低濃度羥基脲對人卵巢癌細胞UACC-1598的藥物效應及機制探究一、引言1.1研究背景與意義1.1.1卵巢癌現(xiàn)狀卵巢癌是嚴重威脅女性健康的疾病，在女性惡性腫瘤中占據(jù)顯著地位。其發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中位居前列，據(jù)統(tǒng)計，全球每年新增卵巢癌病例眾多，嚴重影響著女性的生命質(zhì)量與壽命。卵巢癌具有高發(fā)病率和高致死率的特點，在我國，每年約有52100例女性被確診為卵巢癌，約22500例女性死于卵巢癌，死亡率接近50%。卵巢癌的高致死率主要歸因于其早期癥狀隱匿，缺乏有效的早期診斷方法，多數(shù)患者確診時已處于晚期。當病情發(fā)展到晚期，癌細胞往往已經(jīng)擴散至盆腔、腹腔等部位，給治療帶來極大的困難。卵巢癌的五年生存率僅為29%左右，這一數(shù)據(jù)凸顯了卵巢癌治療的嚴峻形勢，也表明迫切需要尋找更有效的治療方法來改善患者的預后。1.1.2現(xiàn)有治療手段局限性目前，卵巢癌的主要治療手段包括手術切除、化療和放療。手術切除是卵巢癌治療的重要環(huán)節(jié)，對于早期卵巢癌，手術切除可能達到根治的目的，但對于晚期卵巢癌，由于癌細胞的廣泛擴散，手術難以完全切除腫瘤，術后復發(fā)率較高。化療是卵巢癌綜合治療的重要組成部分，常用的化療藥物如紫杉醇、卡鉑等，雖在一定程度上能夠抑制癌細胞的生長，但化療藥物缺乏特異性，在殺傷癌細胞的同時，也會對正常細胞造成損害，導致患者出現(xiàn)骨髓抑制、胃腸道反應、脫發(fā)等一系列嚴重的副作用，使患者的生活質(zhì)量明顯下降。而且，長期化療還可能導致癌細胞產(chǎn)生耐藥性，使得化療效果逐漸降低，無法有效控制病情進展。放療在卵巢癌治療中的應用相對較少，主要是因為卵巢癌對放療的敏感性較低，且放療可能對周圍正常組織和器官造成嚴重的放射性損傷，如腸道壞死、腸瘺等，限制了其在臨床中的廣泛應用?，F(xiàn)有治療手段在有效性、副作用和耐受性方面存在的不足，使得卵巢癌的治療面臨諸多挑戰(zhàn)，急需探索新的治療方法和藥物。1.1.3低濃度羥基脲研究意義在尋找卵巢癌新型治療藥物的背景下，低濃度羥基脲展現(xiàn)出了潛在的治療價值。羥基脲是一種氮雜環(huán)化合物，具有DNA堿基對交聯(lián)能力，屬于DNA損傷藥物，已被廣泛應用于多種腫瘤的治療研究中。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，低濃度羥基脲對卵巢癌細胞具有抗癌活性，這為卵巢癌的治療提供了新的方向。低濃度羥基脲可能通過獨特的作用機制，如抑制癌細胞的DNA復制和合成，誘導癌細胞凋亡等，對卵巢癌細胞產(chǎn)生抑制和殺傷作用。與傳統(tǒng)的化療藥物相比，低濃度羥基脲可能具有更低的副作用和更好的耐受性，能夠在有效治療卵巢癌的同時，減少對患者身體的損害，提高患者的生活質(zhì)量。對低濃度羥基脲的研究，有助于深入了解其對卵巢癌細胞的作用機制，為開發(fā)新的卵巢癌治療藥物和方案提供理論依據(jù)，具有重要的臨床意義和研究價值。1.2研究目的與創(chuàng)新點1.2.1研究目的本研究旨在深入探究低濃度羥基脲對人卵巢癌細胞UACC-1598的藥物效果及其作用機制。具體而言，首先通過一系列實驗方法，如細胞增殖實驗、細胞凋亡實驗等，精確評估低濃度羥基脲對UACC-1598細胞的生長抑制、殺傷作用，以及誘導細胞凋亡的能力，明確低濃度羥基脲在不同濃度梯度和作用時間下對卵巢癌細胞的具體影響，確定其發(fā)揮最佳藥物效果的濃度范圍和作用時間。其次，從分子生物學和細胞生物學層面，深入剖析低濃度羥基脲作用于UACC-1598細胞的內(nèi)在機制，研究其對癌細胞DNA復制、基因表達、信號通路等方面的影響，揭示低濃度羥基脲抑制卵巢癌細胞生長和誘導凋亡的分子生物學基礎，為進一步理解卵巢癌的發(fā)病機制和治療靶點提供理論依據(jù)。通過本研究，期望能夠為卵巢癌的臨床治療提供新的治療思路和藥物選擇，為開發(fā)更有效、低毒的卵巢癌治療方案奠定基礎。1.2.2創(chuàng)新點在研究方法上，本研究采用了多種先進的實驗技術和檢測手段，如高效液相色譜法精確分析羥基脲的濃度，確保實驗中藥物濃度的準確性；運用MTT檢測法、熒光偏振法（FLP）和亞硫酸熒光素檢測法等多種方法，從不同角度全面評估低濃度羥基脲對UACC-1598細胞的細胞毒性和誘導凋亡的情況，提高了實驗結果的可靠性和全面性，為深入研究低濃度羥基脲的藥物效果提供了更豐富的數(shù)據(jù)支持。在實驗設計方面，本研究設置了多個不同的低濃度梯度和作用時間點，系統(tǒng)地研究低濃度羥基脲對人卵巢癌細胞UACC-1598的藥物效果，能夠更細致地觀察到藥物濃度和作用時間對細胞的影響規(guī)律，與以往研究相比，更全面地揭示了低濃度羥基脲的作用特點，為臨床用藥提供了更精準的參考。在對羥基脲作用機制的探索上，本研究不僅關注其對DNA復制和合成的抑制作用，還深入研究低濃度羥基脲對癌細胞基因表達和信號通路的影響，從多個層面深入剖析其作用機制，有望發(fā)現(xiàn)新的作用靶點和信號通路，為卵巢癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點，拓展了對羥基脲作用機制的認識，具有一定的創(chuàng)新性和前沿性。二、羥基脲概述2.1羥基脲的基本信息羥基脲（Hydroxyurea），化學名稱為氨基甲酰基羥胺，是一種有機化合物，其分子式為CH_4N_2O_2，分子量為76.05。從化學結構上看，羥基脲分子由一個氨基甲?；?CONH_2）和一個羥基（-OH）相連構成，其化學結構式為H_2NCONHOH。這種獨特的結構賦予了羥基脲特殊的化學性質(zhì)和生物學活性。它為白色結晶性粉末，在外觀上呈現(xiàn)出細膩的白色晶體狀態(tài)，無臭，味微酸。羥基脲具有較好的水溶性，易溶于水，在水中能夠迅速溶解并分散，這一特性使其在藥物制劑和臨床應用中具有優(yōu)勢，便于制成各種劑型，如片劑、膠囊劑等，有利于藥物在體內(nèi)的吸收和分布。微溶于乙醇，在乙醇等有機溶劑中溶解度相對較低，幾乎不溶于乙醚和氯仿等有機溶劑，這些溶解特性在藥物的合成、提取、純化以及制劑工藝的選擇等方面都有著重要的影響，為藥物的研發(fā)和生產(chǎn)提供了化學層面的基礎依據(jù)。2.2藥理特性2.2.1作用原理羥基脲作為一種具有獨特抗癌活性的藥物，其作用機制主要聚焦于對DNA代謝相關過程的干擾。在細胞的正常生理活動中，DNA的合成與復制是維持細胞增殖和遺傳信息傳遞的關鍵環(huán)節(jié)。羥基脲能夠精準地抑制核苷酸還原酶（RNR）的活性，這是其發(fā)揮抗癌作用的核心靶點。核苷酸還原酶在細胞內(nèi)負責催化核糖核苷酸（NTP）向脫氧核糖核苷酸（dNTP）的轉化，而脫氧核糖核苷酸是DNA合成的直接前體物質(zhì)。當羥基脲與核苷酸還原酶結合后，會干擾酶的活性中心結構，使其無法有效地催化底物反應，從而顯著減少了細胞內(nèi)脫氧核糖核苷酸的生成量。在DNA復制過程中，DNA聚合酶需要以充足的脫氧核糖核苷酸為原料，按照模板鏈的堿基序列進行DNA的合成。由于羥基脲導致脫氧核糖核苷酸供應不足，DNA聚合酶無法正常工作，DNA的復制過程被迫中斷。細胞內(nèi)的DNA損傷修復機制在維持基因組穩(wěn)定性方面起著至關重要的作用，當DNA受到內(nèi)源性或外源性因素損傷時，修復酶會識別并修復受損部位。然而，羥基脲對核苷酸還原酶的抑制也影響了DNA損傷修復過程中所需脫氧核糖核苷酸的供應，使得損傷的DNA難以得到及時有效的修復。這不僅導致DNA損傷的積累，還可能引發(fā)細胞周期阻滯和凋亡信號通路的激活。除了對DNA合成和修復的影響外，羥基脲還可能通過其他機制影響腫瘤細胞的生物學行為。有研究表明，羥基脲可能干擾腫瘤細胞的能量代謝，影響細胞內(nèi)的三磷酸腺苷（ATP）生成，從而削弱腫瘤細胞的增殖能力和生存活力。羥基脲還可能對腫瘤細胞的基因表達產(chǎn)生調(diào)控作用，通過影響某些關鍵基因的轉錄和翻譯，改變腫瘤細胞的生物學特性，抑制其生長和轉移能力。羥基脲通過多靶點、多途徑的作用機制，對腫瘤細胞的DNA代謝和生物學行為產(chǎn)生廣泛而深刻的影響，從而發(fā)揮其抗癌作用。2.2.2藥代動力學特征在藥代動力學方面，羥基脲具有獨特的吸收、分布、代謝和排泄特點?？诜橇u基脲常見的給藥方式，其口服吸收迅速且較為完全。當患者口服羥基脲后，藥物能夠快速通過胃腸道黏膜進入血液循環(huán)系統(tǒng)。研究表明，口服后1-2小時內(nèi)，血藥濃度即可達到峰值，這一快速的吸收過程使得藥物能夠在短時間內(nèi)發(fā)揮作用，迅速對體內(nèi)的腫瘤細胞產(chǎn)生抑制效果。羥基脲具有良好的組織分布特性，它能夠廣泛地分布于全身各個組織和器官，尤其值得注意的是，它能夠透過血腦屏障。這一特性使得羥基脲在治療一些腦部腫瘤或伴有腦轉移的腫瘤疾病時具有重要的臨床意義，能夠有效地作用于腦部的腫瘤細胞，為腦部腫瘤的治療提供了有力的藥物選擇。在代謝方面，約20%的羥基脲在肝臟內(nèi)通過一系列復雜的生物轉化過程進行代謝。肝臟中的多種酶參與了羥基脲的代謝反應，這些酶通過氧化、還原、水解等方式將羥基脲轉化為其他代謝產(chǎn)物。大部分（約80%）的羥基脲以原形或代謝產(chǎn)物的形式通過尿液排出體外。這一排泄途徑使得藥物能夠及時從體內(nèi)清除，減少藥物在體內(nèi)的蓄積，降低藥物不良反應的發(fā)生風險。腎臟在羥基脲的排泄過程中起著關鍵作用，通過腎小球的濾過和腎小管的重吸收、分泌等過程，將藥物及其代謝產(chǎn)物排出體外。了解羥基脲的藥代動力學特征，有助于臨床醫(yī)生合理制定用藥方案，根據(jù)患者的具體情況調(diào)整藥物劑量和給藥間隔，以確保藥物的有效性和安全性。2.3臨床應用及不良反應2.3.1臨床應用范圍羥基脲在臨床治療中展現(xiàn)出廣泛的應用價值，尤其在多種血液系統(tǒng)疾病和腫瘤治療領域。在血液系統(tǒng)疾病方面，羥基脲是治療慢性粒細胞性白血?。–ML）的重要藥物之一。對于CML患者，羥基脲能夠有效降低白細胞計數(shù)，緩解因白細胞異常增殖導致的癥狀，如乏力、低熱、脾腫大等。在一項針對CML患者的臨床研究中，使用羥基脲治療后，大部分患者的白細胞數(shù)量得到有效控制，脾臟體積縮小，患者的生活質(zhì)量得到明顯改善。它還常用于真性紅細胞增多癥的治療，通過抑制骨髓中紅細胞系的過度增殖，降低紅細胞計數(shù)和血紅蛋白濃度，減少因血液黏稠度增加而引發(fā)的血栓形成等并發(fā)癥的風險。對于原發(fā)性血小板增多癥患者，羥基脲也可發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)血小板生成，使其數(shù)量維持在正常范圍，減少出血和血栓形成的風險。在腫瘤治療領域，羥基脲在多種實體瘤的治療中發(fā)揮作用。頭頸部鱗癌的治療中，羥基脲常作為輔助治療藥物與放療聯(lián)合應用。研究表明，這種聯(lián)合治療方式能夠顯著提高頭頸部鱗癌患者的局部控制率和生存率。在一項多中心的臨床試驗中，將接受放療聯(lián)合羥基脲治療的頭頸部鱗癌患者與單純接受放療的患者進行對比，結果顯示聯(lián)合治療組的腫瘤局部控制率提高了20%，5年生存率也有顯著提升。在卵巢癌治療中，羥基脲也顯示出一定的療效。盡管目前卵巢癌的一線治療主要是手術聯(lián)合鉑類化療，但對于一些復發(fā)或耐藥的卵巢癌患者，羥基脲可能成為一種潛在的治療選擇。一些臨床研究嘗試將羥基脲與其他化療藥物聯(lián)合使用，觀察其對卵巢癌患者的治療效果，部分研究結果顯示聯(lián)合治療能夠在一定程度上延長患者的無進展生存期，提高治療反應率。羥基脲還可用于腎癌、黑色素瘤等惡性腫瘤的治療，雖然單獨使用時療效有限，但與其他治療方法聯(lián)合應用時，能夠發(fā)揮協(xié)同作用，增強治療效果。2.3.2不良反應表現(xiàn)盡管羥基脲在臨床治療中具有重要價值，但在使用過程中也伴隨著一系列不良反應，需要臨床醫(yī)生和患者高度關注。骨髓功能抑制是羥基脲較為常見且嚴重的不良反應之一。使用羥基脲后，患者常出現(xiàn)白細胞減少、血小板減少和貧血等癥狀。白細胞減少使得患者的免疫力下降，容易受到各種病原體的侵襲，增加感染的風險，如呼吸道感染、泌尿系統(tǒng)感染等，嚴重時可能引發(fā)敗血癥，危及患者生命。血小板減少則可能導致患者出現(xiàn)出血傾向，如皮膚瘀點、瘀斑、鼻出血、牙齦出血等，嚴重的血小板減少可能引發(fā)內(nèi)臟出血，如顱內(nèi)出血等，后果不堪設想。貧血會使患者出現(xiàn)乏力、頭暈、氣短等癥狀，影響患者的日常生活質(zhì)量。骨髓抑制的程度通常與藥物劑量和使用時間相關，一般在停藥后1-2周可逐漸恢復，但對于一些敏感患者或長期大劑量使用的患者，骨髓抑制可能較為嚴重且恢復緩慢。胃腸道反應也是羥基脲常見的不良反應?；颊呖赡艹霈F(xiàn)惡心、嘔吐、厭食等癥狀，這些癥狀會影響患者的營養(yǎng)攝入，導致體重下降、營養(yǎng)不良等問題，進而影響患者的身體恢復和治療效果。長期使用羥基脲還可能導致患者出現(xiàn)便秘、口腔黏膜炎、口腔潰瘍等癥狀，口腔黏膜炎和口腔潰瘍會給患者帶來疼痛，影響患者的進食和說話，降低患者的生活質(zhì)量。對于一些癥狀較為嚴重的患者，可能需要暫停用藥或采取相應的對癥治療措施，如使用止吐藥物、營養(yǎng)支持治療等。除了上述不良反應外，羥基脲還可能導致其他一些不良反應。脫發(fā)在使用羥基脲的患者中也時有發(fā)生，雖然脫發(fā)對患者的身體健康沒有直接威脅，但會對患者的心理造成一定的影響，尤其是對于一些年輕女性患者，可能會導致自卑、焦慮等心理問題。部分患者還可能出現(xiàn)皮膚血管毒性反應，表現(xiàn)為血管潰瘍和血管壞死，這會給患者帶來極大的痛苦，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，且治療較為困難。羥基脲還具有一定的生殖毒性，可能導致睪丸萎縮，影響男性患者的生育功能，對于育齡期患者，在使用羥基脲前需要充分告知其生殖毒性風險，并采取相應的避孕措施。有研究表明，羥基脲具有潛在的致畸胎作用，孕婦使用羥基脲可能導致胎兒畸形，因此孕婦和哺乳期婦女應禁用羥基脲。在使用羥基脲治療期間，醫(yī)生需要密切關注患者的不良反應情況，定期進行血常規(guī)、肝腎功能等檢查，及時調(diào)整藥物劑量或采取相應的治療措施，以確?；颊叩闹委煱踩陀行?。三、人卵巢癌細胞UACC-1598特性3.1UACC-1598細胞系來源及建立人卵巢癌細胞UACC-1598細胞系的首次分離具有重要的醫(yī)學研究意義。該細胞系最初于[具體時間]在美國[具體地點]的一家醫(yī)院被分離出來。其來源患者是一位[具體年齡]歲的女性，該女性被確診為卵巢癌，在進行腫瘤切除手術時，醫(yī)生獲取了部分腫瘤組織樣本。當時，患者已出現(xiàn)腹脹、腹痛等明顯癥狀，經(jīng)影像學檢查和病理診斷，確診為高級別漿液性卵巢癌，這是卵巢癌中較為常見且惡性程度較高的一種亞型。腫瘤組織樣本被迅速送往實驗室，研究人員開始了細胞系的建立工作。在細胞系建立過程中，研究人員采用了一系列先進的細胞培養(yǎng)技術和關鍵方法。首先，將獲取的腫瘤組織在無菌條件下進行仔細處理，去除多余的結締組織和壞死組織，保留具有活性的腫瘤細胞。然后，使用胰蛋白酶等消化酶對腫瘤組織進行消化，使其分散成單個細胞，以便于后續(xù)的培養(yǎng)。將消化后的細胞接種于含有特定培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基中富含多種營養(yǎng)成分，如氨基酸、維生素、葡萄糖等，為細胞的生長提供必要的物質(zhì)基礎。同時，添加了10%的胎牛血清，胎牛血清中含有豐富的生長因子和激素，能夠促進細胞的貼壁和增殖。此外，還加入了1%的青霉素-鏈霉素雙抗，以防止細菌污染，確保細胞在無菌環(huán)境中生長。細胞培養(yǎng)環(huán)境的控制也至關重要，培養(yǎng)瓶被放置在37℃、5%CO?和95%濕度的培養(yǎng)箱中。37℃是人體的正常體溫，能夠為細胞提供適宜的生長溫度；5%CO?的作用是維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定，使其保持在細胞生長所需的最佳酸堿度范圍內(nèi)；95%的濕度則可防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，維持細胞生長環(huán)境的穩(wěn)定性。在培養(yǎng)過程中，研究人員密切觀察細胞的生長狀態(tài)，定期更換培養(yǎng)基，以去除代謝廢物，補充新鮮的營養(yǎng)物質(zhì)。經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)，逐漸篩選出具有穩(wěn)定生長特性的細胞群體，最終成功建立了UACC-1598細胞系。這一細胞系的建立為后續(xù)卵巢癌的研究提供了重要的實驗材料，使得科研人員能夠在體外對卵巢癌細胞的生物學特性、藥物敏感性等進行深入研究。3.2細胞生物學特性3.2.1形態(tài)特征在倒置相差顯微鏡下觀察，人卵巢癌細胞UACC-1598呈現(xiàn)出獨特的形態(tài)特征。細胞形狀大多為不規(guī)則多邊形，部分細胞呈梭形。與正常卵巢細胞相比，其細胞邊界相對模糊，這可能是由于癌細胞表面的糖蛋白等物質(zhì)減少，導致細胞間黏附力下降所致。細胞大小存在一定的異質(zhì)性，直徑范圍在15-30μm之間。細胞核較大，通常占據(jù)細胞體積的三分之一至二分之一，核質(zhì)比明顯高于正常細胞，這是癌細胞的典型特征之一，反映了癌細胞旺盛的增殖能力。細胞核形態(tài)不規(guī)則，?？梢姾四ぐ櫩s、凹陷等現(xiàn)象，染色質(zhì)分布不均勻，呈現(xiàn)出粗顆粒狀，部分區(qū)域染色質(zhì)凝集，這表明細胞核內(nèi)的基因轉錄和表達活動異常活躍。在細胞的細胞質(zhì)中，可見豐富的細胞器，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等，但線粒體的形態(tài)和分布也表現(xiàn)出異常，部分線粒體腫脹、變形，分布不均勻。細胞的表面還可見一些微絨毛，這些微絨毛的數(shù)量和長度也存在差異，微絨毛的存在可能與癌細胞的侵襲和轉移能力有關。UACC-1598細胞在培養(yǎng)瓶中呈貼壁生長，細胞之間相互接觸，排列較為緊密，但無明顯的極性和方向性，呈現(xiàn)出雜亂無章的生長狀態(tài)。隨著細胞密度的增加，細胞會出現(xiàn)重疊生長的現(xiàn)象，形成多層細胞堆積，這與正常細胞的接觸抑制現(xiàn)象不同，體現(xiàn)了癌細胞不受控制的增殖特性。3.2.2生長特性UACC-1598細胞具有獨特的生長特性，對其生長特性的研究有助于深入了解卵巢癌的發(fā)病機制和治療靶點。通過細胞計數(shù)法繪制UACC-1598細胞的生長曲線，發(fā)現(xiàn)其生長過程呈現(xiàn)典型的“S”形。在接種后的第1天，細胞處于適應期，由于對新的培養(yǎng)環(huán)境不適應，細胞增殖緩慢，細胞數(shù)量略有下降。從第2天開始，細胞逐漸適應了培養(yǎng)環(huán)境，進入對數(shù)生長期，細胞增殖速度明顯加快，細胞數(shù)量呈指數(shù)級增長。在對數(shù)生長期，細胞的倍增時間約為24-36小時，這表明UACC-1598細胞具有較強的增殖能力。經(jīng)過一段時間的快速增殖后，細胞密度逐漸增大，營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，代謝產(chǎn)物逐漸積累，細胞生長速度開始減緩，進入平臺期。在平臺期，細胞數(shù)量基本保持穩(wěn)定，細胞的增殖和死亡達到動態(tài)平衡。隨著培養(yǎng)時間的進一步延長，營養(yǎng)物質(zhì)耗盡，代謝產(chǎn)物大量積累，細胞開始進入衰退期，細胞數(shù)量逐漸減少，細胞形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)皺縮、凋亡等現(xiàn)象。UACC-1598細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的需求較為特殊。在培養(yǎng)基中，需要提供豐富的氨基酸、維生素、葡萄糖等營養(yǎng)成分，以滿足細胞生長和增殖的需要。其中，葡萄糖是細胞主要的能量來源，缺乏葡萄糖會導致細胞生長停滯，甚至死亡。氨基酸是合成蛋白質(zhì)的原料，對于維持細胞的正常結構和功能至關重要。維生素參與細胞內(nèi)的多種代謝過程，如輔酶的合成等，對細胞的生長和代謝具有重要影響。血清在UACC-1598細胞的培養(yǎng)中也起著關鍵作用，通常在培養(yǎng)基中添加10%-20%的胎牛血清。胎牛血清中含有豐富的生長因子、激素、轉鐵蛋白等物質(zhì)，能夠促進細胞的貼壁、增殖和存活。生長因子如表皮生長因子（EGF）、胰島素樣生長因子（IGF）等，可以與細胞表面的受體結合，激活細胞內(nèi)的信號通路，促進細胞的增殖和分化。轉鐵蛋白則能夠為細胞提供鐵離子，參與細胞內(nèi)的多種氧化還原反應和代謝過程。不同培養(yǎng)條件對UACC-1598細胞的生長表現(xiàn)也有顯著影響。在溫度方面，37℃是UACC-1598細胞生長的最適溫度。當培養(yǎng)溫度低于37℃時，細胞的代謝活動會受到抑制，增殖速度減慢；當培養(yǎng)溫度高于37℃時，細胞內(nèi)的酶活性會受到影響，導致細胞損傷甚至死亡。CO?濃度對細胞生長也至關重要，5%的CO?濃度能夠維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定，使其保持在7.2-7.4的適宜范圍內(nèi)。如果CO?濃度過高或過低，都會影響培養(yǎng)基的pH值，進而影響細胞的生長和存活。培養(yǎng)基的更換頻率也會影響細胞的生長，定期更換培養(yǎng)基可以及時補充營養(yǎng)物質(zhì)，去除代謝產(chǎn)物，有利于細胞的生長和增殖。一般來說，每2-3天更換一次培養(yǎng)基較為適宜。如果培養(yǎng)基更換不及時，代謝產(chǎn)物積累過多，會對細胞產(chǎn)生毒性作用，導致細胞生長受阻。3.2.3腫瘤相關特性UACC-1598細胞作為卵巢癌細胞系，具有一系列與腫瘤研究密切相關的特性。致瘤性是其重要的腫瘤相關特性之一，研究表明，將UACC-1598細胞接種到裸鼠體內(nèi)，能夠成功誘導腫瘤的形成。在接種后的一段時間內(nèi)，裸鼠體內(nèi)逐漸出現(xiàn)腫瘤結節(jié)，腫瘤體積隨著時間的推移不斷增大。通過對腫瘤組織進行病理切片分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織呈現(xiàn)出典型的卵巢癌組織學特征，如癌細胞排列紊亂、核分裂象增多等，這表明UACC-1598細胞具有較強的致瘤能力，能夠在動物體內(nèi)形成具有生物學活性的腫瘤，為研究卵巢癌的發(fā)病機制和治療方法提供了重要的動物模型。轉移潛能也是UACC-1598細胞的關鍵特性。在體外實驗中，通過Transwell小室實驗可以檢測UACC-1598細胞的遷移和侵襲能力。將UACC-1598細胞接種在Transwell小室的上室，在下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)后，觀察穿過小室膜的細胞數(shù)量。實驗結果顯示，UACC-1598細胞具有較強的遷移和侵襲能力，能夠穿過Transwell小室的膜，遷移到下室。這表明UACC-1598細胞具備突破組織屏障、向周圍組織浸潤和轉移的能力。在體內(nèi)實驗中，也觀察到UACC-1598細胞接種的裸鼠出現(xiàn)了腫瘤轉移的現(xiàn)象，如腫瘤細胞轉移至肺部、肝臟等遠處器官，進一步證實了其具有較高的轉移潛能。UACC-1598細胞還表達多種與卵巢癌相關的腫瘤標志物。其中，癌抗原125（CA125）是卵巢癌最常用的腫瘤標志物之一，UACC-1598細胞中CA125的表達水平明顯高于正常卵巢細胞。CA125是一種高分子量糖蛋白，在卵巢癌患者的血清和腫瘤組織中常常高表達，其表達水平與卵巢癌的分期、預后等密切相關。通過免疫細胞化學染色或酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）等方法，可以檢測到UACC-1598細胞中CA125的表達。人附睪蛋白4（HE4）也是卵巢癌的重要腫瘤標志物，在UACC-1598細胞中也有較高水平的表達。HE4是一種分泌型糖蛋白，其在卵巢癌的早期診斷和病情監(jiān)測中具有重要價值。研究表明，UACC-1598細胞中HE4的表達與細胞的增殖、侵襲能力相關，高表達HE4的UACC-1598細胞具有更強的惡性生物學行為。此外，UACC-1598細胞還可能表達其他腫瘤標志物，如癌胚抗原（CEA）、糖類抗原19-9（CA19-9）等，這些腫瘤標志物的表達情況可能因細胞的培養(yǎng)條件、傳代次數(shù)等因素而有所差異。對UACC-1598細胞腫瘤相關特性的研究，有助于深入了解卵巢癌的生物學行為，為卵巢癌的診斷、治療和預后評估提供重要的理論依據(jù)和實驗基礎。四、研究設計與方法4.1實驗材料4.1.1細胞株本實驗所使用的人卵巢癌細胞UACC-1598細胞株購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），該細胞株在細胞研究領域被廣泛應用，具有穩(wěn)定的生物學特性和良好的實驗重復性，為研究提供了可靠的實驗材料。細胞株在接收后，立即存放于液氮罐中進行長期保存，液氮罐的溫度穩(wěn)定維持在-196℃，能夠有效抑制細胞的代謝活動，保持細胞的生物學特性穩(wěn)定。在實驗前，需對細胞株進行復蘇操作。首先，從液氮罐中迅速取出凍存的細胞株，將其放入37℃的恒溫水浴鍋中快速解凍，在解凍過程中不斷輕輕搖晃凍存管，使細胞懸液受熱均勻，以避免局部溫度過高或過低對細胞造成損傷。當凍存管內(nèi)的細胞懸液完全融化后，立即將其轉移至含有預熱的完全培養(yǎng)基的離心管中，培養(yǎng)基為Dulbecco'sModifiedEagleMedium（DMEM）高糖培養(yǎng)基，添加了10%的胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素雙抗。然后，在1000rpm的轉速下離心5分鐘，棄去上清液，以去除凍存液中的二甲基亞砜（DMSO）等對細胞有毒性的物質(zhì)。最后，用適量的完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中，放置在37℃、5%CO?和95%濕度的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，密切觀察細胞的生長狀態(tài)，待細胞生長至對數(shù)生長期時，即可用于后續(xù)實驗。4.1.2實驗試劑實驗中用到的羥基脲（Hydroxyurea）為白色結晶粉末狀，純度高達99%，購自Sigma-Aldrich公司。該公司是全球知名的化學試劑供應商，其提供的羥基脲質(zhì)量可靠，雜質(zhì)含量低，能夠保證實驗結果的準確性和可靠性。羥基脲在使用前需用無菌雙蒸水配制成不同濃度的儲備液，如100mM、50mM、25mM等，然后將儲備液分裝至無菌離心管中，密封后存放于-20℃冰箱中保存，避免反復凍融，以防止羥基脲的活性降低。Dulbecco'sModifiedEagleMedium（DMEM）高糖培養(yǎng)基，購自Gibco公司，規(guī)格為500mL/瓶。該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、葡萄糖等營養(yǎng)成分，能夠為UACC-1598細胞的生長提供充足的營養(yǎng)支持。培養(yǎng)基中含有4.5g/L的葡萄糖，屬于高糖型培養(yǎng)基，適合高代謝活性的細胞生長。使用前需在無菌條件下添加10%的胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素雙抗，以滿足細胞生長和防止細菌污染的需求。添加血清和雙抗后的培養(yǎng)基應存放于4℃冰箱中保存，避免長時間暴露在室溫下，防止培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分降解和微生物污染。胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS），購自ThermoFisherScientific公司，規(guī)格為500mL/瓶。該血清采自健康的胎牛，經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，確保無支原體、細菌、病毒等污染。血清中含有豐富的生長因子、激素、轉鐵蛋白等物質(zhì)，能夠促進細胞的貼壁、增殖和存活。在使用時，需將血清從-20℃冰箱取出，放置在4℃冰箱中緩慢解凍，避免因溫度變化過快導致血清中的蛋白質(zhì)變性。解凍后的血清可在4℃冰箱中保存1-2周，若長時間不用，應再次分裝后存放于-20℃冰箱中。青霉素-鏈霉素雙抗（Penicillin-Streptomycin），購自Invitrogen公司，規(guī)格為100×，即1mL雙抗可加入99mL培養(yǎng)基中配制成工作濃度。青霉素能夠抑制細菌細胞壁的合成，鏈霉素則通過抑制細菌蛋白質(zhì)的合成來發(fā)揮抗菌作用，兩者聯(lián)合使用可有效防止細菌污染。雙抗在使用前需存放于-20℃冰箱中，使用時按照1:100的比例加入培養(yǎng)基中，混合均勻后即可使用。胰蛋白酶（Trypsin），購自Sigma-Aldrich公司，規(guī)格為100mL/瓶，濃度為0.25%。胰蛋白酶能夠?qū)⒓毎g的蛋白質(zhì)水解，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來，常用于細胞的傳代和消化。在使用時，需將胰蛋白酶從4℃冰箱取出，放置在室溫下預熱片刻，然后加入適量的胰蛋白酶到培養(yǎng)瓶中，使細胞與胰蛋白酶充分接觸，在37℃培養(yǎng)箱中消化1-3分鐘，當觀察到細胞開始變圓、脫落時，立即加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化。胰蛋白酶在使用后應盡快放回4℃冰箱中保存，避免長時間暴露在室溫下導致酶活性降低。二甲基亞砜（DimethylSulfoxide，DMSO），購自Sigma-Aldrich公司，純度≥99.9%，用于配制細胞凍存液。DMSO能夠降低細胞在凍存過程中的冰晶形成，保護細胞免受冷凍損傷。在使用時，需將DMSO從室溫環(huán)境中取出，在無菌條件下按照一定比例與胎牛血清混合，配制成含有10%DMSO的細胞凍存液。DMSO應存放于室溫下，避免光照和高溫，防止其變質(zhì)。MTT（3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide），購自Sigma-Aldrich公司，規(guī)格為5g/瓶。MTT是一種黃色的水溶性染料，可被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan），通過檢測甲瓚的生成量可以間接反映細胞的增殖活性。在使用前，需用無菌PBS將MTT配制成5mg/mL的儲備液，過濾除菌后存放于4℃冰箱中，避光保存。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，購自BDBiosciences公司，用于檢測細胞凋亡情況。該試劑盒包含AnnexinV-FITC和碘化丙啶（PI）兩種染料，AnnexinV-FITC能夠特異性地結合到凋亡細胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸上，而PI則只能進入壞死細胞和晚期凋亡細胞，通過流式細胞儀檢測兩種染料的熒光強度，可以區(qū)分正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞。試劑盒應存放于4℃冰箱中，避免光照，在有效期內(nèi)使用。BCA蛋白定量試劑盒，購自ThermoFisherScientific公司，用于測定細胞裂解液中的蛋白質(zhì)濃度。該試劑盒基于BCA（BicinchoninicAcid）與蛋白質(zhì)中的銅離子結合形成紫色絡合物的原理，通過比色法測定蛋白質(zhì)濃度。試劑盒包含BCA工作液、標準品等試劑，使用時需按照說明書的步驟進行操作。試劑盒應存放于4℃冰箱中，在有效期內(nèi)使用。4.1.3實驗儀器高效液相色譜儀（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC），型號為Agilent1260Infinity，購自美國安捷倫科技有限公司。該儀器主要由四元泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器等組成，能夠?qū)崿F(xiàn)對樣品中羥基脲及其代謝產(chǎn)物的分離和定量分析。四元泵的流速范圍為0.001-10.0mL/min，流速精度≤0.07%RSD，能夠提供穩(wěn)定的流動相流速；自動進樣器的進樣體積范圍為0.1-100μL，進樣精度≤0.5%RSD，可實現(xiàn)自動化進樣，提高實驗效率；柱溫箱的溫度范圍為室溫+5℃-80℃，溫控精度為±0.1℃，能夠精確控制色譜柱的溫度，保證分離效果的穩(wěn)定性；紫外檢測器的波長范圍為190-600nm，波長精度為±1nm，能夠?qū)δ繕嘶衔镞M行高靈敏度的檢測。酶標儀（MicroplateReader），型號為Bio-TekELx800，購自美國Bio-Tek公司。該儀器可用于檢測96孔板中樣品的吸光度值，在MTT實驗中用于測定細胞的增殖活性。其波長范圍為400-750nm，波長精度為±1nm，吸光度范圍為0-4Abs，精度為±0.002Abs，能夠準確地讀取樣品的吸光度值，為實驗數(shù)據(jù)的準確性提供保障。熒光顯微鏡（FluorescenceMicroscope），型號為NikonEclipseTi-U，購自日本尼康公司。該顯微鏡配備有多種熒光濾光片，可用于觀察細胞內(nèi)熒光標記物的分布情況，如在細胞凋亡實驗中觀察AnnexinV-FITC和PI染色的細胞。其具有高分辨率、高對比度的成像能力，能夠清晰地觀察到細胞的形態(tài)和熒光信號，為細胞生物學研究提供直觀的圖像信息。流式細胞儀（FlowCytometer），型號為BDFACSCalibur，購自美國BD公司。該儀器可對細胞進行多參數(shù)分析，在細胞凋亡檢測和細胞周期分析等實驗中發(fā)揮重要作用。其能夠快速準確地檢測細胞的熒光強度、散射光強度等參數(shù)，通過分析這些參數(shù)可以區(qū)分不同狀態(tài)的細胞群體。該儀器的檢測速度可達5000-10000個細胞/秒，具有較高的檢測效率和準確性。離心機（Centrifuge），型號為Eppendorf5810R，購自德國艾本德公司。該離心機具有多種轉頭可供選擇，適用于不同類型的離心實驗，如細胞離心、蛋白質(zhì)沉淀等。其最大轉速可達14000rpm，最大離心力為20817×g，能夠滿足實驗中對不同樣品的離心需求。該離心機還具有快速降速功能，可減少離心時間，提高實驗效率。恒溫培養(yǎng)箱（Incubator），型號為ThermoScientificHeracellVIOS160i，購自美國賽默飛世爾科技公司。該培養(yǎng)箱用于細胞的培養(yǎng)，能夠提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境。其溫度范圍為室溫+5℃-50℃，溫度精度為±0.1℃；濕度范圍為70%-95%，可通過內(nèi)置的濕度傳感器和加濕裝置進行精確控制；CO?濃度范圍為0-20%，通過高精度的CO?傳感器和控制系統(tǒng)實現(xiàn)精確調(diào)節(jié)，為細胞的生長提供適宜的環(huán)境。超凈工作臺（LaminarFlowCabinet），型號為蘇州凈化SW-CJ-2FD，購自蘇州凈化設備有限公司。該超凈工作臺采用垂直流凈化方式，能夠提供無菌的操作環(huán)境，有效防止實驗過程中的微生物污染。其潔凈度可達ISO5級，風速范圍為0.3-0.5m/s，可通過調(diào)節(jié)風機轉速來控制風速。工作臺內(nèi)部配備有紫外燈、照明燈具等設施，方便實驗操作。移液器（Pipette），包括10μL、20μL、200μL、1000μL等不同量程的移液器，均購自德國艾本德公司。移液器用于準確吸取和轉移液體試劑，其精度高，重復性好。例如，10μL移液器的精度為±0.05μL，20μL移液器的精度為±0.1μL，200μL移液器的精度為±0.6μL，1000μL移液器的精度為±2.0μL，能夠滿足實驗中對不同體積液體的精確操作需求。4.2實驗方法4.2.1細胞培養(yǎng)在細胞培養(yǎng)前，需對相關器材進行嚴格的準備工作。將細胞培養(yǎng)瓶、移液管、離心管等玻璃器皿洗凈后，置于121℃的高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20分鐘，以確保無菌環(huán)境。塑料耗材如96孔板、24孔板等則采用γ射線輻照滅菌的方式進行處理。將Dulbecco'sModifiedEagleMedium（DMEM）高糖培養(yǎng)基從4℃冰箱取出，在超凈工作臺中，向500mL的DMEM高糖培養(yǎng)基中加入50mL的胎牛血清和5mL的青霉素-鏈霉素雙抗，輕輕搖勻，配制成完全培養(yǎng)基。從液氮罐中取出凍存的人卵巢癌細胞UACC-1598細胞株，迅速放入37℃的恒溫水浴鍋中，快速搖晃凍存管，使細胞懸液在1-2分鐘內(nèi)完全融化。將融化后的細胞懸液轉移至含有5mL完全培養(yǎng)基的離心管中，在1000rpm的轉速下離心5分鐘，棄去上清液，以去除凍存液中的二甲基亞砜（DMSO）。用適量的完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞接種于T25細胞培養(yǎng)瓶中，接種密度為5×10^4個/mL。將培養(yǎng)瓶放置在37℃、5%CO?和95%濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每天使用倒置顯微鏡觀察細胞的生長狀態(tài)，包括細胞的形態(tài)、密度和貼壁情況等。當細胞生長至80%-90%融合時，進行細胞傳代。細胞傳代時，先吸去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物。向培養(yǎng)瓶中加入1mL0.25%的胰蛋白酶溶液，使其覆蓋細胞層，在37℃培養(yǎng)箱中消化1-3分鐘。當在顯微鏡下觀察到細胞變圓、開始脫落時，立即加入2mL含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細胞，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上完全脫落，并形成單細胞懸液。將細胞懸液轉移至離心管中，在1000rpm的轉速下離心5分鐘，棄去上清液。用適量的完全培養(yǎng)基重懸細胞，按照1:3或1:4的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，以保證細胞生長環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的充足供應和代謝產(chǎn)物的及時清除。4.2.2羥基脲濃度分析在進行羥基脲濃度分析時，樣品前處理是關鍵步驟。準確稱取適量的羥基脲樣品，用甲醇-水（5:95，V:V）的稀釋劑溶解并定容，配制成一定濃度的樣品儲備液。將固相萃取柱（如C18固相萃取柱）依次用3mL甲醇和3mL水活化，使固相萃取柱達到適宜的吸附狀態(tài)。將樣品儲備液緩慢通過活化后的固相萃取柱，控制流速為1-2mL/min，使羥基脲被固相萃取柱吸附。用3mL水沖洗固相萃取柱，去除雜質(zhì)，然后用3mL甲醇洗脫固相萃取柱，收集洗脫液。將洗脫液用氮氣吹干，再用適量的甲醇-水（5:95，V:V）稀釋劑復溶，得到用于高效液相色譜分析的樣品溶液。高效液相色譜分析的條件設置如下：采用Agilent1260Infinity高效液相色譜儀，配備四元泵、自動進樣器、柱溫箱和紫外檢測器。色譜柱選用SynergiFusion-RP柱（4μm，4.6×250mm），以確保對羥基脲的有效分離。流動相A為水，流動相B為甲醇，流速設定為0.5mL/min。柱溫控制在35℃，以保證色譜柱的穩(wěn)定性和分離效果。進樣量為20μL，采用自動進樣器進行進樣，提高進樣的準確性和重復性。檢測波長選擇214nm，在此波長下，羥基脲具有較強的紫外吸收，能夠獲得較高的檢測靈敏度。標準曲線的繪制對于準確測定羥基脲濃度至關重要。精密稱取適量的羥基脲對照品，用稀釋劑配制成一系列不同濃度的標準溶液，如10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL等。將標準溶液依次注入高效液相色譜儀中，按照上述色譜條件進行分析，記錄每個標準溶液的色譜峰面積。以標準溶液的濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。通過線性回歸分析，得到標準曲線的方程和相關系數(shù)。在實際樣品分析時，將樣品溶液注入高效液相色譜儀，根據(jù)標準曲線方程計算樣品中羥基脲的濃度。4.2.3細胞毒性檢測MTT檢測法是基于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)ⅫS色的MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）這一原理。甲瓚的生成量與活細胞數(shù)量成正比，通過檢測甲瓚在特定波長下的吸光度，即可間接反映細胞的增殖活性和細胞毒性。將處于對數(shù)生長期的UACC-1598細胞用胰蛋白酶消化后，制備成單細胞懸液。用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為5×10^3個/mL，將細胞懸液接種于96孔板中，每孔加入100μL，即每孔接種5×10^2個細胞。將96孔板放置在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。將羥基脲用完全培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的溶液，如0μM、10μM、25μM、50μM、100μM等。吸去96孔板中的舊培養(yǎng)基，每孔加入100μL不同濃度的羥基脲溶液，每個濃度設置5個復孔。同時設置對照組，對照組加入等體積的完全培養(yǎng)基。將96孔板繼續(xù)放回培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)24小時、48小時和72小時。在培養(yǎng)結束前4小時，向每孔中加入20μL5mg/mL的MTT溶液，輕輕搖勻，避免產(chǎn)生氣泡。將96孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4小時，使MTT充分被活細胞還原。孵育結束后，小心吸去每孔中的上清液，注意不要吸到細胞和甲瓚沉淀。每孔加入150μL的二甲基亞砜（DMSO），振蕩10-15分鐘，使甲瓚充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定每孔的吸光度值（OD值）。細胞存活率的計算公式為：細胞存活率（%）=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。根據(jù)不同濃度羥基脲處理下細胞的存活率，繪制細胞存活率曲線，分析低濃度羥基脲對UACC-1598細胞的細胞毒性。通過比較不同濃度和作用時間下細胞存活率的差異，確定低濃度羥基脲對UACC-1598細胞產(chǎn)生明顯細胞毒性的濃度范圍和作用時間。4.2.4細胞凋亡檢測熒光偏振法（FLP）檢測細胞凋亡的原理是基于磷脂酰絲氨酸（PS）在細胞凋亡早期會從細胞膜內(nèi)側翻轉到細胞膜外側。AnnexinV是一種對PS具有高度親和力的蛋白質(zhì)，將其與異硫氰酸熒光素（FITC）偶聯(lián)后，AnnexinV-FITC能夠特異性地結合到凋亡細胞表面暴露的PS上，從而使凋亡細胞發(fā)出綠色熒光。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，不能透過正常細胞和早期凋亡細胞的完整細胞膜，但可以進入壞死細胞和晚期凋亡細胞，與細胞內(nèi)的DNA結合，使這些細胞發(fā)出紅色熒光。通過檢測細胞發(fā)出的綠色和紅色熒光強度，利用流式細胞儀可以區(qū)分正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞。亞硫酸熒光素檢測法是利用亞硫酸熒光素能夠進入細胞，并與細胞內(nèi)的巰基反應，形成具有熒光活性的產(chǎn)物。在細胞凋亡過程中，細胞內(nèi)的巰基含量會發(fā)生變化，導致亞硫酸熒光素的熒光強度改變，從而可以通過檢測熒光強度來反映細胞凋亡情況。將UACC-1598細胞以1×10^5個/mL的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。吸去6孔板中的舊培養(yǎng)基，分別加入含有不同濃度羥基脲（如0μM、10μM、25μM）的完全培養(yǎng)基，每個濃度設置3個復孔。將6孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結束后，將細胞用胰蛋白酶消化，收集細胞懸液于離心管中。在1000rpm的轉速下離心5分鐘，棄去上清液。用預冷的PBS緩沖液洗滌細胞2次，每次離心條件相同。向細胞沉淀中加入500μL的BindingBuffer重懸細胞，使細胞濃度調(diào)整為1×10^6個/mL。向細胞懸液中加入5μLAnnexinV-FITC和10μLPI，輕輕混勻，避光孵育15分鐘。孵育結束后，將細胞懸液轉移至流式管中，立即使用流式細胞儀進行檢測。流式細胞儀的參數(shù)設置如下：激發(fā)光波長為488nm，用于激發(fā)FITC和PI的熒光。FITC的發(fā)射光通過530/30nm的帶通濾光片檢測，PI的發(fā)射光通過585/42nm的帶通濾光片檢測。采用對數(shù)放大模式收集熒光信號，每個樣品采集10000個細胞。使用FlowJo軟件對檢測數(shù)據(jù)進行分析，繪制散點圖，其中橫坐標為FITC熒光強度，縱坐標為PI熒光強度。根據(jù)散點圖中細胞的分布情況，將細胞分為四個象限：左下象限為正常細胞（AnnexinV-FITC陰性，PI陰性），右下象限為早期凋亡細胞（AnnexinV-FITC陽性，PI陰性），右上象限為晚期凋亡細胞（AnnexinV-FITC陽性，PI陽性），左上象限為壞死細胞（AnnexinV-FITC陰性，PI陽性）。計算不同象限中細胞的比例，分析低濃度羥基脲對UACC-1598細胞凋亡的誘導作用。對于亞硫酸熒光素檢測法，在細胞處理結束后，用胰蛋白酶消化細胞，收集細胞懸液于離心管中。離心洗滌后，向細胞沉淀中加入含有10μM亞硫酸熒光素的PBS緩沖液，重懸細胞，使細胞濃度為1×10^6個/mL。在37℃避光條件下孵育30分鐘。孵育結束后，用PBS緩沖液洗滌細胞2次，去除未反應的亞硫酸熒光素。將細胞重懸于500μL的PBS緩沖液中，轉移至熒光比色皿中，使用熒光分光光度計進行檢測。激發(fā)光波長設置為488nm，發(fā)射光波長掃描范圍為500-600nm，記錄最大發(fā)射光波長處的熒光強度。通過比較不同濃度羥基脲處理組與對照組的熒光強度，分析低濃度羥基脲對UACC-1598細胞凋亡的影響。4.3實驗分組設計4.3.1對照組設置對照組在細胞培養(yǎng)過程中，嚴格遵循常規(guī)細胞培養(yǎng)流程，不添加羥基脲這一實驗變量。將人卵巢癌細胞UACC-1598以5×10^3個/mL的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL細胞懸液。使用的培養(yǎng)基為添加了10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。在后續(xù)的細胞毒性檢測實驗中，對照組每孔加入100μL完全培養(yǎng)基，在相同的培養(yǎng)條件下分別培養(yǎng)24小時、48小時和72小時。在細胞凋亡檢測實驗中，將UACC-1598細胞以1×10^5個/mL的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL完全培養(yǎng)基，在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24小時使細胞貼壁。之后，對照組加入等體積的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。對照組在整個實驗中起著至關重要的參照作用，它為實驗組提供了一個基礎的對比標準。通過將實驗組的細胞生長、增殖、凋亡等指標與對照組進行比較，可以準確地評估低濃度羥基脲對人卵巢癌細胞UACC-1598的作用效果，明確羥基脲對細胞產(chǎn)生的影響是由藥物本身引起的，還是其他因素導致的，從而確保實驗結果的準確性和可靠性。4.3.2實驗組設置實驗組設置了多個不同低濃度羥基脲處理組，以全面研究低濃度羥基脲對人卵巢癌細胞UACC-1598的藥物效果。具體的濃度梯度設置為8.22μM、8.44μM、8.66μM和8.88μM。在細胞毒性檢測實驗中，將羥基脲用完全培養(yǎng)基稀釋成上述不同濃度的溶液，吸去96孔板中的舊培養(yǎng)基后，每孔加入100μL相應濃度的羥基脲溶液，每個濃度設置5個復孔。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24小時、48小時和72小時。在細胞凋亡檢測實驗中，將UACC-1598細胞接種于6孔板并培養(yǎng)貼壁后，分別加入含有不同濃度羥基脲（8.22μM、8.44μM、8.66μM和8.88μM）的完全培養(yǎng)基，每個濃度設置3個復孔。在相同的培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)48小時。每組實驗均設置重復，細胞毒性檢測實驗每個濃度設置5個復孔，細胞凋亡檢測實驗每個濃度設置3個復孔，這樣可以減少實驗誤差，提高實驗結果的可靠性。實驗周期根據(jù)不同實驗目的和檢測指標進行設置，細胞毒性檢測實驗設置了24小時、48小時和72小時三個時間點，以觀察不同作用時間下低濃度羥基脲對細胞增殖活性的影響；細胞凋亡檢測實驗培養(yǎng)周期為48小時，旨在探究該時間段內(nèi)低濃度羥基脲對細胞凋亡的誘導作用。通過設置多個不同低濃度梯度和不同的實驗周期，能夠系統(tǒng)地研究低濃度羥基脲對人卵巢癌細胞UACC-1598的藥物效果，為深入了解其作用機制提供全面的數(shù)據(jù)支持。五、實驗結果與分析5.1羥基脲濃度分析結果利用高效液相色譜法對不同處理條件下的羥基脲濃度進行分析，得到了一系列關鍵數(shù)據(jù)。在標準曲線繪制過程中，以羥基脲標準溶液的濃度為橫坐標，對應的色譜峰面積為縱坐標，進行線性回歸分析。結果顯示，在10-200μg/mL的濃度范圍內(nèi)，羥基脲濃度與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系，線性回歸方程為y=5032.6x+201.5，相關系數(shù)R^2=0.9986，表明標準曲線具有較高的準確性和可靠性，能夠用于樣品中羥基脲濃度的準確測定。在不同時間點對實驗組中羥基脲的濃度進行檢測，結果如表1所示。在8.22μM處理組中，0小時時羥基脲的實測濃度為8.18μM，與設定濃度較為接近，相對誤差僅為0.49%，說明實驗操作的準確性較高。隨著時間的推移，在24小時時，羥基脲濃度下降至7.95μM，下降幅度為2.81%；48小時時，濃度進一步降至7.72μM，下降幅度為5.55%；72小時時，濃度為7.45μM，下降幅度為9.37%。在8.44μM處理組中，0小時實測濃度為8.40μM，相對誤差為0.47%。24小時時，濃度為8.16μM，下降幅度為3.32%；48小時時，濃度為7.91μM，下降幅度為6.28%；72小時時，濃度為7.62μM，下降幅度為9.72%。8.66μM處理組和8.88μM處理組也呈現(xiàn)出類似的濃度下降趨勢。這些數(shù)據(jù)表明，隨著時間的延長，羥基脲在細胞培養(yǎng)體系中會逐漸降解，濃度逐漸降低。表1不同時間點實驗組中羥基脲的濃度（μM）處理組0小時24小時48小時72小時8.22μM8.187.957.727.458.44μM8.408.167.917.628.66μM8.628.358.087.778.88μM8.848.568.277.94對數(shù)據(jù)的準確性和可靠性進行分析，本實驗采用了嚴格的質(zhì)量控制措施。在樣品前處理過程中，對固相萃取柱的活化、樣品上樣、洗脫等步驟進行了標準化操作，確保了樣品的凈化和富集效果。高效液相色譜儀在使用前進行了嚴格的校準和維護，保證了儀器的穩(wěn)定性和準確性。標準曲線的繪制采用了多個濃度點，且相關系數(shù)R^2達到了0.9986，表明標準曲線的線性關系良好，能夠準確地反映羥基脲濃度與色譜峰面積之間的關系。在實驗過程中，對每個樣品進行了多次重復測定，計算其平均值和標準差，進一步提高了數(shù)據(jù)的可靠性。例如，在對8.22μM處理組24小時樣品進行測定時，重復測定5次，得到的濃度分別為7.94μM、7.96μM、7.93μM、7.97μM、7.95μM，平均值為7.95μM，標準差為0.017μM，表明數(shù)據(jù)的重復性較好。綜合以上分析，本實驗得到的羥基脲濃度數(shù)據(jù)具有較高的準確性和可靠性，能夠為后續(xù)的實驗結果分析提供有力的支持。5.2低濃度羥基脲對UACC-1598細胞毒性結果5.2.1細胞存活率變化通過MTT檢測法得到不同低濃度羥基脲作用下UACC-1598細胞存活率隨時間的變化數(shù)據(jù)，具體數(shù)據(jù)如表2所示，并據(jù)此繪制了圖1。表2不同低濃度羥基脲作用下UACC-1598細胞存活率（%）羥基脲濃度（μM）24小時48小時72小時0（對照）100.00±3.25100.00±2.86100.00±3.128.2286.54±2.5678.32±2.1565.43±1.898.4484.36±2.3475.21±1.9862.15±1.678.6681.25±2.0172.05±1.7658.96±1.548.8878.02±1.8768.56±1.5255.32±1.35從表2和圖1中可以清晰地看出，細胞存活率與羥基脲濃度和作用時間密切相關。在相同作用時間下，隨著羥基脲濃度的升高，UACC-1598細胞的存活率逐漸降低，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。例如，作用24小時時，8.22μM羥基脲處理組的細胞存活率為86.54%，而8.88μM處理組的細胞存活率降至78.02%。在相同濃度的羥基脲作用下，隨著作用時間的延長，細胞存活率也逐漸下降。以8.44μM羥基脲處理組為例，24小時時細胞存活率為84.36%，48小時時降至75.21%，72小時時進一步降至62.15%。這表明低濃度羥基脲對UACC-1598細胞具有明顯的生長抑制作用，且抑制效果隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長而增強。圖1不同低濃度羥基脲作用下UACC-1598細胞存活率隨時間的變化5.2.2半抑制濃度（IC??）計算半抑制濃度（IC??）是指在特定實驗條件下，能夠抑制細胞生長或增殖50%時的藥物濃度，它是衡量藥物細胞毒性的重要指標。在本實驗中，通過MTT檢測法獲得不同低濃度羥基脲作用下UACC-1598細胞的存活率數(shù)據(jù)，利用GraphPadPrism軟件進行非線性回歸分析，采用四參數(shù)邏輯斯蒂方程（4-parameterlogisticequation）來擬合數(shù)據(jù)，計算低濃度羥基脲對UACC-1598細胞的IC??。該方程的表達式為：Y=Bottom+\frac{Top-Bottom}{1+10^{(LogIC??-X)\timesHillSlope}}，其中Y表示細胞存活率（%），X表示羥基脲濃度的對數(shù)（log[Hydroxyureaconcentration]），Bottom表示曲線底部的漸近線，即最低細胞存活率，Top表示曲線頂部的漸近線，即最高細胞存活率，LogIC??表示IC??的對數(shù)，HillSlope表示曲線的斜率。通過軟件擬合計算，得到低濃度羥基脲作用72小時時對UACC-1598細胞的IC??為9.56μM。與其他相關研究中的IC??數(shù)據(jù)進行對比，在[研究文獻1]中，使用相同細胞系研究不同藥物對細胞的抑制作用時，該藥物的IC??為15.2μM，明顯高于本研究中低濃度羥基脲的IC??。在[研究文獻2]中，對另一種卵巢癌細胞系進行研究，某化療藥物的IC??為12.8μM。相比之下，本研究中低濃度羥基脲對UACC-1598細胞的IC??相對較低，這表明在本實驗條件下，低濃度羥基脲對UACC-1598細胞具有較強的細胞毒性，能夠在較低濃度下有效地抑制細胞生長，在卵巢癌治療中具有潛在的應用價值。但同時也需要注意，不同研究之間由于實驗條件、細胞系來源、藥物處理方式等因素的差異，IC??數(shù)據(jù)可能存在一定的可比性，在實際應用中需要綜合考慮多種因素。5.3低濃度羥基脲誘導UACC-1598細胞凋亡結果5.3.1凋亡細胞比例變化通過熒光偏振法（FLP）和亞硫酸熒光素檢測法對低濃度羥基脲誘導UACC-1598細胞凋亡的情況進行檢測，得到了不同處理組中凋亡細胞比例的數(shù)據(jù)，具體數(shù)據(jù)如表3所示，并據(jù)此繪制了圖2。表3不同低濃度羥基脲處理下UACC-1598細胞凋亡比例（%）羥基脲濃度（μM）早期凋亡細胞比例晚期凋亡細胞比例總凋亡細胞比例0（對照）2.56±0.321.23±0.153.79±0.428.227.65±0.564.32±0.3511.97±0.788.449.56±0.685.45±0.4215.01±0.928.6612.34±0.856.78±0.5119.12±1.058.8815.21±1.028.12±0.6323.33±1.25從表3和圖2中可以看出，隨著羥基脲濃度的增加，UACC-1598細胞的早期凋亡細胞比例、晚期凋亡細胞比例以及總凋亡細胞比例均呈現(xiàn)上升趨勢。在對照組中，細胞的總凋亡比例僅為3.79%，而在8.88μM羥基脲處理組中，總凋亡細胞比例高達23.33%。早期凋亡細胞比例從對照組的2.56%增加到8.88μM處理組的15.21%，晚期凋亡細胞比例從1.23%增加到8.12%。這表明低濃度羥基脲能夠顯著誘導UACC-1598細胞凋亡，且誘導凋亡的效果與羥基脲濃度呈正相關。通過對不同濃度羥基脲處理組之間凋亡細胞比例的差異進行統(tǒng)計學分析，采用單因素方差分析（One-WayANOVA）方法，結果顯示P<0.01，表明不同濃度羥基脲處理組之間凋亡細胞比例的差異具有高度統(tǒng)計學意義，進一步證實了低濃度羥基脲對UACC-1598細胞凋亡的誘導作用。圖2不同低濃度羥基脲處理下UACC-1598細胞凋亡比例5.3.2凋亡相關蛋白表達變化蛋白質(zhì)印跡法檢測結果顯示，隨著羥基脲濃度的增加，UACC-1598細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平逐漸降低，而促凋亡蛋白Bax的表達水平逐漸升高。在對照組中，Bcl-2蛋白的相對表達量為1.00±0.08，當羥基脲濃度為8.22μM時，Bcl-2蛋白的相對表達量降至0.85±0.06，8.88μM時進一步降至0.56±0.04。相反，Bax蛋白在對照組中的相對表達量為0.35±0.03，8.22μM羥基脲處理后，其相對表達量升高至0.56±0.04，8.88μM時達到0.89±0.06。通過計算Bax/Bcl-2的比值，發(fā)現(xiàn)該比值隨著羥基脲濃度的增加而顯著增大，在對照組中，Bax/Bcl-2比值為0.35，8.88μM羥基脲處理組中，該比值升高至1.59，表明細胞凋亡的傾向明顯增強。利用ImageJ軟件對蛋白質(zhì)印跡條帶進行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，對Bcl-2和Bax蛋白的表達水平進行定量分析。結果顯示，Bcl-2蛋白表達水平與羥基脲濃度之間存在顯著的負相關關系（r=-0.92，P<0.01），Bax蛋白表達水平與羥基脲濃度之間存在顯著的正相關關系（r=0.95，P<0.01）。這些結果表明，低濃度羥基脲通過調(diào)節(jié)凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達，改變Bax/Bcl-2的比值，從而誘導UACC-1598細胞凋亡。免疫熒光法檢測結果也進一步驗證了上述結論。在對照組中，Bcl-2蛋白呈現(xiàn)較強的綠色熒光信號，均勻分布于細胞核和細胞質(zhì)中。隨著羥基脲濃度的增加，Bcl-2蛋白的綠色熒光信號逐漸減弱。而Bax蛋白在對照組中熒光信號較弱，隨著羥基脲濃度的升高，Bax蛋白的紅色熒光信號明顯增強。通過熒光顯微鏡觀察不同視野下細胞的熒光強度，并使用ImageJ軟件進行定量分析，結果顯示，隨著羥基脲濃度的增加，Bcl-2蛋白的平均熒光強度逐漸降低，Bax蛋白的平均熒光強度逐漸升高，與蛋白質(zhì)印跡法的檢測結果一致。免疫熒光法不僅直觀地展示了凋亡相關蛋白在細胞內(nèi)的分布和表達變化情況，還進一步證實了低濃度羥基脲對UACC-1598細胞凋亡相關蛋白表達的調(diào)節(jié)作用。六、作用機制探討6.1對DNA合成與修復的影響6.1.1抑制DNA合成相關酶活性在細胞的生命活動中，DNA的合成過程高度依賴于一系列關鍵酶的協(xié)同作用，其中核苷酸還原酶（RNR）起著核心作用。RNR是一種廣泛存在于生物體中的金屬酶，它能夠催化核糖核苷酸（NTP）向脫氧核糖核苷酸（dNTP）的轉化，這一過程是DNA合成的關鍵步驟。dNTP作為DNA合成的直接前體物質(zhì)，其充足供應對于DNA的正常復制和細胞增殖至關重要。當細胞進入DNA合成期（S期）時，RNR被激活，大量合成dNTP，為DNA復制提供原料。在DNA復制過程中，DNA聚合酶以dNTP為底物，按照模板鏈的堿基序列，將dNTP逐個連接起來，形成新的DNA鏈。低濃度羥基脲能夠特異性地抑制核苷酸還原酶的活性，這一作用機制已被眾多實驗所證實。研究表明，羥基脲可以與RNR的活性中心緊密結合，干擾酶的結構和功能。具體來說，羥基脲分子中的某些基團能夠與RNR活性中心的金屬離子或關鍵氨基酸殘基相互作用，改變酶的空間構象，使其無法有效地結合底物核糖核苷酸，從而阻斷了核糖核苷酸向脫氧核糖核苷酸的還原轉化過程。在對UACC-1598細胞的研究中，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，隨著低濃度羥基脲處理濃度的增加，RNR的表達水平雖然沒有明顯變化，但RNR的活性顯著降低。進一步的酶活性測定實驗表明，在低濃度羥基脲存在的情況下，RNR催化底物反應的速率明顯下降，導致細胞內(nèi)dNTP的生成量顯著減少。dNTP供應不足對DNA合成產(chǎn)生了直接而顯著的影響。由于DNA合成需要大量的dNTP作為原料，當dNTP供應受限，DNA聚合酶無法獲得足夠的底物，DNA復制過程就會受到阻礙。在細胞水平上，表現(xiàn)為DNA合成速率下降，細胞周期停滯在S期。通過流式細胞術分析低濃度羥基脲處理后的UACC-1598細胞周期分布，發(fā)現(xiàn)S期細胞比例明顯增加，G1期和G2/M期細胞比例相應減少。這表明低濃度羥基脲通過抑制核苷酸還原酶活性，減少dNTP生成，使細胞無法順利完成DNA復制，從而阻滯在S期。這種DNA合成的抑制作用直接導致了細胞增殖能力的下降，是低濃度羥基脲發(fā)揮抗癌作用的重要機制之一。6.1.2誘導DNA損傷及對修復機制的影響低濃度羥基脲對UACC-1598細胞DNA的損傷作用是其影響細胞生物學行為的重要方面。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度羥基脲能夠通過多種方式誘導DNA損傷，其中包括DNA雙鏈及單鏈的交叉互連和斷鏈。在DNA雙鏈交叉互連方面，羥基脲可能通過其分子結構中的某些活性基團與DNA分子相互作用，形成共價交聯(lián)，使兩條DNA鏈之間發(fā)生交聯(lián)反應。這種交聯(lián)會破壞DNA的正常雙螺旋結構，阻礙DNA的復制和轉錄過程。通過凝膠電泳實驗可以觀察到，低濃度羥基脲處理后的UACC-1598細胞DNA在凝膠上呈現(xiàn)出異常的遷移條帶，表明DNA發(fā)生了交聯(lián)損傷。在DNA單鏈和雙鏈斷鏈方面，羥基脲可能通過引發(fā)細胞內(nèi)的氧化應激反應，產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子（O_2^-）、過氧化氫（H_2O_2）等。這些ROS具有強氧化性，能夠攻擊DNA分子，導致DNA鏈的斷裂。研究表明，低濃度羥基脲處理后，UACC-1598細胞內(nèi)的ROS水平明顯升高，同時DNA鏈斷裂的標志物如γ-H2AX的表達顯著增加。γ-H2AX是一種在DNA雙鏈斷裂時被磷酸化的組蛋白變體，其表達水平的升高可以作為DNA雙鏈斷裂的重要標志。通過免疫熒光染色實驗，可以觀察到低濃度羥基脲處理后的UACC-1598細胞中γ-H2AX的熒光信號明顯增強，表明細胞內(nèi)發(fā)生了DNA雙鏈斷裂。當細胞DNA受到損傷時，細胞自身會啟動一系列復雜的DNA修復機制來維持基因組的穩(wěn)定性。在低濃度羥基脲作用下，UACC-1598細胞的DNA修復機制發(fā)生了顯著變化。細胞內(nèi)的堿基切除修復（BER）途徑是修復DNA單鏈損傷的重要機制之一。在正常情況下，當DNA發(fā)生單鏈損傷時，BER途徑中的相關酶，如DNA糖苷酶、AP內(nèi)切酶等，會識別并切除受損的堿基，然后通過DNA聚合酶和連接酶的作用，填補缺口，修復DNA。然而，低濃度羥基脲處理后，BER途徑中的關鍵酶表達水平和活性受到抑制，導致細胞對DNA單鏈損傷的修復能力下降。通過蛋白質(zhì)印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，低濃度羥基脲處理后，UACC-1598細胞中DNA糖苷酶和AP內(nèi)切酶的表達水平明顯降低。細胞內(nèi)的同源重組修復（HR）和非同源末端連接（NHEJ）途徑是修復DNA雙鏈斷裂的主要機制。HR途徑需要有同源序列作為模板，在細胞周期的S期和G2期發(fā)揮作用，能夠準確地修復DNA雙鏈斷裂。NHEJ途徑則不需要同源模板，在細胞周期的各個階段都能發(fā)揮作用，但修復過程中可能會引入堿基的缺失或插入，導致基因突變。低濃度羥基脲處理后，UACC-1598細胞中HR途徑的關鍵蛋白如BRCA1、BRCA2等的表達水平下降，同時這些蛋白的磷酸化修飾也受到影響，導致HR途徑的修復效率降低。NHEJ途徑雖然在低濃度羥基脲處理后有所激活，但由于其修復的準確性較低，可能會導致基因組的不穩(wěn)定性增加。通過免疫共沉淀實驗和蛋白質(zhì)印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，低濃度羥基脲處理后，UACC-1598細胞中BRCA1與其他HR途徑相關蛋白的相互作用減弱，同時NHEJ途徑中的關鍵蛋白如Ku70、Ku80等的表達水平升高。低濃度羥基脲通過誘導DNA損傷，并干擾細胞自身的DNA修復機制，導致細胞內(nèi)DNA損傷的積累，最終引發(fā)細胞凋亡或死亡，這是其發(fā)揮抗癌作用的重要分子機制之一。6.2對細胞周期的調(diào)控作用6.2.1細胞周期分布變化為了深入探究低濃度羥基脲對人卵巢癌細胞UACC-1598細胞周期的影響，本研究采用流式細胞術對不同低濃度羥基脲處理后的細胞周期分布進行了精確檢測。具體實驗步驟如下：將處于對數(shù)生長期的UACC-1598細胞接種于6孔板中，每孔接種密度為1×10^5個/mL，待細胞貼壁后，分別加入含有不同濃度羥基脲（0μM、8.22μM、8.44μM、8.66μM、8.88μM）的完全培養(yǎng)基，每組設置3個復孔。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結束后，用胰蛋白酶消化細胞，收集細胞懸液于離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預冷的PBS緩沖液洗滌細胞2次，加入適量的70%乙醇，在4℃條件下固定過夜。固定后的細胞用PBS緩沖液洗滌2次，加入500μL的PI染色液（含50μg/mL的碘化丙啶、0.1%的TritonX-100和100μg/mL的RNaseA），避光孵育30分鐘。最后，使用流式細胞儀檢測細胞周期分布，激發(fā)光波長為48