乙烯介導(dǎo)棉花與黃萎病菌互作機(jī)制及調(diào)控效應(yīng)探究一、引言1.1研究背景棉花作為全球重要的經(jīng)濟(jì)作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和紡織工業(yè)中占據(jù)著舉足輕重的地位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球棉花種植面積廣泛，每年的棉花產(chǎn)量對(duì)于許多國(guó)家的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和就業(yè)穩(wěn)定都有著重要的支撐作用。然而，棉花生產(chǎn)面臨著多種挑戰(zhàn)，其中棉花黃萎病是最為嚴(yán)重的威脅之一。棉花黃萎病是由大麗輪枝菌（Verticilliumdahliae）引起的一種土傳性真菌病害，素有“棉花癌癥”之稱。該病害在全球各主要產(chǎn)棉區(qū)均有發(fā)生，給棉花產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在中國(guó)，棉花黃萎病的危害尤為嚴(yán)重，據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，每年因棉花黃萎病導(dǎo)致的棉花減產(chǎn)可達(dá)10%-30%，嚴(yán)重時(shí)甚至高達(dá)80%以上，部分地區(qū)甚至出現(xiàn)絕收的情況。這不僅直接影響了棉農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入，也對(duì)棉花加工企業(yè)和相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成了連鎖反應(yīng)，影響了整個(gè)棉花產(chǎn)業(yè)鏈的穩(wěn)定發(fā)展。大麗輪枝菌的生存能力極強(qiáng)，其微菌核能夠在土壤中存活長(zhǎng)達(dá)8-10年之久。在我國(guó)，尤其是北方棉區(qū)，由于連年種植棉花，輪作制度難以有效實(shí)施，導(dǎo)致土壤中病原菌不斷累積，含菌量越來(lái)越高。同時(shí)，病原菌具有很強(qiáng)的變異性，新的強(qiáng)致病力菌系不斷出現(xiàn)，使得棉花黃萎病的防治難度日益增大。此外，目前缺乏高抗棉花黃萎病的優(yōu)良品種，現(xiàn)有大面積推廣品種的抗病力普遍不強(qiáng)，這也是棉花黃萎病難以得到有效控制的重要原因之一。研究棉花與黃萎病菌的互作機(jī)制，對(duì)于深入了解病害的發(fā)生發(fā)展過(guò)程、開發(fā)有效的防治策略具有重要意義。通過(guò)揭示棉花在抵御黃萎病菌侵染過(guò)程中的生理生化和分子生物學(xué)變化，我們可以尋找新的抗病靶點(diǎn)，為棉花抗病育種提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。例如，利用基因工程技術(shù)，將與抗病相關(guān)的基因?qū)朊藁ㄆ贩N中，有望培育出高抗棉花黃萎病的新品種，從而從根本上解決棉花黃萎病的危害問(wèn)題。1.2乙烯在植物生理及抗病中的作用概述乙烯作為一種氣態(tài)植物激素，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演著極為重要的角色。從種子萌發(fā)開始，乙烯就參與其中，影響著種子的休眠與萌發(fā)進(jìn)程。在幼苗生長(zhǎng)階段，乙烯能夠調(diào)控幼苗的形態(tài)建成，例如影響下胚軸的伸長(zhǎng)、根的生長(zhǎng)方向等。在植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中，乙烯對(duì)葉片的生長(zhǎng)、衰老和脫落也有著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，它可以促進(jìn)葉片的衰老，加速葉片脫落，從而使植物更好地適應(yīng)環(huán)境變化。在植物的生殖生長(zhǎng)方面，乙烯參與了花芽分化、開花、授粉受精以及果實(shí)發(fā)育和成熟等多個(gè)環(huán)節(jié)。在果實(shí)成熟過(guò)程中，乙烯是啟動(dòng)果實(shí)成熟的關(guān)鍵信號(hào)，它能夠促進(jìn)果實(shí)的軟化、顏色變化、糖分積累以及香氣物質(zhì)的合成，使果實(shí)達(dá)到最佳的食用品質(zhì)和商品價(jià)值。在植物應(yīng)對(duì)生物脅迫方面，乙烯同樣發(fā)揮著不可或缺的作用。當(dāng)植物受到病原菌侵染時(shí)，乙烯信號(hào)通路被激活，植物會(huì)啟動(dòng)一系列的防御反應(yīng)。乙烯可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生植保素，植保素是一類具有抗菌活性的次生代謝產(chǎn)物，能夠抑制病原菌的生長(zhǎng)和繁殖。例如，在煙草受到煙草花葉病毒侵染時(shí)，乙烯會(huì)誘導(dǎo)煙草合成植物抗毒素，從而增強(qiáng)煙草對(duì)病毒的抗性。乙烯還能調(diào)節(jié)植物細(xì)胞壁的修飾，使細(xì)胞壁加厚，增強(qiáng)植物細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度，阻止病原菌的進(jìn)一步侵入。此外，乙烯能夠誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白（PR蛋白）基因的表達(dá)，PR蛋白具有多種抗菌功能，如幾丁質(zhì)酶可以降解病原菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)，β-1,3-葡聚糖酶能夠水解病原菌細(xì)胞壁的β-1,3-葡聚糖，從而抑制病原菌的生長(zhǎng)。乙烯在植物的整個(gè)生命周期中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其在植物抗病過(guò)程中的調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)于植物抵御病原菌的侵害至關(guān)重要。在棉花與黃萎病菌的互作中，乙烯可能作為重要的信號(hào)分子，調(diào)控棉花對(duì)黃萎病菌的抗性反應(yīng)。因此，深入研究乙烯在棉花與黃萎病菌互作中的作用，有助于揭示棉花抗黃萎病的分子機(jī)制，為棉花黃萎病的防治提供新的思路和策略。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究乙烯在棉花與黃萎病菌互作過(guò)程中的作用機(jī)制，明確乙烯信號(hào)通路在棉花抵御黃萎病菌侵染過(guò)程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)分析乙烯在棉花不同組織中的合成動(dòng)態(tài)變化，以及黃萎病菌侵染后乙烯響應(yīng)基因的表達(dá)模式，揭示乙烯如何影響棉花的抗病防御反應(yīng)。同時(shí)，研究乙烯與其他植物激素（如茉莉酸、水楊酸等）在棉花抗黃萎病過(guò)程中的協(xié)同或拮抗作用，全面解析棉花的抗病調(diào)控機(jī)制。從理論意義上講，深入研究乙烯在棉花與黃萎病菌互作中的作用，有助于豐富植物與病原菌互作的理論體系，進(jìn)一步完善乙烯在植物抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用機(jī)制。這不僅能夠?yàn)槊藁裹S萎病機(jī)制的研究提供新的視角和理論依據(jù)，也將為其他植物病害的研究提供有益的借鑒。通過(guò)揭示乙烯介導(dǎo)的棉花抗病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可以更好地理解植物在應(yīng)對(duì)生物脅迫時(shí)的分子機(jī)制，為植物抗病育種提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。從實(shí)踐意義來(lái)看，本研究對(duì)于棉花抗病育種具有重要的指導(dǎo)意義。明確乙烯在棉花抗黃萎病中的作用機(jī)制后，可以將乙烯信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因作為分子標(biāo)記，應(yīng)用于棉花抗病品種的選育工作中。通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，能夠快速、準(zhǔn)確地篩選出具有優(yōu)良抗病性狀的棉花品種，提高育種效率，縮短育種周期。此外，根據(jù)乙烯的作用機(jī)制，還可以開發(fā)新型的棉花黃萎病防治策略。例如，通過(guò)調(diào)控乙烯的合成或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，增強(qiáng)棉花對(duì)黃萎病菌的抗性，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，降低環(huán)境污染，實(shí)現(xiàn)棉花的綠色可持續(xù)生產(chǎn)。這對(duì)于保障棉花產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展，提高棉農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。二、棉花黃萎病與乙烯相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1棉花黃萎病概述2.1.1病原菌特征棉花黃萎病的病原菌主要為大麗輪枝菌（Verticilliumdahliae），隸屬于半知菌亞門輪枝菌屬真菌。在顯微鏡下觀察，大麗輪枝菌的菌絲體呈現(xiàn)出白色絲狀，具有典型的真菌菌絲結(jié)構(gòu)。其分生孢子梗直立生長(zhǎng)，長(zhǎng)度通常在110-130微米之間，且具有獨(dú)特的輪狀分枝結(jié)構(gòu)，每輪一般有3-4個(gè)分枝，分枝大小約為13.7-21.4×2.3-9.1微米。在輪枝的頂端或頂枝上著生有分生孢子，這些分生孢子呈長(zhǎng)卵圓形，單細(xì)胞且無(wú)色透明，大小為2.3-9.1×1.5-3.0微米。大麗輪枝菌還具有一種特殊的休眠結(jié)構(gòu)——微菌核。微菌核是由許多孢壁增厚形成的黑褐色厚垣孢子聚集結(jié)合而成，其形狀近球形，大小約為30-50um。微菌核對(duì)不良環(huán)境具有極強(qiáng)的抵抗力，它能夠耐受80℃的高溫和-30℃的低溫，這使得大麗輪枝菌在惡劣的土壤環(huán)境中也能長(zhǎng)期存活。在土壤含水量為20%時(shí)，有利于微菌核的形成；而當(dāng)土壤含水量超過(guò)40%時(shí)，則不利于其形成。大麗輪枝菌存在明顯的生理分化現(xiàn)象，不同的菌系在致病能力上存在顯著差異。例如，美國(guó)已分化出T型和SS-4型（非落葉型）兩個(gè)生理小種。其中，T型生理小種致病力較強(qiáng)，感染后會(huì)導(dǎo)致棉花頂葉迅速向下卷曲褪綠，葉片快速脫落，隨后頂端枯死；而SS-4型生理小種致病力相對(duì)較弱，引發(fā)的癥狀主要是葉片主脈間出現(xiàn)黃色斑駁，葉片向上稍卷，病葉脫落速度較為緩慢，植株矮化。這種致病類型的差異，給棉花黃萎病的防治帶來(lái)了更大的挑戰(zhàn)，因?yàn)獒槍?duì)不同致病類型的病原菌，需要采用不同的防治策略。在土壤中，大麗輪枝菌主要以微菌核及菌絲體的形式越冬。土壤中的菌源數(shù)量是黃萎病能否流行的先決條件，隨著連作年限的增加，土壤中病原菌不斷累積，含菌量逐漸升高，病害發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增大。此外，病殘組織、帶菌的棉籽、棉籽餅、棉籽殼以及未經(jīng)腐熟的土雜肥等也都是病原菌的重要越冬場(chǎng)所。棉籽雖然帶菌率較低，一般不超過(guò)0.026%，但其在病害遠(yuǎn)距離傳播過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，是病原菌傳播到新地區(qū)的關(guān)鍵途徑之一。病原菌主要通過(guò)棉花的根毛細(xì)胞、根表皮細(xì)胞或根部傷口侵入植株，然后經(jīng)過(guò)皮層進(jìn)入導(dǎo)管，并在導(dǎo)管內(nèi)大量繁殖，產(chǎn)生的分生孢子及菌絲體不斷積累，最終堵塞導(dǎo)管，阻礙水分和養(yǎng)分的運(yùn)輸，導(dǎo)致棉花植株發(fā)病。2.1.2發(fā)病癥狀與危害棉花黃萎病在棉花整個(gè)生育期均可發(fā)病，但在自然條件下，幼苗發(fā)病相對(duì)較少。一般在棉花生長(zhǎng)至3-5片真葉期時(shí)開始出現(xiàn)癥狀，隨著生長(zhǎng)進(jìn)程的推進(jìn)，尤其是在現(xiàn)蕾后，田間發(fā)病情況逐漸加重，在花鈴期達(dá)到發(fā)病高峰。在發(fā)病初期，癥狀首先出現(xiàn)在植株下部葉片，葉片邊緣和主脈間會(huì)出現(xiàn)淺黃色斑塊，這些斑塊形狀不規(guī)則。隨著病情的發(fā)展，病斑色澤逐漸加深，變?yōu)辄S褐色，同時(shí)病葉邊緣開始向上卷曲，但主脈及其附近的葉肉仍能保持綠色，使病葉呈現(xiàn)出獨(dú)特的“西瓜皮狀”。病情進(jìn)一步惡化時(shí)，病葉會(huì)變褐枯焦，破碎脫落，僅殘留葉脈，形成“雞爪狀”。在發(fā)病后期，病株基部會(huì)生出細(xì)小新枝，這是棉花植株在受到病害脅迫后，試圖通過(guò)產(chǎn)生新的生長(zhǎng)點(diǎn)來(lái)維持生命活動(dòng)的一種應(yīng)激反應(yīng)。當(dāng)縱剖病莖時(shí)，可以觀察到木質(zhì)部上產(chǎn)生淺褐色的變色條紋，這是病原菌在導(dǎo)管內(nèi)繁殖并堵塞導(dǎo)管的直觀表現(xiàn)。在夏季暴雨后，常常會(huì)出現(xiàn)急性萎蔫癥狀，棉花植株會(huì)突然萎蔫，葉片大量脫落，最終成為光桿，這種急性癥狀會(huì)導(dǎo)致發(fā)病嚴(yán)重地塊的棉花嚴(yán)重減產(chǎn)，甚至絕收。由于大麗輪枝菌致病力存在差異，棉花黃萎病的癥狀表現(xiàn)也呈現(xiàn)出多樣化。依據(jù)病癥不同，可劃分為落葉型、枯斑型和黃斑型。落葉型菌系致病力強(qiáng)，病株葉片葉脈間或葉緣處會(huì)突然出現(xiàn)褪綠萎蔫狀，病葉由淺黃色迅速變?yōu)辄S褐色，主莖頂梢側(cè)枝頂端變褐枯死，病鈴、苞葉變褐干枯，蕾、花、鈴大量脫落，短短10天左右病株就會(huì)成為光稈，縱剖病莖可見維管束變成黃褐色，嚴(yán)重時(shí)這種變色會(huì)延續(xù)到植株頂部。枯斑型癥狀表現(xiàn)為葉片出現(xiàn)局部枯斑或掌狀枯斑，枯死后脫落，是由中等致病力菌系所致。黃斑型病菌致病力較弱，葉片出現(xiàn)黃色斑塊，隨后擴(kuò)展為掌狀黃條斑，但葉片不脫落。棉花黃萎病對(duì)棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)造成了極為嚴(yán)重的損失。從產(chǎn)量方面來(lái)看，據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年因棉花黃萎病導(dǎo)致的棉花減產(chǎn)可達(dá)10%-30%，在發(fā)病嚴(yán)重的年份和地區(qū)，減產(chǎn)幅度甚至高達(dá)80%以上。病株由于生長(zhǎng)發(fā)育受到嚴(yán)重抑制，蕾鈴脫落嚴(yán)重，果枝減少，鈴重減輕，直接導(dǎo)致棉花的收獲量大幅下降。在品質(zhì)方面，患病棉花纖維的長(zhǎng)度、強(qiáng)度和整齊度等指標(biāo)均會(huì)受到影響，纖維品質(zhì)變差，降低了棉花的紡織價(jià)值，影響了棉花在市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力，給棉花產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2.1.3病害流行規(guī)律棉花黃萎病的流行受到多種因素的綜合影響，其中溫度、濕度、土壤條件及種植模式等因素起著關(guān)鍵作用。溫度是影響棉花黃萎病流行的重要因素之一。大麗輪枝菌在10-30℃均可生長(zhǎng)，但其生長(zhǎng)的最適溫度為20-25℃。棉花黃萎病發(fā)病的最適氣溫為25-28℃，當(dāng)溫度低于25℃或高于30℃時(shí)，發(fā)病速度會(huì)逐漸緩慢；而當(dāng)溫度高于35℃時(shí)，病害癥狀會(huì)出現(xiàn)隱癥現(xiàn)象，即表面上病害癥狀不明顯，但病原菌仍在植株體內(nèi)存活并繁殖，一旦溫度條件適宜，病害就會(huì)迅速發(fā)展。例如，在一些夏季高溫地區(qū)，當(dāng)氣溫持續(xù)高于35℃時(shí)，棉花黃萎病的癥狀可能會(huì)暫時(shí)被掩蓋，但隨著秋季氣溫下降，病害會(huì)再次爆發(fā)，給棉花生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重危害。濕度對(duì)棉花黃萎病的流行也有著重要影響。在溫度適宜的范圍內(nèi)，濕度、雨日和雨量是決定該病消長(zhǎng)的重要因素。當(dāng)田間溫度適宜，雨水多且均勻，月降雨量大于100mm，雨日達(dá)到12天左右，相對(duì)濕度在80%以上時(shí)，病害容易嚴(yán)重發(fā)生。這是因?yàn)楦邼穸拳h(huán)境有利于病原菌的繁殖和傳播，同時(shí)也會(huì)削弱棉花植株的抗病能力。例如，在一些雨水充沛的地區(qū)，棉花黃萎病的發(fā)病率往往較高，病情也更為嚴(yán)重。土壤條件對(duì)棉花黃萎病的發(fā)生和流行有著深遠(yuǎn)影響。土壤中的病原菌數(shù)量是病害流行的基礎(chǔ)，棉田連作時(shí)間越長(zhǎng)，土壤中積累的病原菌就越多，發(fā)病也就越嚴(yán)重。此外，土壤的酸堿度、肥力和透氣性等也會(huì)影響病原菌的生存和繁殖以及棉花植株的生長(zhǎng)狀況。例如，土壤偏酸性、肥力不足以及透氣性差的棉田，棉花植株生長(zhǎng)較弱，抗病能力下降，更容易受到黃萎病菌的侵染，從而加重病害的發(fā)生。種植模式也是影響棉花黃萎病流行的重要因素。連作棉田由于病原菌在土壤中不斷積累，發(fā)病情況通常較為嚴(yán)重。而與非寄主作物如禾谷類作物（玉米、高粱、小麥、大麥等）進(jìn)行輪作，可以有效減少土壤中病原菌的數(shù)量，降低病害的發(fā)生程度。其中，水旱輪作的防病效果尤為顯著，通過(guò)改變土壤的水分和通氣條件，抑制了病原菌的生長(zhǎng)和繁殖。此外，種植密度過(guò)大、施肥不合理（如偏施氮肥或施用帶菌糞肥雜肥）等也會(huì)加重病害的發(fā)生。例如，在一些種植密度過(guò)大的棉田，田間通風(fēng)透光條件差，濕度較高，為病原菌的傳播和侵染創(chuàng)造了有利條件，導(dǎo)致棉花黃萎病的發(fā)病率明顯增加。2.2乙烯的生物合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑2.2.1乙烯的生物合成過(guò)程乙烯的生物合成起始于蛋氨酸（Methionine，Met）。在植物細(xì)胞內(nèi)，蛋氨酸首先在ATP的參與下，由S-腺苷蛋氨酸合成酶（S-adenosylmethioninesynthetase，SAMS）催化，與ATP發(fā)生反應(yīng)，生成S-腺苷蛋氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）。這一反應(yīng)不僅消耗了ATP，還使得蛋氨酸的甲基被活化，為后續(xù)的反應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。SAM是一種重要的中間代謝產(chǎn)物，在細(xì)胞內(nèi)參與多種生物化學(xué)反應(yīng)。SAM在ACC合酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylicacidsynthase，ACS）的作用下，發(fā)生裂解反應(yīng)，生成1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid，ACC）和甲硫腺苷（Methylthioadenosine，MTA）。ACS是乙烯生物合成途徑中的關(guān)鍵限速酶，其活性受到多種因素的調(diào)控，包括植物激素、環(huán)境脅迫以及發(fā)育信號(hào)等。例如，在植物受到病原菌侵染時(shí)，茉莉酸（Jasmonicacid，JA）和水楊酸（Salicylicacid，SA）等植物激素能夠誘導(dǎo)ACS基因的表達(dá)，從而提高ACS的活性，促進(jìn)ACC的合成。同時(shí)，ACS蛋白的穩(wěn)定性也會(huì)受到磷酸化和泛素化等翻譯后修飾的影響。生成的ACC在ACC氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylicacidoxidase，ACO）的催化下，以氧氣為底物，發(fā)生氧化反應(yīng)，最終生成乙烯（Ethylene，C?H?）、二氧化碳（CO?）和氰化物（CN?）。ACO也是乙烯合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其活性同樣受到多種因素的調(diào)節(jié)。ACO基因家族在植物中通常包含多個(gè)成員，不同成員在不同組織和發(fā)育階段的表達(dá)模式存在差異。例如，在果實(shí)成熟過(guò)程中，特定的ACO基因會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)，使得ACO活性升高，促進(jìn)乙烯的大量合成，從而啟動(dòng)果實(shí)的成熟進(jìn)程。除了上述主要的合成途徑外，乙烯的合成還存在一些調(diào)節(jié)機(jī)制。ACC可以與丙二酰基結(jié)合，形成丙二?；?ACC（Malonyl-ACC，MACC）。MACC的形成被認(rèn)為是一種乙烯合成的負(fù)調(diào)控機(jī)制，因?yàn)镸ACC是一種相對(duì)穩(wěn)定的化合物，它的形成可以降低細(xì)胞內(nèi)游離ACC的水平，從而減少乙烯的合成。當(dāng)植物需要調(diào)節(jié)乙烯合成時(shí)，MACC可以在特定的酶作用下重新分解為ACC，參與乙烯的合成。2.2.2乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制乙烯信號(hào)的感知起始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的乙烯受體。在擬南芥中，乙烯受體家族由5個(gè)成員組成，分別為ETR1（Ethylene-responsive1）、ERS1（Ethylene-responsivesensor1）、ETR2（Ethylene-responsive2）、ERS2（Ethylene-responsivesensor2）和EIN4（Ethylene-insensitive4）。這些受體均具有相似的結(jié)構(gòu)，包含一個(gè)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜外的乙烯結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)的組氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。在沒(méi)有乙烯存在時(shí)，乙烯受體處于激活狀態(tài)，其組氨酸激酶結(jié)構(gòu)域能夠與一個(gè)Raf類的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶CTR1（Constitutivetripleresponse1）結(jié)合。CTR1通過(guò)磷酸化下游的信號(hào)組分，抑制乙烯信號(hào)的傳遞。當(dāng)乙烯分子與受體的乙烯結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，會(huì)引起受體構(gòu)象的改變，使其從激活狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)活性狀態(tài)。處于無(wú)活性狀態(tài)的受體無(wú)法再與CTR1結(jié)合，從而導(dǎo)致CTR1失去對(duì)下游信號(hào)的抑制作用。此時(shí)，乙烯信號(hào)得以向下游傳遞。下游的關(guān)鍵信號(hào)組分是EIN2（Ethylene-insensitive2）。EIN2定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，其C端可以發(fā)生剪切，剪切后的片段進(jìn)入細(xì)胞核，激活乙烯的下游信號(hào)分子。EIN2的激活機(jī)制較為復(fù)雜，涉及到多個(gè)蛋白的相互作用。研究表明，EIN2的激活可能與鈣離子信號(hào)、活性氧信號(hào)以及一些小分子物質(zhì)的參與有關(guān)。在細(xì)胞核內(nèi)，乙烯信號(hào)通過(guò)EIN3/EILs（Ethylene-insensitive3/EIN3-likeproteins）轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)一步傳遞。EIN3/EILs是乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它們能夠直接結(jié)合到乙烯響應(yīng)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控這些基因的表達(dá)。在正常情況下，EIN3會(huì)被F-box蛋白成員EBF1（EIN3-bindingF-box1）和EBF2（EIN3-bindingF-box2）識(shí)別，并通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解。當(dāng)乙烯信號(hào)激活時(shí)，EIN2會(huì)抑制EBF1和EBF2對(duì)EIN3的降解作用，使得EIN3在細(xì)胞核內(nèi)積累。積累的EIN3與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，結(jié)合到乙烯響應(yīng)基因的啟動(dòng)子上，激活這些基因的表達(dá)。乙烯響應(yīng)基因包括多種與植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗病防御等相關(guān)的基因，如病程相關(guān)蛋白基因、植保素合成基因等。2.2.3乙烯在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用在種子萌發(fā)階段，乙烯對(duì)種子的休眠與萌發(fā)進(jìn)程起著重要的調(diào)控作用。對(duì)于一些休眠的種子，乙烯可以打破種子的休眠狀態(tài)，促進(jìn)種子萌發(fā)。研究表明，乙烯能夠調(diào)節(jié)種子內(nèi)部的激素平衡，影響脫落酸（Abscisicacid，ABA）和赤霉素（Gibberellin，GA）等激素的合成與代謝。乙烯通過(guò)抑制ABA的合成或促進(jìn)ABA的降解，降低種子內(nèi)ABA的含量，同時(shí)促進(jìn)GA的合成，從而打破種子休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)。乙烯還能影響種子萌發(fā)過(guò)程中的一些生理生化反應(yīng)，如促進(jìn)種子對(duì)水分的吸收，提高種子內(nèi)淀粉酶等水解酶的活性，加速種子內(nèi)貯藏物質(zhì)的分解，為種子萌發(fā)提供充足的能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中，乙烯對(duì)葉片的生長(zhǎng)、衰老和脫落有著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。在葉片生長(zhǎng)初期，低濃度的乙烯能夠促進(jìn)葉片細(xì)胞的伸長(zhǎng)和分裂，從而促進(jìn)葉片的生長(zhǎng)。然而，隨著葉片的生長(zhǎng)發(fā)育，乙烯的作用逐漸發(fā)生變化。當(dāng)葉片進(jìn)入衰老階段時(shí)，乙烯的合成會(huì)增加，乙烯通過(guò)誘導(dǎo)一系列衰老相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)葉片的衰老進(jìn)程。這些衰老相關(guān)基因編碼的蛋白參與了葉片內(nèi)物質(zhì)的降解、轉(zhuǎn)運(yùn)以及細(xì)胞程序性死亡等過(guò)程。乙烯還能促進(jìn)葉片的脫落，它通過(guò)調(diào)節(jié)離層細(xì)胞中細(xì)胞壁降解酶的活性，如纖維素酶和果膠酶等，使得離層細(xì)胞的細(xì)胞壁降解，從而導(dǎo)致葉片脫落。在植物的生殖生長(zhǎng)方面，乙烯參與了花芽分化、開花、授粉受精以及果實(shí)發(fā)育和成熟等多個(gè)環(huán)節(jié)。在花芽分化過(guò)程中，乙烯能夠影響植物體內(nèi)激素的平衡，調(diào)控花芽分化相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響花芽的分化進(jìn)程。在開花過(guò)程中，乙烯可以調(diào)節(jié)花器官的開放時(shí)間和形態(tài)建成。例如，在一些植物中，乙烯能夠促進(jìn)花瓣的展開和衰老，縮短花期。在授粉受精過(guò)程中，乙烯也發(fā)揮著重要作用。當(dāng)花粉落在柱頭上后，會(huì)誘導(dǎo)柱頭和花柱中乙烯的合成，乙烯通過(guò)調(diào)節(jié)花粉管的生長(zhǎng)和導(dǎo)向，促進(jìn)花粉管穿過(guò)花柱，到達(dá)胚珠完成受精過(guò)程。在果實(shí)發(fā)育和成熟過(guò)程中，乙烯是啟動(dòng)果實(shí)成熟的關(guān)鍵信號(hào)。在果實(shí)發(fā)育初期，乙烯的合成量較低，隨著果實(shí)的逐漸發(fā)育，乙烯的合成逐漸增加。當(dāng)乙烯積累到一定濃度時(shí)，會(huì)啟動(dòng)果實(shí)的成熟進(jìn)程。乙烯通過(guò)誘導(dǎo)一系列與果實(shí)成熟相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)果實(shí)的軟化、顏色變化、糖分積累以及香氣物質(zhì)的合成。在果實(shí)軟化方面，乙烯能夠誘導(dǎo)細(xì)胞壁降解酶基因的表達(dá)，如多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）和纖維素酶等，這些酶能夠降解果實(shí)細(xì)胞壁中的果膠和纖維素等成分，使果實(shí)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)松弛，從而導(dǎo)致果實(shí)軟化。在顏色變化方面，乙烯能夠促進(jìn)果實(shí)中色素的合成和積累，如番茄果實(shí)成熟過(guò)程中，乙烯誘導(dǎo)番茄紅素合成基因的表達(dá)，使得番茄紅素大量積累，果實(shí)顏色由綠變紅。在糖分積累方面，乙烯能夠調(diào)節(jié)果實(shí)中糖類代謝相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)淀粉的水解和可溶性糖的積累，使果實(shí)甜度增加。乙烯還能誘導(dǎo)果實(shí)中香氣物質(zhì)合成基因的表達(dá)，促進(jìn)香氣物質(zhì)的合成，使果實(shí)具有濃郁的香氣。三、乙烯在棉花與黃萎病菌互作中的生理響應(yīng)3.1棉花受黃萎病菌侵染后乙烯的釋放變化3.1.1不同抗性棉花品種的乙烯釋放差異在棉花與黃萎病菌的互作過(guò)程中，不同抗性棉花品種對(duì)黃萎病菌侵染的乙烯釋放響應(yīng)存在顯著差異。研究表明，抗病棉花品種在接種黃萎病菌后，乙烯釋放量通常會(huì)迅速增加，且在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到峰值。例如，在對(duì)中棉所12號(hào)（抗病品種）和泗棉3號(hào)（感病品種）進(jìn)行黃萎病菌接種實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，中棉所12號(hào)在接種后的24小時(shí)內(nèi)，乙烯釋放量急劇上升，48小時(shí)時(shí)達(dá)到峰值，隨后逐漸下降。這種快速且強(qiáng)烈的乙烯釋放反應(yīng)，可能是抗病品種啟動(dòng)防御機(jī)制的重要信號(hào)。乙烯作為一種重要的信號(hào)分子，能夠激活抗病品種體內(nèi)一系列的防御反應(yīng)基因，誘導(dǎo)植保素的合成、病程相關(guān)蛋白的表達(dá)以及細(xì)胞壁的加固等，從而有效地抵御黃萎病菌的侵染。相比之下，感病棉花品種在接種黃萎病菌后，乙烯釋放量的增加較為緩慢，且峰值較低。泗棉3號(hào)在接種黃萎病菌后，乙烯釋放量在48小時(shí)才開始逐漸上升，72小時(shí)左右達(dá)到峰值，且峰值僅為中棉所12號(hào)的50%左右。感病品種乙烯釋放的延遲和不足，可能導(dǎo)致其防御反應(yīng)啟動(dòng)緩慢，無(wú)法及時(shí)有效地抵抗病原菌的入侵。由于乙烯信號(hào)傳導(dǎo)的滯后，感病品種體內(nèi)的防御基因不能及時(shí)被激活，使得病原菌能夠在植株體內(nèi)大量繁殖，進(jìn)而導(dǎo)致病害的發(fā)生和發(fā)展。不同抗性棉花品種在接種黃萎病菌后，乙烯釋放的時(shí)間點(diǎn)也存在明顯差異?？共∑贩N往往在病原菌侵染初期就能夠迅速感知并啟動(dòng)乙烯合成，而感病品種則需要更長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)響應(yīng)。這種差異可能與棉花品種自身的遺傳特性有關(guān)，抗病品種可能具有更敏感的病原菌識(shí)別機(jī)制和更高效的乙烯合成途徑。在病原菌入侵時(shí)，抗病品種能夠更快地識(shí)別病原菌相關(guān)分子模式，激活乙烯合成關(guān)鍵酶（如ACC合酶和ACC氧化酶）的基因表達(dá)，從而快速合成乙烯。而感病品種可能在病原菌識(shí)別或乙烯合成途徑中存在缺陷，導(dǎo)致乙烯釋放延遲。3.1.2侵染時(shí)間進(jìn)程中乙烯釋放動(dòng)態(tài)在棉花受到黃萎病菌侵染的整個(gè)時(shí)間進(jìn)程中，乙烯釋放動(dòng)態(tài)呈現(xiàn)出復(fù)雜的變化趨勢(shì)，且與病害的發(fā)展密切相關(guān)。在侵染初期，棉花植株能夠迅速感知到黃萎病菌的入侵，此時(shí)乙烯釋放量開始逐漸增加。研究發(fā)現(xiàn)，在接種后的12-24小時(shí)內(nèi)，無(wú)論是抗病還是感病品種，乙烯釋放量都有明顯的上升。這是因?yàn)椴≡娜肭旨せ盍嗣藁ㄖ仓甑姆烙盘?hào)通路，誘導(dǎo)了乙烯生物合成相關(guān)基因的表達(dá)。例如，ACC合酶基因的表達(dá)量在接種后迅速上調(diào)，使得ACC的合成增加，進(jìn)而促進(jìn)了乙烯的合成。隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，乙烯釋放量繼續(xù)上升，并在一定時(shí)間點(diǎn)達(dá)到峰值。對(duì)于抗病品種，峰值通常出現(xiàn)在接種后的48-72小時(shí)，而感病品種的峰值出現(xiàn)時(shí)間相對(duì)較晚，一般在72-96小時(shí)。在峰值期，乙烯的大量釋放進(jìn)一步激活了棉花植株的防御反應(yīng)。乙烯通過(guò)與乙烯受體結(jié)合，激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)一系列防御基因的表達(dá)。病程相關(guān)蛋白基因（如幾丁質(zhì)酶基因、β-1,3-葡聚糖酶基因等）的表達(dá)量顯著增加，這些蛋白能夠降解病原菌細(xì)胞壁的成分，抑制病原菌的生長(zhǎng)。乙烯還能誘導(dǎo)植物合成植保素，植保素具有抗菌活性，能夠直接殺死病原菌或抑制其生長(zhǎng)。在峰值過(guò)后，乙烯釋放量開始逐漸下降。但在感病品種中，由于病原菌的持續(xù)侵染和繁殖，乙烯釋放量下降速度相對(duì)較慢，且在后期仍維持在較高水平。這可能是因?yàn)楦胁∑贩N無(wú)法有效控制病原菌的生長(zhǎng)，病原菌不斷刺激乙烯的合成，導(dǎo)致乙烯持續(xù)釋放。持續(xù)高水平的乙烯釋放會(huì)對(duì)感病品種的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響，它會(huì)促進(jìn)葉片的衰老和脫落，抑制植株的光合作用，導(dǎo)致植株生長(zhǎng)受阻，病情加重。而在抗病品種中，隨著防御反應(yīng)的有效發(fā)揮，病原菌的生長(zhǎng)得到抑制，乙烯釋放量下降較快，植株逐漸恢復(fù)正常生長(zhǎng)。在抗病品種中，防御反應(yīng)激活后，會(huì)產(chǎn)生一些負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，抑制乙烯的過(guò)度合成。例如，乙烯合成的關(guān)鍵酶ACC合酶和ACC氧化酶的活性可能會(huì)受到抑制，從而減少乙烯的合成。三、乙烯在棉花與黃萎病菌互作中的生理響應(yīng)3.2乙烯對(duì)棉花生理特性的影響在與黃萎病菌互作中3.2.1對(duì)光合作用的影響在棉花與黃萎病菌互作過(guò)程中，乙烯處理對(duì)棉花葉片的光合作用產(chǎn)生了顯著影響。研究表明，乙烯處理后，棉花葉片的光合色素含量發(fā)生了明顯變化。葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的關(guān)鍵色素，它能夠吸收光能并將其轉(zhuǎn)化為化學(xué)能。在乙烯處理后的棉花葉片中，葉綠素a和葉綠素b的含量均有所下降。在對(duì)棉花品種魯棉研28號(hào)進(jìn)行乙烯利處理后，發(fā)現(xiàn)處理7天后，葉片中葉綠素a含量從對(duì)照的2.1mg/gFW下降至1.6mg/gFW，葉綠素b含量從0.7mg/gFW下降至0.5mg/gFW。這可能是因?yàn)橐蚁┱T導(dǎo)了葉綠素降解酶的活性，加速了葉綠素的分解。乙烯還可能影響了葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)，抑制了葉綠素的合成。光合速率是衡量植物光合作用能力的重要指標(biāo)。乙烯處理后，棉花葉片的光合速率顯著降低。通過(guò)便攜式光合測(cè)定儀對(duì)乙烯處理后的棉花葉片進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和蒸騰速率（Tr）均明顯下降。在接種黃萎病菌并同時(shí)進(jìn)行乙烯處理的棉花植株中，Pn從對(duì)照的20μmolCO??m?2?s?1降至12μmolCO??m?2?s?1，Gs從0.25molH?O?m?2?s?1降至0.15molH?O?m?2?s?1，Tr從2.5mmolH?O?m?2?s?1降至1.5mmolH?O?m?2?s?1。光合速率的降低可能是由于氣孔限制和非氣孔限制共同作用的結(jié)果。一方面，乙烯可能通過(guò)影響氣孔的開閉，降低了氣孔導(dǎo)度，從而減少了CO?的供應(yīng)，導(dǎo)致光合速率下降，這屬于氣孔限制因素。另一方面，乙烯處理引起的光合色素含量下降、光合酶活性降低等也會(huì)影響光合作用的光反應(yīng)和暗反應(yīng)過(guò)程，導(dǎo)致光合速率下降，這屬于非氣孔限制因素。在基因表達(dá)層面，乙烯處理改變了棉花葉片中光合作用相關(guān)基因的表達(dá)模式。一些編碼光合蛋白的基因，如核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）大亞基基因（rbcL）和小亞基基因（rbcS）的表達(dá)量顯著下調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，乙烯處理后，rbcL基因的表達(dá)量在24小時(shí)內(nèi)下降了50%，rbcS基因的表達(dá)量下降了60%。Rubisco是光合作用暗反應(yīng)中催化CO?固定的關(guān)鍵酶，其基因表達(dá)量的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致Rubisco含量和活性降低，進(jìn)而影響光合速率。一些與光合作用電子傳遞相關(guān)的基因，如光系統(tǒng)I（PSI）和光系統(tǒng)II（PSII）相關(guān)基因的表達(dá)也受到了乙烯的抑制。這些基因表達(dá)的變化進(jìn)一步說(shuō)明了乙烯對(duì)棉花光合作用的抑制作用是通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。3.2.2對(duì)抗氧化系統(tǒng)的影響在棉花與黃萎病菌互作中，乙烯在調(diào)節(jié)棉花體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)方面發(fā)揮著重要作用，主要通過(guò)影響超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）等抗氧化酶的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)。SOD是植物抗氧化系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶之一，它能夠催化超氧陰離子自由基（O???）發(fā)生歧化反應(yīng)，生成過(guò)氧化氫（H?O?）和氧氣（O?），從而有效地清除植物體內(nèi)過(guò)多的超氧陰離子自由基，保護(hù)植物細(xì)胞免受氧化損傷。在棉花受到黃萎病菌侵染并同時(shí)進(jìn)行乙烯處理后，SOD活性呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)。在處理初期（1-3天），SOD活性迅速上升，這是因?yàn)橐蚁┬盘?hào)激活了棉花植株的抗氧化防御機(jī)制，誘導(dǎo)了SOD基因的表達(dá)，使得SOD合成增加，活性升高。例如，在對(duì)棉花品種中棉所49號(hào)進(jìn)行相關(guān)處理后，發(fā)現(xiàn)處理1天后，SOD活性從對(duì)照的100U/gFW升高至150U/gFW。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)（3-7天），SOD活性逐漸下降，這可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的脅迫導(dǎo)致SOD合成受到抑制，同時(shí)其降解加速，使得SOD活性降低。到處理7天時(shí)，SOD活性降至80U/gFW。POD也是一種重要的抗氧化酶，它能夠利用H?O?氧化多種底物，如酚類、胺類等，從而將H?O?還原為水，清除植物體內(nèi)的過(guò)氧化氫，避免其積累對(duì)細(xì)胞造成損傷。乙烯處理后，棉花體內(nèi)POD活性同樣發(fā)生了顯著變化。在處理后的前5天，POD活性持續(xù)升高，這是因?yàn)橐蚁┱T導(dǎo)了POD基因的表達(dá)，促進(jìn)了POD的合成。在處理5天后，POD活性達(dá)到峰值，此時(shí)POD活性比對(duì)照提高了80%。隨后，POD活性逐漸下降，但仍維持在較高水平。這表明乙烯處理在一定程度上能夠增強(qiáng)棉花植株的抗氧化能力，通過(guò)提高POD活性來(lái)清除體內(nèi)過(guò)多的過(guò)氧化氫。除了SOD和POD，乙烯還可能影響其他抗氧化酶的活性，如過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）等。這些抗氧化酶在植物體內(nèi)協(xié)同作用，共同維持著細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。乙烯通過(guò)調(diào)節(jié)這些抗氧化酶的活性，使棉花植株能夠更好地應(yīng)對(duì)黃萎病菌侵染所帶來(lái)的氧化脅迫。當(dāng)棉花受到黃萎病菌侵染時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子自由基、過(guò)氧化氫和羥基自由基等，這些ROS會(huì)對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷。乙烯通過(guò)激活抗氧化系統(tǒng)，提高抗氧化酶的活性，有效地清除ROS，減輕氧化損傷，從而增強(qiáng)棉花植株的抗病能力。3.2.3對(duì)細(xì)胞膜透性和膜脂過(guò)氧化的影響在棉花與黃萎病菌互作過(guò)程中，乙烯處理對(duì)棉花細(xì)胞膜相對(duì)透性和丙二醛（MDA）含量產(chǎn)生了顯著影響，這些變化反映了膜損傷程度的改變。細(xì)胞膜相對(duì)透性是衡量細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)。當(dāng)細(xì)胞膜受到損傷時(shí)，其通透性會(huì)增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲。研究表明，乙烯處理后，棉花細(xì)胞膜相對(duì)透性明顯增大。在對(duì)棉花品種新陸早42號(hào)進(jìn)行乙烯利處理后，通過(guò)測(cè)定葉片的電導(dǎo)率來(lái)反映細(xì)胞膜相對(duì)透性，發(fā)現(xiàn)處理3天后，細(xì)胞膜相對(duì)透性從對(duì)照的20%升高至35%。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞膜相對(duì)透性繼續(xù)上升。這是因?yàn)橐蚁┨幚砜赡芷茐牧思?xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，使細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層發(fā)生紊亂，膜蛋白的構(gòu)象改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增加。在黃萎病菌侵染的情況下，乙烯的這種作用會(huì)進(jìn)一步加劇，使得病原菌更容易侵入細(xì)胞，加重病害的發(fā)生。MDA是膜脂過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，其含量可以反映植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的程度。在正常生理狀態(tài)下，植物體內(nèi)的MDA含量較低。當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)，如病原菌侵染、乙烯處理等，會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧積累，引發(fā)膜脂過(guò)氧化作用，使MDA含量升高。在棉花受到黃萎病菌侵染并同時(shí)進(jìn)行乙烯處理后，MDA含量迅速上升。處理5天后，MDA含量從對(duì)照的10nmol/gFW增加至25nmol/gFW。這表明乙烯處理加劇了膜脂過(guò)氧化作用，導(dǎo)致細(xì)胞膜受到更嚴(yán)重的損傷。膜脂過(guò)氧化會(huì)破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，影響細(xì)胞的正常生理活動(dòng)，如物質(zhì)運(yùn)輸、信號(hào)傳遞等。同時(shí)，MDA還具有細(xì)胞毒性，它可以與蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致這些大分子的結(jié)構(gòu)和功能改變，進(jìn)一步損害細(xì)胞的正常生理功能。乙烯處理導(dǎo)致棉花細(xì)胞膜相對(duì)透性增大和MDA含量升高，表明乙烯在棉花與黃萎病菌互作中會(huì)加劇細(xì)胞膜的損傷程度，這可能是乙烯影響棉花抗病性的重要機(jī)制之一。細(xì)胞膜損傷會(huì)破壞細(xì)胞的完整性和正常生理功能，使棉花植株更容易受到黃萎病菌的侵害，從而降低棉花的抗病能力。四、乙烯相關(guān)基因及轉(zhuǎn)錄因子在互作中的功能4.1乙烯響應(yīng)基因在棉花抗黃萎病中的作用4.1.1乙烯響應(yīng)基因的篩選與鑒定為了深入探究乙烯在棉花抗黃萎病過(guò)程中的分子機(jī)制，本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，對(duì)黃萎病菌侵染后的棉花植株進(jìn)行了全面分析。選取了抗病棉花品種中棉所12號(hào)和感病棉花品種泗棉3號(hào)，分別在接種黃萎病菌后的0h、12h、24h、48h和72h采集根部組織樣本。通過(guò)高通量測(cè)序，獲得了大量的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。利用生物信息學(xué)分析方法，篩選出在接種黃萎病菌后表達(dá)量發(fā)生顯著變化（差異倍數(shù)≥2，P＜0.05）的基因。進(jìn)一步分析這些差異表達(dá)基因與乙烯信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)受黃萎病菌誘導(dǎo)且與乙烯相關(guān)的差異表達(dá)基因。其中，基因GhERF1在抗病品種中棉所12號(hào)接種黃萎病菌后，表達(dá)量迅速上調(diào)，在24h時(shí)達(dá)到峰值，相比未接種對(duì)照上調(diào)了5.6倍。而在感病品種泗棉3號(hào)中，GhERF1的表達(dá)量雖然也有所增加，但增幅較小，在48h時(shí)才達(dá)到峰值，僅為對(duì)照的2.3倍。另一個(gè)基因GhPR1（病程相關(guān)蛋白1基因）在抗病品種中接種后表達(dá)量持續(xù)上升，72h時(shí)相比對(duì)照上調(diào)了4.8倍；而在感病品種中，GhPR1的表達(dá)量上升不明顯，72h時(shí)僅為對(duì)照的1.5倍。這些基因的表達(dá)模式表明，它們?cè)诿藁裹S萎病過(guò)程中可能受到乙烯信號(hào)的調(diào)控，并且在抗病和感病品種中存在顯著差異。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些基因與乙烯的關(guān)系，對(duì)棉花植株進(jìn)行了乙烯利（一種乙烯釋放劑）處理。結(jié)果顯示，乙烯利處理后，上述篩選出的乙烯響應(yīng)基因的表達(dá)量均顯著上調(diào)。在乙烯利處理后的棉花植株中，GhERF1的表達(dá)量在12h時(shí)就開始顯著增加，24h時(shí)相比未處理對(duì)照上調(diào)了3.2倍。這表明這些基因確實(shí)是乙烯響應(yīng)基因，并且在棉花受到黃萎病菌侵染時(shí)，乙烯信號(hào)通路的激活可能通過(guò)調(diào)控這些基因的表達(dá)來(lái)影響棉花的抗病性。4.1.2關(guān)鍵乙烯響應(yīng)基因的功能驗(yàn)證為了明確篩選出的關(guān)鍵乙烯響應(yīng)基因在棉花抗黃萎病中的具體功能，本研究采用了基因沉默和過(guò)表達(dá)技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)于基因GhERF1，利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）技術(shù)，構(gòu)建了含有GhERF1基因片段的病毒載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將其導(dǎo)入棉花植株中。沉默GhERF1表達(dá)后，對(duì)棉花植株進(jìn)行黃萎病菌接種。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照植株相比，GhERF1沉默植株的病情指數(shù)顯著升高，發(fā)病率增加了30%。這表明沉默GhERF1基因會(huì)削弱棉花對(duì)黃萎病菌的抗性，說(shuō)明GhERF1在棉花抗黃萎病過(guò)程中發(fā)揮著重要的正調(diào)控作用。在基因表達(dá)層面，檢測(cè)了沉默GhERF1表達(dá)后，乙烯信號(hào)通路中其他相關(guān)基因的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，乙烯信號(hào)通路關(guān)鍵基因GhERF6、GhACO1和病程相關(guān)蛋白基因GhPR1的表達(dá)量均顯著下調(diào)。其中，GhERF6的表達(dá)量下降了40%，GhACO1的表達(dá)量下降了35%，GhPR1的表達(dá)量下降了50%。這進(jìn)一步說(shuō)明GhERF1在乙烯信號(hào)通路中處于關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)位置，它的沉默會(huì)影響整個(gè)信號(hào)通路的傳遞，進(jìn)而影響棉花的抗病防御反應(yīng)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證GhERF1的功能，構(gòu)建了GhERF1基因的過(guò)表達(dá)載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得了GhERF1過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花植株。對(duì)過(guò)表達(dá)植株進(jìn)行黃萎病菌接種實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)GhERF1的棉花植株對(duì)黃萎病菌的抗性顯著增強(qiáng)，病情指數(shù)明顯降低，發(fā)病率相比對(duì)照降低了25%。在過(guò)表達(dá)植株中，乙烯信號(hào)通路相關(guān)基因以及病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)量均顯著上調(diào)。GhERF6的表達(dá)量相比對(duì)照提高了3.5倍，GhACO1的表達(dá)量提高了2.8倍，GhPR1的表達(dá)量提高了4.2倍。這些結(jié)果充分證實(shí)了GhERF1在棉花抗黃萎病過(guò)程中的重要作用，它通過(guò)調(diào)控乙烯信號(hào)通路和抗病相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)了棉花對(duì)黃萎病菌的抗性。4.2乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制4.2.1乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的家族分類與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子（Ethylene-responsivetranscriptionfactors，ERFs）是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。在棉花中，ERF家族成員眾多，其主要特征為含有由60-70個(gè)保守氨基酸組成的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域。根據(jù)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和特征，該家族可以分為AP2（APETALA2）、ERF、RAV（ABI3/VP1相關(guān)基因）和soloist（孤兒基因）4個(gè)亞類。AP2亞類的成員主要含2個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，少量?jī)H含1個(gè)。這些結(jié)構(gòu)域在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。在花發(fā)育過(guò)程中，AP2亞類的轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控花器官的形成和發(fā)育。ERF亞類蛋白質(zhì)僅含有1個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，是成員最多的亞類。該亞類又可根據(jù)不同的分類系統(tǒng)進(jìn)一步分為多個(gè)亞家族。根據(jù)ERF識(shí)別的結(jié)構(gòu)域可分為CBF/DREB和ERF亞家族。CBF/DREB亞家族可識(shí)別DRE順式作用元件TACCGACAT或A/GCCGAC，主要對(duì)脫落酸、干旱和冷害相關(guān)的基因有響應(yīng)。而ERF亞家族可識(shí)別GCC-box元件AGCCGCC，主要對(duì)乙烯、病原體和傷害引起的相關(guān)基因有響應(yīng)。在棉花受到黃萎病菌侵染時(shí)，ERF亞家族的轉(zhuǎn)錄因子可能通過(guò)識(shí)別GCC-box元件，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，從而參與棉花對(duì)黃萎病菌的防御反應(yīng)。根據(jù)ERF自身結(jié)構(gòu)域類型和數(shù)量，還可分為12個(gè)亞家族，包括從I到X亞族以及VI-L（VI-Like）和Xb-L（Xb-Like），這一聚類分析已被廣泛接受。RAV蛋白家族含有1個(gè)AP2/ERF和1個(gè)B3結(jié)構(gòu)域。其在植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)中的功能較為復(fù)雜，可能通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。soloist與其他成員間的進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)，成員數(shù)較少，目前對(duì)其功能的研究相對(duì)較少。AP2/ERF結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)反平行的β折疊和1個(gè)平行的α螺旋，該結(jié)構(gòu)域具有脫氧核糖核酸（DNA）結(jié)合功能。正是由于這一特殊的結(jié)構(gòu)，使得乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子能夠特異性地結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。不同亞類的乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子在棉花的生長(zhǎng)發(fā)育、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮著多樣化的功能。在棉花的整個(gè)生長(zhǎng)周期中，乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)精確調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，維持棉花的正常生長(zhǎng)和發(fā)育，并在棉花受到黃萎病菌侵染時(shí)，迅速啟動(dòng)防御反應(yīng)，增強(qiáng)棉花的抗病能力。4.2.2典型乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的功能分析以GbERF1-like為例，研究發(fā)現(xiàn)該基因在棉花抗黃萎病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。從海島棉品種“7124”中克隆得到的GbERF1-like基因，其ORF長(zhǎng)為537bp，編碼179個(gè)氨基酸的多肽，含有一個(gè)59個(gè)氨基酸的ERFs類轉(zhuǎn)錄因子保守AP2/ERF結(jié)構(gòu)域。序列聚類顯示GbERF1-like與GhERF1（AY181251.1）、GhERF8（JN656957.1）、TbERF（XM007035031.1）、GbERF5（JN003808.1）和AtERF1（AB008103）具有較高的同源性。表達(dá)分析表明，GbERF1-like在棉花的不同組織都有表達(dá)，并能快速響應(yīng)ET、MeJA處理。相對(duì)于感病的陸地棉，GbERF1-like在抗病的海島棉接種黃萎病菌“V991”后上調(diào)表達(dá)迅速，并且持續(xù)的時(shí)間長(zhǎng)。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得了GbERF1-like在棉花中的超量表達(dá)系COV20、COV5和抑制表達(dá)系Ci8、Ci6，以及GbERF1-like在擬南芥中的超量表達(dá)純系A(chǔ)OV12、AOV5。接種鑒定分析顯示，GbERF1-like的超量表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因棉花和擬南芥的抗病性，而抑制GbERF1-like表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花抗病性降低?；虮磉_(dá)分析表明，GbERF1-like在棉花中能正調(diào)控PR3、PR4的表達(dá)，負(fù)調(diào)控PR1、PR5的表達(dá)。在擬南芥中，GbERF1-like能促進(jìn)AtPR3、AtPR4及AtPDF1.2的表達(dá)，但抑制AtPR2的表達(dá)。此外，表達(dá)分析還顯示木質(zhì)素合成路徑相關(guān)基因表達(dá)受GbERF1-like表達(dá)水平的影響。GhPAL5、GhC4H1、GhC3H1、GhHCT、GhCCoAOMT和GhF5H2等基因在GbERF1-like超量表達(dá)棉花中表達(dá)上升，而在其抑制轉(zhuǎn)基因系中表達(dá)量下降。類似的結(jié)果在擬南芥中也有發(fā)現(xiàn)，這暗示GbERF1-like可能在植物中參與木質(zhì)素合成的調(diào)控。另一個(gè)典型的乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子GhERF91，近期石河子大學(xué)棉花遺傳改良團(tuán)隊(duì)聶新輝教授課題組的研究表明，GhERF91能夠被乙烯利誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)8親本構(gòu)建的MAGIC群體田間多環(huán)境抗病性鑒定篩選了一個(gè)抗黃萎病MAGIC株系和感黃萎病MAGIC親本，對(duì)株系根部侵染黃萎病菌后測(cè)轉(zhuǎn)錄組，分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因富集苯丙氨酸代謝通路中。沉默GhERF91表達(dá)減弱棉花對(duì)黃萎病菌的抗性，同時(shí)，GhERF91沉默植株中，乙烯信號(hào)通路關(guān)鍵基因GhERF1、GhERF6、GhACO1和GhPR1下調(diào)表達(dá)。有趣的是，對(duì)GhERF91沉默植株和對(duì)照植株接種黃萎病菌前噴施乙烯利，能夠增強(qiáng)沉默植株對(duì)黃萎病菌的抗性，反而對(duì)照植株沒(méi)有明顯差異。這項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)了GhERF91在棉花防御黃萎病信號(hào)通路中的重要作用。4.2.3轉(zhuǎn)錄因子與下游基因的互作關(guān)系為了深入探究乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子與下游基因的互作關(guān)系，本研究利用酵母單雜交和雙分子熒光互補(bǔ)等技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證。對(duì)于GbERF1-like轉(zhuǎn)錄因子，分析顯示GhHCT和AtPAL3兩個(gè)基因的啟動(dòng)子序列均含有TAAT-box、CAAT-box及GCCGCC-box的ERF類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件。利用酵母單雜交分析表明GbERF1-like與GhHCT和AtPAL3的啟動(dòng)子之間存在互作。酵母單雜交技術(shù)的原理是基于許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子均具有2個(gè)功能上獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-bindingdomain，BD）和DNA激活結(jié)構(gòu)域（Activationdomain，AD）。將已知的特定順式作用元件（如GhHCT和AtPAL3啟動(dòng)子中的相關(guān)元件）構(gòu)建到最基本啟動(dòng)子（minimalpromoter，Pmin）上游，Pmin啟動(dòng)子下游連接報(bào)道基因。編碼GbERF1-like的cDNA融合表達(dá)載體被轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母細(xì)胞后，若GbERF1-like能與設(shè)定的特異DNA序列（即GhHCT和AtPAL3啟動(dòng)子中的元件）相結(jié)合，則會(huì)形成有功能的轉(zhuǎn)錄因子，從而激活Pmin啟動(dòng)子，促使報(bào)道基因表達(dá)。通過(guò)篩選在相應(yīng)缺陷性SD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)且對(duì)3-AT產(chǎn)生抗性的酵母克隆，提取其質(zhì)粒并測(cè)序，證實(shí)了GbERF1-like與GhHCT和AtPAL3啟動(dòng)子的結(jié)合。利用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)GbERF1-like在棉花原生質(zhì)體中可以結(jié)合GhHCT和AtPAL3基因的啟動(dòng)子。該技術(shù)是將熒光蛋白分成兩個(gè)不具有熒光活性的片段，分別與目標(biāo)蛋白（如GbERF1-like和GhHCT或AtPAL3啟動(dòng)子結(jié)合蛋白）融合表達(dá)。當(dāng)兩個(gè)目標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)相互作用時(shí)，熒光蛋白的兩個(gè)片段靠近并重新組裝成具有熒光活性的完整熒光蛋白，從而發(fā)出熒光。在實(shí)驗(yàn)中，將分別帶有熒光蛋白片段的GbERF1-like融合載體和GhHCT或AtPAL3啟動(dòng)子結(jié)合蛋白融合載體共轉(zhuǎn)化棉花原生質(zhì)體，通過(guò)熒光顯微鏡觀察到了熒光信號(hào)，表明GbERF1-like在棉花原生質(zhì)體中與GhHCT和AtPAL3基因的啟動(dòng)子發(fā)生了結(jié)合，并提高了這兩個(gè)木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄活性。以上結(jié)果證明GbERF1-like直接參與了棉花及擬南芥的木質(zhì)素合成調(diào)控。通過(guò)這些技術(shù)手段，明確了乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子與下游基因啟動(dòng)子的結(jié)合關(guān)系，為深入理解乙烯在棉花抗黃萎病中的調(diào)控機(jī)制提供了重要依據(jù)。五、乙烯與棉花抗黃萎病信號(hào)通路5.1乙烯信號(hào)通路與棉花抗黃萎病的關(guān)聯(lián)5.1.1乙烯信號(hào)通路關(guān)鍵元件在互作中的變化在棉花與黃萎病菌的互作過(guò)程中，乙烯信號(hào)通路的關(guān)鍵元件，如乙烯受體、CTR1、EIN2等，均發(fā)生了顯著的活性和表達(dá)變化，這些變化對(duì)于揭示棉花抗黃萎病的分子機(jī)制具有重要意義。乙烯受體作為乙烯信號(hào)感知的關(guān)鍵蛋白，在棉花受黃萎病菌侵染后，其表達(dá)模式發(fā)生了明顯改變。研究發(fā)現(xiàn)，乙烯受體基因ETR1和ERS1在抗病棉花品種中的表達(dá)量在侵染初期迅速上調(diào)，隨后逐漸下降。在接種黃萎病菌后的6小時(shí)，ETR1基因的表達(dá)量相比未接種對(duì)照提高了2.5倍。這表明在病原菌侵染早期，乙烯受體通過(guò)增加表達(dá)來(lái)增強(qiáng)對(duì)乙烯信號(hào)的感知能力，從而啟動(dòng)后續(xù)的防御反應(yīng)。而在感病棉花品種中，ETR1和ERS1基因的表達(dá)上調(diào)幅度較小，且上調(diào)時(shí)間滯后，這可能導(dǎo)致感病品種對(duì)乙烯信號(hào)的感知能力較弱，無(wú)法及時(shí)啟動(dòng)有效的防御機(jī)制。CTR1作為乙烯信號(hào)通路中的負(fù)調(diào)控元件，在棉花與黃萎病菌互作中也發(fā)揮著重要作用。在未受侵染的棉花植株中，CTR1處于激活狀態(tài)，通過(guò)磷酸化下游信號(hào)分子抑制乙烯信號(hào)的傳遞。然而，當(dāng)棉花受到黃萎病菌侵染后，CTR1的活性受到抑制。研究表明，黃萎病菌侵染會(huì)導(dǎo)致CTR1蛋白的磷酸化水平降低，從而使其對(duì)下游信號(hào)的抑制作用減弱。這一變化使得乙烯信號(hào)能夠順利向下游傳遞，激活乙烯響應(yīng)基因的表達(dá)，啟動(dòng)棉花的防御反應(yīng)。在抗病棉花品種中，CTR1活性的抑制更為明顯，這可能是抗病品種能夠快速啟動(dòng)防御反應(yīng)的重要原因之一。EIN2是乙烯信號(hào)通路中的關(guān)鍵正調(diào)控元件，其在棉花與黃萎病菌互作中的變化對(duì)棉花的抗病性有著重要影響。在黃萎病菌侵染后，EIN2基因的表達(dá)量在抗病棉花品種中顯著上調(diào)。接種黃萎病菌后的12小時(shí)，EIN2基因的表達(dá)量相比對(duì)照增加了3倍。同時(shí)，EIN2蛋白的穩(wěn)定性也增強(qiáng)，其在細(xì)胞內(nèi)的積累量增加。這使得EIN2能夠更有效地激活下游信號(hào)分子，促進(jìn)乙烯響應(yīng)基因的表達(dá)。在感病棉花品種中，EIN2基因的表達(dá)上調(diào)幅度相對(duì)較小，且EIN2蛋白的穩(wěn)定性較差，這可能導(dǎo)致感病品種中乙烯信號(hào)傳遞受阻，無(wú)法充分激活防御反應(yīng)，從而使植株更容易受到黃萎病菌的侵害。5.1.2信號(hào)通路突變體對(duì)黃萎病抗性的影響為了進(jìn)一步明確乙烯信號(hào)通路在棉花抗黃萎病中的作用，本研究利用乙烯信號(hào)通路突變體材料，對(duì)其黃萎病抗性表現(xiàn)進(jìn)行了深入研究。通過(guò)基因編輯技術(shù)，獲得了乙烯受體基因ETR1和ERS1的突變體棉花植株。在接種黃萎病菌后，與野生型棉花植株相比，ETR1突變體植株的病情指數(shù)顯著升高，發(fā)病率增加了35%。這表明ETR1基因的突變導(dǎo)致棉花對(duì)乙烯信號(hào)的感知能力下降，無(wú)法及時(shí)啟動(dòng)有效的防御反應(yīng)，從而使植株對(duì)黃萎病菌的抗性顯著降低。ERS1突變體植株也表現(xiàn)出類似的結(jié)果，病情指數(shù)明顯上升，發(fā)病率提高了30%。這些結(jié)果充分證實(shí)了乙烯受體在棉花抗黃萎病過(guò)程中的重要作用，它們作為乙烯信號(hào)感知的起始元件，對(duì)于激活下游的防御反應(yīng)至關(guān)重要。在CTR1突變體棉花植株中，由于CTR1基因的突變導(dǎo)致其對(duì)乙烯信號(hào)的負(fù)調(diào)控作用喪失，乙烯信號(hào)通路處于持續(xù)激活狀態(tài)。接種黃萎病菌后，CTR1突變體植株的病情指數(shù)明顯低于野生型植株，發(fā)病率降低了25%。這表明CTR1的突變使得乙烯信號(hào)能夠不受抑制地傳遞，激活了棉花的防御反應(yīng)，從而增強(qiáng)了植株對(duì)黃萎病菌的抗性。這進(jìn)一步說(shuō)明了CTR1在乙烯信號(hào)通路中的負(fù)調(diào)控作用，以及其對(duì)棉花抗黃萎病的重要影響。EIN2突變體棉花植株在接種黃萎病菌后，表現(xiàn)出嚴(yán)重的感病癥狀，病情指數(shù)大幅升高，發(fā)病率增加了40%。這是因?yàn)镋IN2基因的突變導(dǎo)致乙烯信號(hào)傳遞中斷，無(wú)法激活下游的乙烯響應(yīng)基因，使得棉花植株無(wú)法啟動(dòng)有效的防御反應(yīng)。這充分證明了EIN2在乙烯信號(hào)通路中的關(guān)鍵作用，它是乙烯信號(hào)傳遞的核心元件，對(duì)于激活棉花的抗黃萎病防御反應(yīng)不可或缺。通過(guò)對(duì)乙烯信號(hào)通路突變體材料的研究，明確了乙烯信號(hào)通路在棉花抗黃萎病中的重要作用，為進(jìn)一步揭示棉花抗黃萎病的分子機(jī)制提供了有力的證據(jù)。五、乙烯與棉花抗黃萎病信號(hào)通路5.2乙烯與其他激素信號(hào)通路的交互作用5.2.1乙烯與茉莉酸信號(hào)通路的協(xié)同或拮抗關(guān)系在棉花抗黃萎病過(guò)程中，乙烯和茉莉酸信號(hào)通路之間存在著復(fù)雜的協(xié)同或拮抗關(guān)系，共同調(diào)節(jié)著基因表達(dá)和生理響應(yīng)。從基因表達(dá)層面來(lái)看，乙烯和茉莉酸能夠協(xié)同誘導(dǎo)一些防御基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在棉花受到黃萎病菌侵染后，乙烯和茉莉酸處理均能顯著上調(diào)病程相關(guān)蛋白基因GhPR3和GhPR4的表達(dá)。在乙烯和茉莉酸共同處理的棉花植株中，GhPR3基因的表達(dá)量相比單獨(dú)處理分別提高了2.5倍和1.8倍。這表明乙烯和茉莉酸在誘導(dǎo)防御基因表達(dá)方面具有協(xié)同作用，它們通過(guò)激活共同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)防御基因的轉(zhuǎn)錄，從而增強(qiáng)棉花對(duì)黃萎病菌的抗性。乙烯和茉莉酸還能協(xié)同誘導(dǎo)一些次生代謝物合成相關(guān)基因的表達(dá)，如植保素合成基因。植保素是一類具有抗菌活性的次生代謝產(chǎn)物，其合成基因的上調(diào)表達(dá)有助于提高棉花的抗病能力。乙烯和茉莉酸信號(hào)通路在某些情況下也存在拮抗關(guān)系。在棉花生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，乙烯和茉莉酸對(duì)植物生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用存在差異。高濃度的乙烯可能會(huì)抑制茉莉酸介導(dǎo)的植物生長(zhǎng)促進(jìn)作用。研究表明，在棉花幼苗生長(zhǎng)階段，過(guò)高濃度的乙烯處理會(huì)抑制茉莉酸誘導(dǎo)的根系生長(zhǎng)，使根系長(zhǎng)度和側(cè)根數(shù)量減少。這可能是因?yàn)橐蚁┖蛙岳蛩嵩谛盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中存在交叉抑制，它們競(jìng)爭(zhēng)相同的信號(hào)元件或轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)受阻。在棉花抗黃萎病過(guò)程中，乙烯和茉莉酸對(duì)某些防御基因的表達(dá)調(diào)控也存在拮抗現(xiàn)象。乙烯可能會(huì)抑制茉莉酸誘導(dǎo)的一些防御基因的表達(dá)，從而影響棉花的抗病反應(yīng)。例如，乙烯處理會(huì)抑制茉莉酸誘導(dǎo)的病程相關(guān)蛋白基因GhPR1的表達(dá)，使GhPR1基因的表達(dá)量下降30%左右。這種拮抗關(guān)系可能是植物在應(yīng)對(duì)不同脅迫條件時(shí)，為了平衡生長(zhǎng)和防御之間的能量分配而產(chǎn)生的一種調(diào)節(jié)機(jī)制。5.2.2乙烯與水楊酸信號(hào)通路的相互影響乙烯和水楊酸信號(hào)通路在棉花抵御黃萎病菌侵染時(shí)存在著復(fù)雜的交叉對(duì)話和平衡調(diào)節(jié)，共同影響著棉花的抗病防御反應(yīng)。在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中，乙烯和水楊酸信號(hào)通路存在相互抑制的現(xiàn)象。研究表明，水楊酸能夠抑制乙烯信號(hào)通路中關(guān)鍵元件EIN3的積累。在棉花受到黃萎病菌侵染后，水楊酸處理會(huì)導(dǎo)致EIN3蛋白的降解速度加快，從而抑制乙烯信號(hào)的傳遞。在水楊酸處理后的棉花植株中，EIN3蛋白的含量相比未處理對(duì)照降低了40%。這可能是因?yàn)樗畻钏嵬ㄟ^(guò)激活某些蛋白激酶，促進(jìn)了EIN3蛋白的磷酸化，使其更容易被泛素-蛋白酶體途徑降解。乙烯也能抑制水楊酸信號(hào)通路的關(guān)鍵元件NPR1（Nonexpressorofpathogenesis-relatedgenes1）的活性。乙烯處理會(huì)使NPR1蛋白發(fā)生亞細(xì)胞定位的改變，使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核的過(guò)程受阻，從而抑制水楊酸信號(hào)的傳導(dǎo)。在乙烯處理后的棉花植株中，細(xì)胞核內(nèi)的NPR1蛋白含量明顯減少，導(dǎo)致水楊酸誘導(dǎo)的防御基因表達(dá)受到抑制。乙烯和水楊酸信號(hào)通路在某些情況下也存在協(xié)同作用。在棉花受到黃萎病菌侵染的早期，乙烯和水楊酸能夠共同誘導(dǎo)一些防御基因的表達(dá)，增強(qiáng)棉花的抗病能力。病程相關(guān)蛋白基因GhPR5在乙烯和水楊酸共同處理下，表達(dá)量相比單獨(dú)處理分別提高了2.2倍和1.6倍。這表明乙烯和水楊酸在病原菌侵染早期，能夠通過(guò)協(xié)同激活防御基因的表達(dá)，啟動(dòng)棉花的防御反應(yīng)。乙烯和水楊酸還能共同調(diào)節(jié)棉花體內(nèi)的活性氧代謝。在黃萎病菌侵染時(shí)，乙烯和水楊酸會(huì)協(xié)同誘導(dǎo)抗氧化酶基因的表達(dá)，提高抗氧化酶的活性，從而清除體內(nèi)過(guò)多的活性氧，減輕氧化損傷。例如，乙烯和水楊酸共同處理會(huì)使棉花體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性分別提高35%和40%。乙烯和水楊酸信號(hào)通路在棉花抵御黃萎病菌侵染過(guò)程中既存在相互抑制，又存在協(xié)同作用，這種復(fù)雜的交叉對(duì)話和平衡調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)于棉花的抗病防御反應(yīng)至關(guān)重要。通過(guò)深入研究乙烯和水楊酸信號(hào)通路的相互關(guān)系，有助于全面理解棉花抗黃萎病的分子機(jī)制，為棉花黃萎病的防治提供新的理論依據(jù)和策略。六、研究案例分析6.1案例一：海島棉乙烯響應(yīng)因子GbERF1-like的功能研究在棉花抗黃萎病機(jī)制的研究中，海島棉乙烯響應(yīng)因子GbERF1-like展現(xiàn)出獨(dú)特且關(guān)鍵的作用，為深入理解棉花與黃萎病菌的互作提供了重要視角。研究人員首先從海島棉品種“7124”中克隆了GbERF1-like基因，其ORF長(zhǎng)為537bp，編碼179個(gè)氨基酸的多肽，包含一個(gè)59個(gè)氨基酸的ERFs類轉(zhuǎn)錄因子保守AP2/ERF結(jié)構(gòu)域。通過(guò)序列聚類分析發(fā)現(xiàn)，GbERF1-like與GhERF1（AY181251.1）、GhERF8（JN656957.1）、TbERF（XM007035031.1）、GbERF5（JN003808.1）和AtERF1（AB008103）具有較高的同源性。這種序列上的相似性暗示著GbERF1-like可能與這些已知的乙烯響應(yīng)因子具有相似的功能或參與相似的信號(hào)通路。表達(dá)分析結(jié)果顯示，GbERF1-like在棉花的根、莖、葉等不同組織中均有表達(dá)，這表明該基因在棉花的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可能具有廣泛的功能。值得注意的是，GbERF1-like能夠快速響應(yīng)乙烯（ET）、茉莉酸甲酯（MeJA）處理。當(dāng)棉花受到ET或MeJA處理時(shí)，GbERF1-like基因的表達(dá)量迅速上調(diào)，這說(shuō)明GbERF1-like可能參與了乙烯和茉莉酸介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在棉花接種黃萎病菌“V991”后，相對(duì)于感病的陸地棉，GbERF1-like在抗病的海島棉中上調(diào)表達(dá)迅速，并且持續(xù)的時(shí)間長(zhǎng)。在接種后的12小時(shí)，抗病海島棉中GbERF1-like的表達(dá)量就開始顯著增加，而感病陸地棉中表達(dá)量增加不明顯。這種差異表達(dá)模式表明，GbERF1-like可能在抗病海島棉對(duì)黃萎病菌的防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證GbERF1-like的功能，研究人員通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得了GbERF1-like在棉花中的超量表達(dá)系COV20、COV5和抑制表達(dá)系Ci8、Ci6，以及GbERF1-like在擬南芥中的超量表達(dá)純系A(chǔ)OV12、AOV5。接種鑒定分析顯示，GbERF1-like的超量表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因棉花和擬南芥的抗病性，而抑制GbERF1-like表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花抗病性降低。在超量表達(dá)GbERF1-like的轉(zhuǎn)基因棉花中，接種黃萎病菌后病情指數(shù)明顯低于野生型棉花，發(fā)病率降低了30%。這表明GbERF1-like在棉花抗黃萎病過(guò)程中發(fā)揮著正調(diào)控作用?；虮磉_(dá)分析表明，GbERF1-like在棉花中能正調(diào)控PR3、PR4的表達(dá)，負(fù)調(diào)控PR1、PR5的表達(dá)。PR蛋白是植物在受到病原菌侵染時(shí)產(chǎn)生的一類重要的防御蛋白，它們具有多種抗菌功能。GbERF1-like對(duì)PR蛋白基因表達(dá)的調(diào)控，說(shuō)明其可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些防御蛋白的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)棉花的抗病能力。在擬南芥中，GbERF1-like能促進(jìn)AtPR3、AtPR4及AtPDF1.2的表達(dá)，但抑制AtPR2的表達(dá)。這種在不同植物中對(duì)PR蛋白基因表達(dá)調(diào)控的差異，可能與不同植物的防御機(jī)制和信號(hào)通路的差異有關(guān)。表達(dá)分析還顯示，木質(zhì)素合成路徑相關(guān)基因表達(dá)受GbERF1-like表達(dá)水平的影響。GhPAL5、GhC4H1、GhC3H1、GhHCT、GhCCoAOMT和GhF5H2等基因在GbERF1-like超量表達(dá)棉花中表達(dá)上升，而在其抑制轉(zhuǎn)基因系中表達(dá)量下降。類似的結(jié)果在擬南芥中也有發(fā)現(xiàn)，這暗示GbERF1-like可能在植物中參與木質(zhì)素合成的調(diào)控。木質(zhì)素是植物細(xì)胞壁的重要組成成分，它的合成增加可以增強(qiáng)細(xì)胞壁的強(qiáng)度，從而提高植物對(duì)病原菌的抵抗能力。為了進(jìn)一步證明GbERF1-like介導(dǎo)的棉花抗黃萎病增強(qiáng)與木質(zhì)素合成激活有關(guān)，研究人員利用病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)對(duì)GbERF1-like超量表達(dá)棉花材料COV20中的GhHCT進(jìn)行了抑制。分子檢測(cè)、接種鑒定及木質(zhì)素含量測(cè)定說(shuō)明，在抑制GhHCT表達(dá)后，GbERF1-like超量表達(dá)棉花材料的抗病性明顯降低，其莖部木質(zhì)素含量減少。同時(shí)木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達(dá)均受到影響，木質(zhì)素合成上游基因，如GhPAL1（Gbscaffold40957.1）、GhPAL5（Gbscaffold11559.9）、GhC4H（Gbscaffold12103.1）普遍表現(xiàn)為表達(dá)量降低，而木質(zhì)素合成下游的基因則普遍表現(xiàn)為表達(dá)水平上升，如GhCCR（Gbscaffold2152.13），GhCAD（Gorai.009G192400.1），GhFSH（Gbscaffold12698.2）和GhCOMT（Gorai.004G125600.1）。以上結(jié)果證明木質(zhì)素合成增強(qiáng)在GbERF1-like介導(dǎo)的棉花抗黃萎病反應(yīng)中具有重要作用。分析顯示GhHCT和AtPAL3兩個(gè)基因的啟動(dòng)子序列均含有TAAT-box、CAAT-box及GCCGCC-box的ERF類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件。利用酵母單雜交分析表明GbERF1-like與GhHCT和AtPAL3的啟動(dòng)子之間存在互作。利用雙分子熒光檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)GbERF1-like在棉花原生質(zhì)體中可以結(jié)合GhHCT和AtPAL3基因的啟動(dòng)子，并提高這兩個(gè)木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄活性。以上結(jié)果證明GbERF1-like直接參與了棉花及擬南芥的木質(zhì)素合成調(diào)控。通過(guò)酵母雙雜交篩選鑒定到部分與GbERF1-like互作的蛋白因子。部分因子為前期已報(bào)道參與棉花抗病反應(yīng)的蛋白，如MAPK、MLP、DIRIGENT。此外也有部分互作蛋白的功能還未在棉花抗黃萎病反應(yīng)中有報(bào)道，如P450、HSP、ALLERGE及GLYOXYLAS等。這些蛋白因子與GbERF1-like互作后對(duì)調(diào)控木質(zhì)素合成及棉花抗病反應(yīng)有何影響還有待進(jìn)一步研究。海島棉乙烯響應(yīng)因子GbERF1-like在棉花抗黃萎病反應(yīng)中通過(guò)調(diào)控病程相關(guān)蛋白基因和木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達(dá)，以及與其他蛋白因子的互作，發(fā)揮著重要的作用。這一研究成果為棉花抗黃萎病機(jī)制的研究提供了新的理論依據(jù)，也為棉花抗病育種提供了潛在的基因資源。6.2案例二：棉花乙烯響應(yīng)因子GhERF91參與防御反應(yīng)研究近期，石河子大學(xué)棉花遺傳改良團(tuán)隊(duì)聶新輝教授課題組完成的題為“CottonethyleneresponsefactorGhERF91isinvolvedinthedefenseagainstVerticilliumdahliae”的研究，為我們揭示了棉花乙烯響應(yīng)因子GhERF91在棉花防御黃萎病菌過(guò)程中的關(guān)鍵作用。研究團(tuán)隊(duì)首先通過(guò)8親本構(gòu)建的MAGIC群體進(jìn)行田間多環(huán)境抗病性鑒定，這是一種創(chuàng)新且高效的篩選方法，MAGIC群體集合了多個(gè)親本的遺傳多樣性，為篩選抗、感黃萎病材料提供了豐富的遺傳資源。通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)谋硇丸b定，團(tuán)隊(duì)成功篩選出一個(gè)抗黃萎病MAGIC株系和感黃萎病MAGIC親本。為了確保結(jié)果的可靠性，團(tuán)隊(duì)在室內(nèi)對(duì)株系進(jìn)行了黃萎病抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)大田和室內(nèi)抗黃萎病表型一致，這為后續(xù)研究提供了穩(wěn)定且可靠的材料基礎(chǔ)。隨后，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)篩選出的株系根部侵染黃萎病菌后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因富集在苯丙氨酸代謝通路中。這一發(fā)現(xiàn)為研究棉花與黃萎病菌互作機(jī)制提供了重要線索，暗示苯丙氨酸代謝通路可能在棉花抗黃萎病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。誘導(dǎo)表達(dá)分析表明，GhERF91能夠被乙烯利誘導(dǎo)表達(dá)。這一結(jié)果直接證明了GhERF91與乙烯信號(hào)通路的緊密聯(lián)系，為進(jìn)一步研究其在乙烯介導(dǎo)的棉花抗黃萎病機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。為了深入探究GhERF91的功能，研究團(tuán)隊(duì)采用了病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）技術(shù)沉默GhERF91的表達(dá)。結(jié)果顯示，沉默GhERF91表達(dá)后，棉花對(duì)黃萎病菌的抗性顯著減弱，這直接表明GhERF91在棉花抗黃萎病過(guò)程中發(fā)揮著重要的正調(diào)控作用。同時(shí)，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在GhERF91沉默植株中，乙烯信號(hào)通路關(guān)鍵基因GhERF1、GhERF6、GhACO1和病程相關(guān)蛋白基因GhPR1的表達(dá)均下調(diào)。這一結(jié)果揭示了GhERF91在乙烯信號(hào)通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)地位，它的沉默會(huì)影響整個(gè)乙烯信號(hào)通路的傳遞，進(jìn)而影響棉花的抗病防御反應(yīng)。更有趣的是，研究團(tuán)隊(duì)在對(duì)GhERF91沉默植株和對(duì)照植株接種黃萎病菌前噴施乙烯利時(shí)發(fā)現(xiàn)，乙烯利能夠增強(qiáng)沉默植株對(duì)黃萎病菌的抗性，而對(duì)照植株則沒(méi)有明顯差異。這一現(xiàn)象表明，盡管GhERF91表達(dá)被沉默，但通過(guò)外源施加乙烯利，可以部分恢復(fù)棉花對(duì)黃萎病菌的抗性，進(jìn)一步證實(shí)了乙烯在棉花防御黃萎病信號(hào)通路中的重要作用，也為棉花黃萎病的防治提供了新的思路和策略。石河子大學(xué)棉花乙烯響應(yīng)因子GhERF91參與防御反應(yīng)的研究，不僅為棉花抗黃萎病機(jī)制的研究提供了新的理論依據(jù)，也為棉花抗病育種提供了潛在的基因資源和技術(shù)支持。七、結(jié)論與展望7.1研究主要結(jié)論總結(jié)本研究圍繞乙烯在棉花與黃萎病菌互作中的作用展開了多維度、深入細(xì)致的探究，取得了一系列具有重要理論和實(shí)踐價(jià)值的成果。在生理響應(yīng)方面，棉花受黃萎病菌侵染后，乙烯釋放變化呈現(xiàn)出顯著的品種特異性和時(shí)間動(dòng)態(tài)性?？共∶藁ㄆ贩N在侵染初期乙烯釋放量迅速增加，且峰值較高，能夠快速啟動(dòng)防御反應(yīng)；而感病品種乙烯釋放延遲且峰值較低，防御反應(yīng)啟動(dòng)遲緩。在整個(gè)侵染時(shí)間進(jìn)程中，乙烯釋放量先上升后下降，與病害發(fā)展緊密相關(guān)。乙烯對(duì)棉花生理特性產(chǎn)生了多方面的影響。在光合作用方面，乙烯處理導(dǎo)致棉花葉片光合色素含量下降，光合速率降低，這是由于乙烯影響了氣孔導(dǎo)度、光合酶活性以及光合作用相關(guān)基因的表達(dá)。在抗氧化系統(tǒng)方面，乙烯處理使棉花體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化物酶（POD）等抗氧化酶活性發(fā)生改變，先升高后降低，從而調(diào)節(jié)棉花對(duì)氧化脅迫的響應(yīng)。在細(xì)胞膜透性和膜脂過(guò)氧化方面，乙烯處理增大了細(xì)胞膜相對(duì)透性，提高了丙二醛（MDA）含量，加劇了細(xì)胞膜的損傷。在乙烯相關(guān)基因及轉(zhuǎn)錄因子的功能研究中，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選并鑒定出多個(gè)受黃萎病菌誘導(dǎo)且與乙烯相關(guān)的差異表達(dá)基因。對(duì)關(guān)鍵乙烯響應(yīng)基因GhERF1進(jìn)行功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)沉默該基因會(huì)削弱棉花對(duì)黃萎病菌的抗性，過(guò)表達(dá)則增強(qiáng)抗性，表明其在棉花抗黃萎病過(guò)程中發(fā)揮著重要的正調(diào)控作用。乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子家族在棉花中成員眾多，具有