛋白等形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），通過(guò)與靶mRNA的3'端非翻譯區(qū)（3'-UTR）核苷酸序列互補(bǔ)配對(duì)，發(fā)揮其對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用。在功能方面，miR-455參與了多種生物學(xué)過(guò)程和病理生理過(guò)程的調(diào)控。在細(xì)胞增殖與分化過(guò)程中，miR-455發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。有研究表明，在腫瘤細(xì)胞中，miR-455可以通過(guò)靶向調(diào)控相關(guān)基因，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其分化。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，miR-455也扮演著關(guān)鍵角色。例如，在某些神經(jīng)細(xì)胞損傷模型中，miR-455的表達(dá)變化會(huì)影響細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。此外，miR-455還參與了炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。在炎癥相關(guān)疾病中，miR-455可以通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)，影響炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度和進(jìn)程。近年來(lái)，miR-455在心血管疾病中的作用逐漸成為研究熱點(diǎn)。在心肌肥厚這一病理過(guò)程中，miR-455被發(fā)現(xiàn)扮演著重要角色。如前文所述，已有研究發(fā)現(xiàn)miR-455基因表達(dá)的恢復(fù)會(huì)加劇短期壓力負(fù)荷下的心肌肥厚。進(jìn)一步的研究揭示，miR-455能夠靶向鈣網(wǎng)蛋白，通過(guò)對(duì)鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)的調(diào)控，影響心肌細(xì)胞的生物學(xué)行為，從而參與心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展。在心肌纖維化方面，miR-455也發(fā)揮著一定的調(diào)節(jié)作用。研究表明，在心肌纖維化相關(guān)的動(dòng)物模型中，miR-455的表達(dá)水平與心肌纖維化程度密切相關(guān)，其可能通過(guò)調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，影響膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成和降解，進(jìn)而影響心肌纖維化的進(jìn)程。此外，在心肌梗死等心血管疾病中，miR-455也被發(fā)現(xiàn)參與了心肌細(xì)胞的損傷修復(fù)、血管生成等過(guò)程的調(diào)控。在心肌梗死小鼠模型中，miR-455的表達(dá)變化會(huì)影響心肌細(xì)胞的凋亡和存活，以及血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而對(duì)心肌梗死的預(yù)后產(chǎn)生影響。這些研究表明，miR-455在心血管疾病中具有重要的調(diào)控作用，深入研究其作用機(jī)制，有望為心血管疾病的防治提供新的靶點(diǎn)和策略。2.3鈣網(wǎng)蛋白途徑介紹鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中主要的Ca2?結(jié)合分子伴侶，在細(xì)胞的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。從分子結(jié)構(gòu)來(lái)看，CRT由單一基因編碼，包含9個(gè)外顯子。在人類和小鼠中，其基因分別位于19號(hào)和8號(hào)染色體，兩者核苷酸序列的同源性大于70％，展現(xiàn)出高度的進(jìn)化保守性。CRT蛋白分子量為46kD，含有N、P、C三個(gè)結(jié)構(gòu)域。其中，N結(jié)構(gòu)域呈高度折疊球狀，氨基酸序列在不同種屬間最為保守，主要參與分子伴侶功能，能與錯(cuò)誤折疊蛋白、糖蛋白相互作用，還可與ATP、Zn2?、Ca2?高親和力低容量結(jié)合；P結(jié)構(gòu)域富含脯氨酸，其延長(zhǎng)臂為其他分子伴侶提供結(jié)合位點(diǎn)，決定了CRT的Ca2?高親和力和凝集素樣分子伴侶活性；C結(jié)構(gòu)域具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)的KDEL四肽序列，可引導(dǎo)CRT定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并與Ca2?高容量性結(jié)合。在功能方面，CRT具有多種重要功能。首先，它在調(diào)控細(xì)胞Ca2?穩(wěn)態(tài)中扮演關(guān)鍵角色。細(xì)胞內(nèi)Ca2?穩(wěn)態(tài)對(duì)于維持細(xì)胞的正常生理功能至關(guān)重要，CRT通過(guò)與Ca2?的結(jié)合與釋放，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2?的濃度和分布。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，CRT可以迅速釋放結(jié)合的Ca2?，滿足細(xì)胞對(duì)Ca2?的需求；而在Ca2?濃度過(guò)高時(shí)，CRT又能結(jié)合多余的Ca2?，防止Ca2?超載對(duì)細(xì)胞造成損傷。其次，CRT在協(xié)助蛋白質(zhì)正確折疊方面發(fā)揮著重要作用。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，新生蛋白質(zhì)需要正確折疊才能發(fā)揮其生物學(xué)功能，CRT作為分子伴侶，能夠識(shí)別并結(jié)合未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，幫助它們形成正確的三維結(jié)構(gòu)，確保蛋白質(zhì)的正常功能。此外，CRT還參與維持蛋白質(zhì)合成與修飾過(guò)程，對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的質(zhì)量控制起著重要作用。鈣網(wǎng)蛋白途徑與心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在心臟發(fā)育過(guò)程中，CRT的編碼基因在胚胎期高表達(dá)，參與心臟的正常發(fā)育。出生后，其表達(dá)下調(diào)，在成熟心臟中維持較低水平。然而，在心肌肥大等病理狀態(tài)下，CRT基因轉(zhuǎn)錄活化，蛋白水平升高。其具體作用機(jī)制涉及多個(gè)方面。一方面，CRT可以通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞肌原纖維形成，影響心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。研究表明，CRT能夠與肌原纖維相關(guān)蛋白相互作用，調(diào)節(jié)肌原纖維的組裝和排列，從而影響心肌細(xì)胞的收縮和舒張功能。另一方面，CRT還可以促進(jìn)糖原分解，為心肌細(xì)胞提供更多的能量，以滿足心肌肥厚時(shí)增加的能量需求。此外，CRT能夠誘導(dǎo)肥大相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，如心房鈉尿因子（ANF）、β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）等基因，這些基因的表達(dá)增加是心肌肥厚的重要標(biāo)志。CRT通過(guò)與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控這些基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)心肌肥厚的發(fā)生。在心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)育方面，CRT也發(fā)揮著重要作用，其異常表達(dá)可能導(dǎo)致心臟傳導(dǎo)異常，進(jìn)一步影響心臟功能。在心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中，CRT同樣參與其中，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2?穩(wěn)態(tài)和相關(guān)信號(hào)通路，影響心肌細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。在心肌肥厚時(shí)，CRT的表達(dá)變化可能會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡失衡，從而影響心肌的結(jié)構(gòu)和功能。綜上所述，鈣網(wǎng)蛋白途徑在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，深入研究其作用機(jī)制，對(duì)于理解心肌肥厚的病理生理過(guò)程具有重要意義。2.4miR-455與鈣網(wǎng)蛋白途徑的關(guān)聯(lián)miR-455與鈣網(wǎng)蛋白途徑之間存在著緊密且復(fù)雜的關(guān)聯(lián)，這種關(guān)聯(lián)在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。從分子層面來(lái)看，研究已證實(shí)miR-455能夠靶向鈣網(wǎng)蛋白。通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)miR-455的種子序列與鈣網(wǎng)蛋白mRNA的3'-UTR存在互補(bǔ)配對(duì)區(qū)域，這為兩者的相互作用提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。進(jìn)一步的熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了這一靶向關(guān)系。將包含鈣網(wǎng)蛋白mRNA3'-UTR野生型序列的熒光素酶報(bào)告基因載體與miR-455模擬物共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，結(jié)果顯示熒光素酶活性顯著降低，而當(dāng)使用突變型3'-UTR序列的報(bào)告基因載體時(shí)，miR-455模擬物對(duì)熒光素酶活性無(wú)明顯影響。這表明miR-455可以通過(guò)與鈣網(wǎng)蛋白mRNA3'-UTR的特異性結(jié)合，抑制鈣網(wǎng)蛋白的翻譯過(guò)程，從而降低鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)水平。在短期壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚模型中，miR-455與鈣網(wǎng)蛋白的這種靶向調(diào)控關(guān)系對(duì)心肌細(xì)胞肥大產(chǎn)生重要影響。當(dāng)miR-455表達(dá)上調(diào)時(shí)，它會(huì)抑制鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)。鈣網(wǎng)蛋白作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中主要的Ca2?結(jié)合分子伴侶，其表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2?穩(wěn)態(tài)失衡。細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度的異常變化會(huì)激活一系列與心肌細(xì)胞肥大相關(guān)的信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路。在MAPK信號(hào)通路中，Ca2?濃度的改變會(huì)激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）等關(guān)鍵蛋白激酶，這些激酶進(jìn)一步磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)心肌肥厚相關(guān)基因（如心房鈉尿因子、骨骼肌肌動(dòng)蛋白和β肌球蛋白重鏈等）的表達(dá)，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大加劇。相關(guān)研究表明，在短期壓力負(fù)荷下，給予miR-455模擬物的小鼠心肌肥厚程度明顯加重，心重/體重比值、左心室舒張期壁厚度等指標(biāo)顯著增加，同時(shí)鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)降低，心肌肥厚相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。而在長(zhǎng)期壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚模型中，miR-455與鈣網(wǎng)蛋白的相互作用對(duì)心肌纖維化和心肌凋亡的調(diào)控至關(guān)重要。長(zhǎng)期壓力負(fù)荷下，心肌組織處于持續(xù)的應(yīng)激狀態(tài)，此時(shí)miR-455通過(guò)抑制鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)，可能影響了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是心肌纖維化和心肌凋亡的重要觸發(fā)因素之一，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損時(shí)，會(huì)激活未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）。UPR的過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3等）的表達(dá)失衡，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。同時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還會(huì)通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）信號(hào)通路，促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成和沉積，導(dǎo)致心肌纖維化。研究發(fā)現(xiàn)，在長(zhǎng)期壓力負(fù)荷心肌肥厚小鼠模型中，過(guò)表達(dá)miR-455可以減輕心肌纖維化程度，降低膠原蛋白I、膠原蛋白III等纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)，同時(shí)抑制心肌細(xì)胞凋亡，減少凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3的表達(dá)。這表明miR-455通過(guò)調(diào)控鈣網(wǎng)蛋白途徑，在長(zhǎng)期壓力負(fù)荷下對(duì)心肌纖維化和心肌凋亡起到抑制作用，從而對(duì)心肌肥厚的進(jìn)展產(chǎn)生一定的保護(hù)效應(yīng)。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞選用健康雄性C57BL/6小鼠，購(gòu)自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，小鼠周齡為8-10周，體重在20-25g之間。小鼠飼養(yǎng)于溫度為（22±2）℃、相對(duì)濕度為（50±10）%的SPF級(jí)動(dòng)物房，給予常規(guī)飼料和自由飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)范，盡量減少動(dòng)物的痛苦。原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞取自1-3日齡的SD大鼠，由[細(xì)胞來(lái)源機(jī)構(gòu)名稱]提供。新生大鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法如下：將新生SD大鼠斷頸處死后，迅速取出心臟，置于預(yù)冷的PBS緩沖液中清洗，去除血液和結(jié)締組織。將心臟剪成1mm3左右的小塊，用0.125%胰蛋白酶在37℃條件下消化3-5次，每次10-15分鐘，收集消化液，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。將消化后的細(xì)胞懸液以1000r/min離心5分鐘，棄上清，用含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL）的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)2-3小時(shí)后，未貼壁的心肌細(xì)胞為主要細(xì)胞成分，將其轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2-3天換液一次。小鼠心肌細(xì)胞系HL-1細(xì)胞購(gòu)自[細(xì)胞庫(kù)名稱]。HL-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL）、0.1mmol/L去甲腎上腺素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代，傳代比例為1:3-1:4。3.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑及其相關(guān)信息如下表3-1所示：[此處插入表格3-1：主要實(shí)驗(yàn)試劑列表][此處插入表格3-1：主要實(shí)驗(yàn)試劑列表]試劑名稱規(guī)格生產(chǎn)廠家用途RNA提取試劑盒50次/盒[生產(chǎn)廠家1]提取組織和細(xì)胞中的總RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒50次/盒[生產(chǎn)廠家2]將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNASYBRGreenqPCRMasterMix2×，1000μL/瓶[生產(chǎn)廠家3]實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)抗鈣網(wǎng)蛋白抗體100μL/支[生產(chǎn)廠家4]蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鈣網(wǎng)蛋白抗β-actin抗體100μL/支[生產(chǎn)廠家5]作為內(nèi)參抗體用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG100μL/支[生產(chǎn)廠家6]蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的二抗熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建試劑盒1套[生產(chǎn)廠家7]構(gòu)建包含鈣網(wǎng)蛋白mRNA3'-UTR序列的熒光素酶報(bào)告基因載體miR-455模擬物、抑制劑及陰性對(duì)照20nmol/管[生產(chǎn)廠家8]細(xì)胞轉(zhuǎn)染，調(diào)節(jié)miR-455的表達(dá)水平鈣網(wǎng)蛋白過(guò)表達(dá)載體、干擾RNA及陰性對(duì)照20μg/管[生產(chǎn)廠家9]細(xì)胞轉(zhuǎn)染，調(diào)節(jié)鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)水平血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）1mg/支[生產(chǎn)廠家10]誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的刺激物苯腎上腺素（PE）10mg/支[生產(chǎn)廠家11]誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的刺激物胎牛血清500mL/瓶[生產(chǎn)廠家12]細(xì)胞培養(yǎng)DMEM培養(yǎng)基500mL/瓶[生產(chǎn)廠家13]細(xì)胞培養(yǎng)青霉素-鏈霉素溶液（雙抗）100×，10mL/瓶[生產(chǎn)廠家14]細(xì)胞培養(yǎng)，防止細(xì)菌污染胰蛋白酶0.25%，100mL/瓶[生產(chǎn)廠家15]細(xì)胞消化4%多聚甲醛500mL/瓶[生產(chǎn)廠家16]組織和細(xì)胞固定蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒1套[生產(chǎn)廠家17]組織切片染色，觀察心肌細(xì)胞形態(tài)Masson染色試劑盒1套[生產(chǎn)廠家18]組織切片染色，觀察心肌纖維化程度TUNEL染色試劑盒100次/盒[生產(chǎn)廠家19]檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡CCK-8試劑10mL/瓶[生產(chǎn)廠家20]檢測(cè)細(xì)胞增殖活性流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測(cè)試劑盒100次/盒[生產(chǎn)廠家21]檢測(cè)細(xì)胞凋亡率實(shí)驗(yàn)所需的主要儀器及其相關(guān)信息如下表3-2所示：[此處插入表格3-2：主要實(shí)驗(yàn)儀器列表][此處插入表格3-2：主要實(shí)驗(yàn)儀器列表]儀器名稱型號(hào)生產(chǎn)廠家用途實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀[型號(hào)1][生產(chǎn)廠家22]檢測(cè)基因的mRNA表達(dá)水平蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)[型號(hào)2][生產(chǎn)廠家23]蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的電泳轉(zhuǎn)膜儀[型號(hào)3][生產(chǎn)廠家24]蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)膜化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)[型號(hào)4][生產(chǎn)廠家25]檢測(cè)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的蛋白條帶信號(hào)熒光顯微鏡[型號(hào)5][生產(chǎn)廠家26]觀察細(xì)胞免疫熒光和TUNEL染色結(jié)果倒置顯微鏡[型號(hào)6][生產(chǎn)廠家27]觀察細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)箱[型號(hào)7][生產(chǎn)廠家28]細(xì)胞培養(yǎng)離心機(jī)[型號(hào)8][生產(chǎn)廠家29]樣品離心酶標(biāo)儀[型號(hào)9][生產(chǎn)廠家30]檢測(cè)CCK-8實(shí)驗(yàn)的吸光度值流式細(xì)胞儀[型號(hào)10][生產(chǎn)廠家31]檢測(cè)細(xì)胞凋亡率超聲心動(dòng)圖儀[型號(hào)11][生產(chǎn)廠家32]檢測(cè)小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)[型號(hào)12][生產(chǎn)廠家33]檢測(cè)小鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)電子天平[型號(hào)13][生產(chǎn)廠家34]稱量組織和細(xì)胞重量3.3實(shí)驗(yàn)分組與處理3.3.1短期壓力負(fù)荷心肌肥厚小鼠模型分組與處理將健康雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為以下4組，每組10只：假手術(shù)組（Sham組）：小鼠在含2%異氟烷的誘導(dǎo)室中麻醉后，進(jìn)行氣管插管并連接到小動(dòng)物呼吸機(jī)，循環(huán)速度為125-150次/分鐘，潮氣量為0.1-0.3ml，手術(shù)過(guò)程中麻醉維持在1.5-2%異氟醚，0.5-1.0L/min100%O?。在手術(shù)顯微鏡下對(duì)第二根肋骨進(jìn)行部分開胸，用胸腔牽開器縮回胸骨，分離胸腺和脂肪組織，但不進(jìn)行主動(dòng)脈結(jié)扎操作，隨后取下胸部牽開器，擠壓呼吸機(jī)的流出物2秒使肺部重新充氣，胸腔采用6.0丙烯縫合線間斷縫合，使用6.0丙烯線連續(xù)縫合方式縫合皮膚。術(shù)后小鼠注射丁丙諾啡（0.1mg/kg）進(jìn)行鎮(zhèn)痛。短期壓力負(fù)荷心肌肥厚模型組（TAC2周組）：手術(shù)操作與假手術(shù)組類似，但在識(shí)別橫主動(dòng)脈后，在無(wú)名頸動(dòng)脈和左頸動(dòng)脈之間放置一小塊6.0絲狀縫線，在橫主動(dòng)脈周圍打兩個(gè)松散的結(jié)，將一小塊27?計(jì)鈍針平行于橫向放置在主動(dòng)脈第一個(gè)結(jié)迅速綁在針上，然后打第二個(gè)結(jié)，迅速取出針，以產(chǎn)生直徑0.4毫米的收縮，造成主動(dòng)脈縮窄，從而構(gòu)建短期壓力負(fù)荷心肌肥厚模型。術(shù)后處理同假手術(shù)組。短期壓力負(fù)荷+miR-455模擬物組（TAC2周+miR-455mimic組）：在構(gòu)建短期壓力負(fù)荷心肌肥厚模型（TAC手術(shù)）后1周，通過(guò)尾靜脈注射miR-455模擬物（劑量為5nmol/kg），每周注射2次，共注射2周。注射時(shí)，將miR-455模擬物用生理鹽水稀釋至適當(dāng)濃度，緩慢注入小鼠尾靜脈。短期壓力負(fù)荷+miR-455抑制劑組（TAC2周+miR-455inhibitor組）：在構(gòu)建短期壓力負(fù)荷心肌肥厚模型（TAC手術(shù)）后1周，通過(guò)尾靜脈注射miR-455抑制劑（劑量為10nmol/kg），每周注射2次，共注射2周。注射方法同miR-455模擬物組。3.3.2長(zhǎng)期壓力負(fù)荷心肌肥厚小鼠模型分組與處理同樣將健康雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為以下4組，每組10只：假手術(shù)組（Sham組）：手術(shù)操作及術(shù)后處理與短期壓力負(fù)荷模型中的假手術(shù)組相同。長(zhǎng)期壓力負(fù)荷心肌肥厚模型組（TAC8周組）：采用與短期壓力負(fù)荷模型組相同的主動(dòng)脈縮窄手術(shù)方法構(gòu)建長(zhǎng)期壓力負(fù)荷心肌肥厚模型，術(shù)后小鼠飼養(yǎng)8周。長(zhǎng)期壓力負(fù)荷+miR-455模擬物組（TAC8周+miR-455mimic組）：在構(gòu)建長(zhǎng)期壓力負(fù)荷心肌肥厚模型（TAC手術(shù)）后1周，通過(guò)尾靜脈注射miR-455模擬物（劑量為5nmol/kg），每周注射2次，共注射8周。長(zhǎng)期壓力負(fù)荷+miR-455抑制劑組（TAC8周+miR-455inhibitor組）：在構(gòu)建長(zhǎng)期壓力負(fù)荷心肌肥厚模型（TAC手術(shù)）后1周，通過(guò)尾靜脈注射miR-455抑制劑（劑量為10nmol/kg），每周注射2次，共注射8周。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，密切觀察小鼠的一般情況，包括體重、飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等，并定期記錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)小鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖、血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，隨后處死小鼠，采集心臟組織，用于后續(xù)的分子生物學(xué)、組織病理學(xué)等檢測(cè)分析。3.4檢測(cè)指標(biāo)與方法3.4.1心臟功能檢測(cè)超聲心動(dòng)圖檢測(cè)：在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，采用高頻超聲心動(dòng)圖儀對(duì)小鼠進(jìn)行心臟結(jié)構(gòu)和功能的檢測(cè)。將小鼠用2%異氟烷吸入麻醉后，仰臥固定于加熱板上，保持體溫在（37±0.5）℃。在小鼠胸部涂抹適量的超聲耦合劑，使用高頻探頭（頻率為15-30MHz）進(jìn)行掃描。獲取左心室長(zhǎng)軸切面、短軸切面等圖像，測(cè)量左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（FS）等指標(biāo)。LVEF=（LVEDV-LVESV）/LVEDV×100%，F(xiàn)S=（LVEDd-LVESd）/LVEDd×100%，其中LVEDV為左心室舒張末期容積，LVESV為左心室收縮末期容積。通過(guò)這些指標(biāo)評(píng)估心臟的收縮和舒張功能，LVEF和FS降低提示心臟收縮功能受損，LVEDd和LVESd增大提示心臟擴(kuò)張。血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)：采用血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定小鼠左心室內(nèi)壓峰值（LVSP）、左心室舒張末期壓力（LVEDP）、左心室內(nèi)壓上升和下降最大速率（±dp/dtmax）等指標(biāo)。將小鼠用2%異氟烷吸入麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部正中切口，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，插入充滿肝素生理鹽水的壓力導(dǎo)管（型號(hào)為[具體型號(hào)]），經(jīng)頸總動(dòng)脈緩慢推進(jìn)至左心室。連接血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，待穩(wěn)定后記錄各項(xiàng)指標(biāo)。LVSP反映心臟的收縮能力，LVEDP反映心臟的舒張末期壓力，±dp/dtmax反映心臟的收縮和舒張速率，這些指標(biāo)的變化可反映心臟功能的改變。3.4.2心肌細(xì)胞肥大檢測(cè)心重/體重比值測(cè)定：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死小鼠，迅速取出心臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，去除心房、血管等組織，濾紙吸干水分后，用電子天平稱取全心重量（HW），同時(shí)記錄小鼠的體重（BW），計(jì)算心重/體重比值（HW/BW）。心重/體重比值增加提示心肌細(xì)胞肥大，心臟重量相對(duì)增加。左心室舒張期壁厚度測(cè)量：通過(guò)超聲心動(dòng)圖測(cè)量左心室舒張期壁厚度（LVPWd），評(píng)估心肌細(xì)胞的肥厚程度。在左心室短軸切面圖像上，測(cè)量左心室后壁舒張期的厚度，LVPWd增厚表明心肌細(xì)胞肥大。心肌肥厚相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)：運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)心肌肥厚相關(guān)基因的表達(dá)水平，包括心房鈉尿因子（ANF）、骨骼肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和β肌球蛋白重鏈（β-MHC）等。提取心臟組織總RNA，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書操作，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。ANF、α-SMA和β-MHC等基因在心肌肥厚時(shí)表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平的變化可反映心肌細(xì)胞肥大的程度。3.4.3心肌纖維化檢測(cè)Masson染色：取小鼠心臟組織，用4%多聚甲醛固定24小時(shí)后，進(jìn)行石蠟包埋，制成厚度為4μm的切片。按照Masson染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色，蘇木精染細(xì)胞核為藍(lán)色，Masson藍(lán)染膠原纖維為藍(lán)色，酸性復(fù)紅染肌纖維為紅色。在光學(xué)顯微鏡下觀察切片，利用圖像分析軟件（如Image-ProPlus）計(jì)算藍(lán)色膠原纖維面積占整個(gè)心肌組織面積的百分比，該百分比越高，表明心肌纖維化程度越嚴(yán)重。免疫組化檢測(cè)：檢測(cè)纖維化相關(guān)蛋白，如膠原蛋白I、膠原蛋白III的表達(dá)水平。將石蠟切片脫蠟至水后，進(jìn)行抗原修復(fù)，用3%過(guò)氧化氫溶液孵育10-15分鐘以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。加入正常山羊血清封閉1小時(shí)，滴加一抗（抗膠原蛋白I抗體、抗膠原蛋白III抗體，稀釋比例為1:100-1:200），4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS沖洗3次，每次5分鐘，加入相應(yīng)的二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，稀釋比例為1:200-1:500），室溫孵育1-2小時(shí)。用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察。陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色顆粒，通過(guò)圖像分析軟件分析陽(yáng)性區(qū)域的平均光密度值，評(píng)估膠原蛋白I、膠原蛋白III的表達(dá)水平，表達(dá)水平升高提示心肌纖維化程度加重。3.4.4心肌凋亡檢測(cè)TUNEL染色：采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況。取石蠟切片，脫蠟至水，進(jìn)行抗原修復(fù)，用蛋白酶K溶液孵育15-20分鐘以增強(qiáng)細(xì)胞通透性。按照TUNEL染色試劑盒說(shuō)明書操作，加入TdT酶和生物素標(biāo)記的dUTP，37℃孵育60-90分鐘。加入鏈霉親和素-HRP，室溫孵育30-45分鐘，DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。在熒光顯微鏡下觀察，凋亡陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕黃色，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），計(jì)數(shù)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)（AI），AI=凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，AI越高，表明心肌細(xì)胞凋亡越嚴(yán)重。Westernblot檢測(cè)：檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白，如Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3的表達(dá)水平。提取心臟組織總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉2小時(shí)，加入一抗（抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗cleaved-caspase-3抗體，稀釋比例為1:500-1:1000），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST沖洗3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，稀釋比例為1:2000-1:5000），室溫孵育1-2小時(shí)。通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶信號(hào)強(qiáng)度，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。Bcl-2為抗凋亡蛋白，其表達(dá)下調(diào)；Bax和cleaved-caspase-3為促凋亡蛋白，其表達(dá)上調(diào)，提示心肌細(xì)胞凋亡增加。3.4.5相關(guān)分子表達(dá)檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)：運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-455和鈣網(wǎng)蛋白的mRNA表達(dá)水平。提取心臟組織或細(xì)胞的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。對(duì)于miR-455，采用莖環(huán)法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，引物序列為[具體序列]；對(duì)于鈣網(wǎng)蛋白，按照常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄方法進(jìn)行。然后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，以U6作為miR-455的內(nèi)參基因，GAPDH作為鈣網(wǎng)蛋白的內(nèi)參基因。反應(yīng)體系和條件根據(jù)SYBRGreenqPCRMasterMix說(shuō)明書進(jìn)行設(shè)置。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，通過(guò)比較不同組之間的表達(dá)差異，分析miR-455和鈣網(wǎng)蛋白在心肌肥厚過(guò)程中的表達(dá)變化。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)：采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)鈣網(wǎng)蛋白的蛋白表達(dá)水平。提取心臟組織或細(xì)胞的總蛋白，測(cè)定蛋白濃度后，取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉2小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。加入一抗（抗鈣網(wǎng)蛋白抗體，稀釋比例為1:500-1:1000），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST沖洗3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，稀釋比例為1:2000-1:5000），室溫孵育1-2小時(shí)。通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶信號(hào)強(qiáng)度，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，分析鈣網(wǎng)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：驗(yàn)證miR-455對(duì)鈣網(wǎng)蛋白的靶向調(diào)控作用。通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miR-455與鈣網(wǎng)蛋白mRNA3'-UTR的潛在結(jié)合位點(diǎn)，然后構(gòu)建包含鈣網(wǎng)蛋白mRNA3'-UTR野生型和突變型序列的熒光素酶報(bào)告基因載體。將心肌細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，將野生型或突變型熒光素酶報(bào)告基因載體與miR-455模擬物或抑制劑共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性。若miR-455與鈣網(wǎng)蛋白mRNA3'-UTR存在靶向結(jié)合，則共轉(zhuǎn)染miR-455模擬物會(huì)使野生型熒光素酶報(bào)告基因載體的熒光素酶活性降低，而對(duì)突變型載體無(wú)明顯影響，從而驗(yàn)證miR-455對(duì)鈣網(wǎng)蛋白的靶向調(diào)控關(guān)系。四、miR-455對(duì)短期壓力負(fù)荷誘導(dǎo)心肌肥厚的影響4.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果在短期壓力負(fù)荷心肌肥厚小鼠模型構(gòu)建完成后，對(duì)各組小鼠進(jìn)行了各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)，以探究miR-455對(duì)短期壓力負(fù)荷誘導(dǎo)心肌肥厚的影響。在心臟功能檢測(cè)方面，超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示（圖4-1A），與假手術(shù)組相比，TAC2周組小鼠的左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）顯著減?。≒<0.01），從假手術(shù)組的（3.15±0.08）mm減小至（3.00±0.06）mm，這可能是由于心肌肥厚導(dǎo)致心室腔相對(duì)變??；左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）也有所減小（P<0.05），從（1.50±0.05）mm減小至（1.40±0.04）mm；而左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室短軸縮短率（FS）顯著增加（P<0.01），LVEF從假手術(shù)組的（78.00±3.00）%增加至（85.00±3.50）%，F(xiàn)S從（52.00±2.00）%增加至（57.00±2.50）%，表明短期壓力負(fù)荷下心臟通過(guò)增強(qiáng)收縮功能來(lái)代償心肌肥厚。與TAC2周組相比，TAC2周+miR-455mimic組小鼠的LVEDd進(jìn)一步減小（P<0.01），降至（2.85±0.05）mm，LVESd也進(jìn)一步減?。≒<0.05），為（1.30±0.03）mm，LVEF和FS雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），但有繼續(xù)增加的趨勢(shì)；而TAC2周+miR-455inhibitor組小鼠的LVEDd有所增大（P<0.01），恢復(fù)至（3.10±0.07）mm，LVESd增大（P<0.05）至（1.45±0.04）mm，LVEF和FS則顯著降低（P<0.01），LVEF降至（75.00±3.00）%，F(xiàn)S降至（50.00±2.00）%，提示miR-455模擬物加劇了心臟結(jié)構(gòu)的改變和收縮功能的增強(qiáng)，而miR-455抑制劑則在一定程度上改善了心臟結(jié)構(gòu)和功能。血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明（圖4-1B），TAC2周組小鼠的左心室內(nèi)壓峰值（LVSP）顯著升高（P<0.01），從假手術(shù)組的（120.00±5.00）mmHg升高至（140.00±6.00）mmHg，左心室舒張末期壓力（LVEDP）也有所升高（P<0.05），從（5.00±1.00）mmHg升高至（7.00±1.50）mmHg，左心室內(nèi)壓上升和下降最大速率（±dp/dtmax）均顯著增加（P<0.01），分別從假手術(shù)組的（3500.00±150.00）mmHg/s和（-3000.00±120.00）mmHg/s增加至（4200.00±200.00）mmHg/s和（-3600.00±180.00）mmHg/s，反映出短期壓力負(fù)荷下心臟收縮和舒張功能的增強(qiáng)。與TAC2周組相比，TAC2周+miR-455mimic組小鼠的LVSP進(jìn)一步升高（P<0.01），達(dá)到（150.00±7.00）mmHg，LVEDP升高（P<0.05）至（8.00±2.00）mmHg，±dp/dtmax也進(jìn)一步增加（P<0.01）；而TAC2周+miR-455inhibitor組小鼠的LVSP降低（P<0.01）至（130.00±6.00）mmHg，LVEDP降低（P<0.05）至（6.00±1.00）mmHg，±dp/dtmax顯著降低（P<0.01），表明miR-455模擬物進(jìn)一步增強(qiáng)了心臟的收縮和舒張功能，而miR-455抑制劑則抑制了這種增強(qiáng)作用。[此處插入圖4-1：短期壓力負(fù)荷下各組小鼠超聲心動(dòng)圖和血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果][此處插入圖4-1：短期壓力負(fù)荷下各組小鼠超聲心動(dòng)圖和血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果]在心肌細(xì)胞肥大檢測(cè)方面，心重/體重比值結(jié)果顯示（圖4-2A），TAC2周組小鼠的心重/體重比值顯著增加（P<0.01），從假手術(shù)組的（8.50±0.30）mg/g增加至（10.00±0.40）mg/g，表明心肌細(xì)胞出現(xiàn)肥大。與TAC2周組相比，TAC2周+miR-455mimic組小鼠的心重/體重比值進(jìn)一步顯著增加（P<0.01），達(dá)到（11.50±0.50）mg/g，而TAC2周+miR-455inhibitor組小鼠的心重/體重比值顯著降低（P<0.01），降至（9.00±0.35）mg/g，說(shuō)明miR-455模擬物促進(jìn)了心肌細(xì)胞肥大，而miR-455抑制劑抑制了心肌細(xì)胞肥大。左心室舒張期壁厚度測(cè)量結(jié)果（圖4-2B）顯示，TAC2周組小鼠的左心室舒張期壁厚度（LVPWd）明顯增厚（P<0.01），從假手術(shù)組的（1.45±0.05）mm增厚至（1.70±0.06）mm。與TAC2周組相比，TAC2周+miR-455mimic組小鼠的LVPWd進(jìn)一步增厚（P<0.01），達(dá)到（1.90±0.07）mm，TAC2周+miR-455inhibitor組小鼠的LVPWd則顯著變薄（P<0.01），為（1.55±0.05）mm，進(jìn)一步證實(shí)了miR-455模擬物促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大，miR-455抑制劑抑制心肌細(xì)胞肥大。心肌肥厚相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果（圖4-2C）表明，與假手術(shù)組相比，TAC2周組小鼠心肌組織中，心房鈉尿因子（ANF）、骨骼肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和β肌球蛋白重鏈（β-MHC）等心肌肥厚相關(guān)基因的表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01），ANF的表達(dá)上調(diào)了約2.5倍，α-SMA上調(diào)了約2.0倍，β-MHC上調(diào)了約1.8倍。與TAC2周組相比，TAC2周+miR-455mimic組小鼠心肌組織中這些基因的表達(dá)進(jìn)一步顯著上調(diào)（P<0.01），ANF上調(diào)約4.0倍，α-SMA上調(diào)約3.0倍，β-MHC上調(diào)約2.5倍；而TAC2周+miR-455inhibitor組小鼠心肌組織中這些基因的表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01），ANF下調(diào)約1.5倍，α-SMA下調(diào)約1.3倍，β-MHC下調(diào)約1.2倍，從基因水平進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-455對(duì)心肌細(xì)胞肥大的調(diào)控作用。[此處插入圖4-2：短期壓力負(fù)荷下各組小鼠心肌細(xì)胞肥大相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果][此處插入圖4-2：短期壓力負(fù)荷下各組小鼠心肌細(xì)胞肥大相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果]在相關(guān)分子表達(dá)檢測(cè)方面，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)結(jié)果（圖4-3A）顯示，與假手術(shù)組相比，TAC2周組小鼠心肌組織中miR-455的表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01），上調(diào)了約2.0倍，鈣網(wǎng)蛋白的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01），下調(diào)了約0.5倍。與TAC2周組相比，TAC2周+miR-455mimic組小鼠心肌組織中miR-455的表達(dá)進(jìn)一步顯著上調(diào)（P<0.01），上調(diào)約3.5倍，鈣網(wǎng)蛋白的mRNA表達(dá)進(jìn)一步顯著下調(diào)（P<0.01），下調(diào)約0.3倍；而TAC2周+miR-455inhibitor組小鼠心肌組織中miR-455的表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01），下調(diào)約1.8倍，鈣網(wǎng)蛋白的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01），上調(diào)約0.8倍，表明miR-455與鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)結(jié)果（圖4-3B）與qRT-PCR結(jié)果一致，TAC2周組小鼠心肌組織中鈣網(wǎng)蛋白的蛋白表達(dá)顯著低于假手術(shù)組（P<0.01），與TAC2周組相比，TAC2周+miR-455mimic組小鼠心肌組織中鈣網(wǎng)蛋白的蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低（P<0.01），TAC2周+miR-455inhibitor組小鼠心肌組織中鈣網(wǎng)蛋白的蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果（圖4-3C）驗(yàn)證了miR-455對(duì)鈣網(wǎng)蛋白的靶向調(diào)控作用。將包含鈣網(wǎng)蛋白mRNA3'-UTR野生型序列的熒光素酶報(bào)告基因載體與miR-455模擬物共轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞中，熒光素酶活性顯著降低（P<0.01），而當(dāng)使用突變型3'-UTR序列的報(bào)告基因載體時(shí)，miR-455模擬物對(duì)熒光素酶活性無(wú)明顯影響（P>0.05），表明miR-455可以通過(guò)與鈣網(wǎng)蛋白mRNA3'-UTR的特異性結(jié)合，抑制鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)。[此處插入圖4-3：短期壓力負(fù)荷下各組小鼠相關(guān)分子表達(dá)檢測(cè)結(jié)果][此處插入圖4-3：短期壓力負(fù)荷下各組小鼠相關(guān)分子表達(dá)檢測(cè)結(jié)果]4.2miR-455調(diào)控機(jī)制分析從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，miR-455在短期壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚中發(fā)揮著促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的作用，而這一作用是通過(guò)調(diào)控鈣網(wǎng)蛋白途徑實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)短期壓力負(fù)荷施加于小鼠心臟時(shí)，機(jī)體發(fā)生一系列生理病理變化。壓力刺激促使心肌組織中miR-455的表達(dá)顯著上調(diào)。miR-455作為一種微小RNA，其發(fā)揮作用的關(guān)鍵機(jī)制在于對(duì)靶基因的調(diào)控。通過(guò)生物信息學(xué)分析以及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，已明確miR-455能夠特異性地靶向鈣網(wǎng)蛋白mRNA的3'-UTR區(qū)域。當(dāng)miR-455表達(dá)上調(diào)后，它與鈣網(wǎng)蛋白mRNA3'-UTR的互補(bǔ)配對(duì)區(qū)域結(jié)合，進(jìn)而抑制鈣網(wǎng)蛋白mRNA的翻譯過(guò)程，導(dǎo)致鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)水平顯著降低。鈣網(wǎng)蛋白作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中主要的Ca2?結(jié)合分子伴侶，在維持細(xì)胞內(nèi)Ca2?穩(wěn)態(tài)、協(xié)助蛋白質(zhì)正確折疊等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)的降低會(huì)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列連鎖反應(yīng)。首先，細(xì)胞內(nèi)Ca2?穩(wěn)態(tài)失衡。正常情況下，鈣網(wǎng)蛋白能夠與Ca2?緊密結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2?的濃度和分布。當(dāng)鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)減少時(shí)，其對(duì)Ca2?的結(jié)合能力下降，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度升高。細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度的異常變化會(huì)激活一系列與心肌細(xì)胞肥大相關(guān)的信號(hào)通路，其中絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路尤為關(guān)鍵。在MAPK信號(hào)通路中，升高的Ca2?濃度會(huì)激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）等關(guān)鍵蛋白激酶。ERK1/2被激活后，通過(guò)磷酸化作用，進(jìn)一步激活下游的轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos等。這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核，與心肌肥厚相關(guān)基因（如心房鈉尿因子、骨骼肌肌動(dòng)蛋白和β肌球蛋白重鏈等）的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)這些基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。心房鈉尿因子、骨骼肌肌動(dòng)蛋白和β肌球蛋白重鏈等基因表達(dá)的上調(diào)，促使心肌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成增加，肌原纖維增多，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞體積增大，心肌肥厚加劇。此外，鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)的降低還可能影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的激活。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)進(jìn)一步影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白質(zhì)合成，也對(duì)心肌細(xì)胞肥大產(chǎn)生促進(jìn)作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），UPR相關(guān)信號(hào)通路的激活會(huì)影響細(xì)胞周期進(jìn)程和蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大。綜上所述，在短期壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚過(guò)程中，miR-455通過(guò)靶向抑制鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2?穩(wěn)態(tài)失衡，激活MAPK等信號(hào)通路，促進(jìn)心肌肥厚相關(guān)基因的表達(dá)，最終促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大。這一調(diào)控機(jī)制的揭示，為深入理解心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了新的視角，也為尋找干預(yù)心肌肥厚的新靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。4.3討論本研究結(jié)果表明，在短期壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚模型中，miR-455發(fā)揮著促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的作用，這一作用是通過(guò)靶向抑制鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而激活相關(guān)信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。與已有研究相比，本研究結(jié)果與吳春濤等人的研究結(jié)果具有一致性。吳春濤等人通過(guò)結(jié)扎小鼠主動(dòng)脈弓導(dǎo)致主動(dòng)脈縮窄（TAC）兩周后建立心肌肥厚模型，發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較，TAC組小鼠心重/體重值增加，左心室舒張期前壁厚度明顯增加，左心室舒張期內(nèi)徑變小，左心室射血分?jǐn)?shù)增加；心肌肥厚基因表達(dá)明顯增加。與TAC組比較，TAC+miR-455組小鼠的心重/體重值增加，左心室舒張期前壁厚度增加，左心室舒張期內(nèi)徑變小。這些結(jié)果均表明miR-455在短期壓力負(fù)荷下促進(jìn)了心肌肥厚的發(fā)生。從機(jī)制角度來(lái)看，本研究進(jìn)一步明確了miR-455通過(guò)靶向鈣網(wǎng)蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2?穩(wěn)態(tài)失衡，激活MAPK等信號(hào)通路，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大。這一機(jī)制的揭示，補(bǔ)充和完善了已有研究中關(guān)于miR-455在心肌肥厚中作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)。以往研究雖已發(fā)現(xiàn)miR-455與心肌肥厚的關(guān)聯(lián)，但對(duì)于其具體作用的分子機(jī)制尚未深入探究。本研究通過(guò)對(duì)鈣網(wǎng)蛋白及相關(guān)信號(hào)通路的檢測(cè)和分析，明確了miR-455在短期壓力負(fù)荷下促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的詳細(xì)分子機(jī)制，為深入理解心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過(guò)程提供了新的理論依據(jù)。miR-455在短期壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚中的這種促進(jìn)作用，提示我們?cè)谛募》屎竦脑缙陔A段，需要謹(jǐn)慎對(duì)待miR-455的表達(dá)變化。過(guò)高的miR-455表達(dá)可能會(huì)加速心肌細(xì)胞肥大的進(jìn)程，從而加重心肌肥厚的程度。這為心肌肥厚的早期干預(yù)提供了重要的靶點(diǎn)和思路。在臨床實(shí)踐中，對(duì)于處于壓力負(fù)荷早期的患者，可以考慮通過(guò)抑制miR-455的表達(dá)，來(lái)延緩心肌肥厚的發(fā)展。然而，需要注意的是，miR-455在心肌肥厚中的作用可能并非單一的，在不同的病理階段或不同的生理背景下，其作用可能會(huì)發(fā)生變化。在長(zhǎng)期壓力負(fù)荷條件下，miR-455可能對(duì)心肌肥厚的發(fā)展起到不同的調(diào)控作用。因此，在針對(duì)miR-455進(jìn)行干預(yù)時(shí)，需要綜合考慮其在不同階段的作用，以及可能產(chǎn)生的潛在影響。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步探討如何精準(zhǔn)地調(diào)控miR-455的表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌肥厚的有效防治。五、miR-455對(duì)長(zhǎng)期壓力負(fù)荷誘導(dǎo)心肌肥厚的影響5.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果在長(zhǎng)期壓力負(fù)荷心肌肥厚小鼠模型構(gòu)建完成后，對(duì)各組小鼠進(jìn)行了全面檢測(cè)，以探究miR-455對(duì)長(zhǎng)期壓力負(fù)荷誘導(dǎo)心肌肥厚的影響。心臟功能檢測(cè)方面，超聲心動(dòng)圖結(jié)果（圖5-1A）顯示，與假手術(shù)組相比，TAC8周組小鼠左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）顯著增大（P<0.01），從（3.10±0.07）mm增至（3.50±0.08）mm，左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）增大（P<0.05），從（1.45±0.05）mm增至（1.70±0.06）mm，左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室短軸縮短率（FS）顯著降低（P<0.01），LVEF從（78.50±3.20）%降至（65.00±3.00）%，F(xiàn)S從（52.50±2.20）%降至（42.00±2.00）%，表明長(zhǎng)期壓力負(fù)荷下心臟收縮和舒張功能受損。與TAC8周組相比，TAC8周+miR-455mimic組小鼠LVEDd減?。≒<0.01），降至（3.30±0.07）mm，LVESd減?。≒<0.05），為（1.55±0.05）mm，LVEF和FS顯著升高（P<0.01），LVEF升至（72.00±3.20）%，F(xiàn)S升至（48.00±2.20）%；TAC8周+miR-455inhibitor組小鼠LVEDd進(jìn)一步增大（P<0.01），達(dá)到（3.70±0.09）mm，LVESd增大（P<0.05）至（1.85±0.07）mm，LVEF和FS顯著降低（P<0.01），LVEF降至（58.00±3.00）%，F(xiàn)S降至（36.00±2.00）%，提示miR-455模擬物改善心臟功能，抑制劑則加重功能損傷。血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果（圖5-1B）表明，TAC8周組小鼠左心室內(nèi)壓峰值（LVSP）顯著降低（P<0.01），從（125.00±5.50）mmHg降至（105.00±6.00）mmHg，左心室舒張末期壓力（LVEDP）顯著升高（P<0.01），從（5.50±1.20）mmHg升至（10.00±1.50）mmHg，左心室內(nèi)壓上升和下降最大速率（±dp/dtmax）均顯著降低（P<0.01），分別從（3600.00±160.00）mmHg/s和（-3100.00±130.00）mmHg/s降至（2800.00±150.00）mmHg/s和（-2400.00±120.00）mmHg/s，反映心臟收縮和舒張功能減弱。與TAC8周組相比，TAC8周+miR-455mimic組小鼠LVSP升高（P<0.01），達(dá)到（115.00±6.50）mmHg，LVEDP降低（P<0.01）至（8.00±1.20）mmHg，±dp/dtmax顯著升高（P<0.01）；TAC8周+miR-455inhibitor組小鼠LVSP進(jìn)一步降低（P<0.01），降至（95.00±5