HPV通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路致宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義宮頸癌作為女性生殖系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著全球女性的健康與生命。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年約有數(shù)十萬(wàn)名女性被診斷為宮頸癌，其發(fā)病率在女性惡性腫瘤中位居前列，死亡率也不容忽視，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。在我國(guó)，宮頸癌同樣是一個(gè)嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問(wèn)題，每年新發(fā)病例眾多，且近年來(lái)呈現(xiàn)出年輕化的趨勢(shì)，對(duì)年輕女性的生活質(zhì)量和生育功能造成了極大的影響。大量研究表明，人乳頭瘤病毒（HPV）感染是宮頸癌形成的主要原因之一。HPV是一類(lèi)具有高度宿主特異性和親和力、無(wú)包膜的小雙鏈環(huán)狀DNA病毒，目前已發(fā)現(xiàn)120余種亞型。其中，高危型HPV的持續(xù)性感染與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，超過(guò)2/3的宮頸癌標(biāo)本被檢測(cè)出HPV16或18陽(yáng)性。高危型HPV的DNA可隨機(jī)整合到宿主基因組中，表達(dá)E6、E7癌基因，這些癌基因編碼的蛋白能夠分別與抑癌蛋白p53和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑制蛋白（pRB）結(jié)合，使其失去抑癌功能，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖和癌變。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指在某些生理或病理狀態(tài)下，上皮細(xì)胞失去極性，轉(zhuǎn)換成具有活動(dòng)能力、能夠在細(xì)胞基質(zhì)間自由移動(dòng)的間質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程。在腫瘤領(lǐng)域，EMT與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，它們會(huì)獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如細(xì)胞間連接減弱、遷移和侵襲能力增強(qiáng)等，從而更容易突破基底膜，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，深入研究腫瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程，對(duì)于理解腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要意義。在誘導(dǎo)EMT發(fā)生的眾多細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）被證實(shí)是關(guān)鍵因子之一。TGF-β信號(hào)通路的激活參與細(xì)胞分化、增殖和凋亡等多種細(xì)胞生命過(guò)程的調(diào)控。TGF-β1與其受體在細(xì)胞膜上結(jié)合形成共受體受體二聚體，激活受體1的多肽酶，在細(xì)胞內(nèi)磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)分子Smad，Smad進(jìn)入細(xì)胞核后與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，控制靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的生物學(xué)效應(yīng)。除TGF-β1外，其他轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子如胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF1）等也在腫瘤的EMT過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前，雖然已經(jīng)明確HPV感染是宮頸癌的主要病因，但HPV如何導(dǎo)致宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路在這一過(guò)程中扮演何種角色，仍有待進(jìn)一步深入研究。探究HPV致宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路的作用機(jī)制，有助于我們從分子層面深入理解宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，為開(kāi)發(fā)針對(duì)宮頸癌的新型診斷方法、治療策略以及預(yù)防措施提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與問(wèn)題提出本研究旨在深入揭示HPV經(jīng)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路導(dǎo)致宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的內(nèi)在機(jī)制，為宮頸癌的防治提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。圍繞這一核心目的，提出以下具體研究問(wèn)題：HPV感染如何影響宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化？：HPV感染在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，但HPV如何具體調(diào)控宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程尚未完全明確。需要探究HPV感染后，宮頸癌細(xì)胞的上皮細(xì)胞標(biāo)志物（如E-鈣粘蛋白）和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（如N-鈣粘蛋白、波形蛋白等）表達(dá)變化情況，以及細(xì)胞形態(tài)和功能（遷移、侵襲能力等）的改變，從而明確HPV感染對(duì)宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響方式和程度。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路在HPV致宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中扮演什么角色？：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞多種生命過(guò)程的重要信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，在HPV致宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的背景下，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路中各關(guān)鍵分子（如TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad家族蛋白等）的表達(dá)、活性變化以及它們之間的相互作用關(guān)系如何，是否介導(dǎo)了HPV對(duì)宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)作用，這些問(wèn)題亟待解答。HPV是否通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路關(guān)鍵分子來(lái)促進(jìn)宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化？：進(jìn)一步深入探究HPV感染與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路之間的聯(lián)系，明確HPV是否通過(guò)上調(diào)或下調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，如TGF-β1及其受體、Smad蛋白等，從而激活或抑制該信號(hào)通路，最終促進(jìn)宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生發(fā)展。阻斷轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路能否抑制HPV誘導(dǎo)的宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化？：基于前面問(wèn)題的研究結(jié)果，嘗試通過(guò)使用信號(hào)通路抑制劑、基因沉默等方法阻斷轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路，觀察其對(duì)HPV感染的宮頸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，包括細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)、細(xì)胞形態(tài)和遷移侵襲能力等方面的變化，為宮頸癌的治療提供潛在的干預(yù)策略。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1HPV與宮頸癌的關(guān)系研究HPV感染與宮頸癌的緊密聯(lián)系已在國(guó)內(nèi)外研究中達(dá)成廣泛共識(shí)。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）的大量研究數(shù)據(jù)表明，高危型HPV的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件。分子流行病學(xué)研究顯示，全球范圍內(nèi)超過(guò)99%的宮頸癌組織中能檢測(cè)到HPVDNA，其中HPV16和HPV18亞型在宮頸癌標(biāo)本中的陽(yáng)性檢出率超過(guò)2/3。國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)對(duì)大量宮頸癌患者的臨床樣本分析，也進(jìn)一步證實(shí)了HPV感染在宮頸癌發(fā)病中的關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)不同地區(qū)的宮頸癌患者中，HPV16和HPV18同樣是主要的感染亞型，且感染率與全球數(shù)據(jù)相近。關(guān)于HPV致癌的分子機(jī)制，國(guó)內(nèi)外研究均聚焦于HPV病毒癌基因E6和E7。國(guó)外研究率先揭示了E6蛋白能夠與抑癌蛋白p53結(jié)合，促進(jìn)其降解，使細(xì)胞失去p53介導(dǎo)的細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡功能；E7蛋白則與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑制蛋白pRB結(jié)合，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，推動(dòng)細(xì)胞異常增殖。國(guó)內(nèi)學(xué)者在此基礎(chǔ)上深入研究，發(fā)現(xiàn)HPV感染還會(huì)引發(fā)宿主細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定，導(dǎo)致一系列與腫瘤發(fā)生相關(guān)的信號(hào)通路異常激活。1.3.2轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路的研究轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路作為細(xì)胞生命過(guò)程調(diào)控的關(guān)鍵通路，一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。國(guó)外研究在該通路的基礎(chǔ)理論方面取得了豐碩成果，詳細(xì)解析了TGF-β信號(hào)通路的激活過(guò)程：TGF-β1與其受體TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ在細(xì)胞膜上結(jié)合形成共受體受體二聚體，激活受體1的多肽酶，進(jìn)而在細(xì)胞內(nèi)磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)分子Smad，磷酸化的Smad進(jìn)入細(xì)胞核后與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。在腫瘤研究領(lǐng)域，國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)TGF-β信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有雙重作用，在腫瘤早期，它可以抑制細(xì)胞增殖，發(fā)揮抑癌作用；而在腫瘤進(jìn)展期，卻能通過(guò)誘導(dǎo)EMT等機(jī)制促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。國(guó)內(nèi)研究在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路方面也有重要進(jìn)展。學(xué)者們不僅驗(yàn)證了國(guó)外研究的部分成果，還發(fā)現(xiàn)該信號(hào)通路在不同腫瘤類(lèi)型中的獨(dú)特作用機(jī)制。例如，在肝癌中，TGF-β信號(hào)通路通過(guò)與其他信號(hào)通路（如Wnt/β-catenin信號(hào)通路）相互作用，共同調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外，國(guó)內(nèi)研究還致力于尋找針對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路的潛在治療靶點(diǎn)，為腫瘤的治療提供新策略。1.3.3宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的重要作用受到了國(guó)內(nèi)外研究者的高度關(guān)注。國(guó)外研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型，明確了EMT過(guò)程中宮頸癌細(xì)胞的形態(tài)和功能變化，如上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘蛋白表達(dá)降低，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣粘蛋白、波形蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)。同時(shí)，國(guó)外學(xué)者還鑒定出一系列參與宮頸癌EMT的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路，如Snail、Twist等轉(zhuǎn)錄因子以及PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路。國(guó)內(nèi)研究在宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化方面也有獨(dú)特貢獻(xiàn)。學(xué)者們從臨床樣本出發(fā)，分析了EMT相關(guān)標(biāo)志物在宮頸癌組織中的表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)E-鈣粘蛋白低表達(dá)、N-鈣粘蛋白高表達(dá)的宮頸癌患者往往具有更高的腫瘤分期、更差的預(yù)后。此外，國(guó)內(nèi)研究還探討了中藥提取物等天然產(chǎn)物對(duì)宮頸癌EMT的抑制作用及其機(jī)制，為宮頸癌的治療提供了新的思路。1.3.4HPV、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路與宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化關(guān)系的研究盡管HPV、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路以及宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化各自的研究取得了顯著進(jìn)展，但三者之間的內(nèi)在聯(lián)系研究仍存在諸多不足。目前，關(guān)于HPV感染如何通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路誘導(dǎo)宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的具體分子機(jī)制尚未完全明確。國(guó)內(nèi)外研究雖有一些初步發(fā)現(xiàn)，如HPV感染可上調(diào)TGF-β1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的EMT，但對(duì)于HPV感染后，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路中各關(guān)鍵分子之間的相互作用細(xì)節(jié)，以及這些作用如何協(xié)同調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達(dá)，仍有待深入探究。在研究模型方面，現(xiàn)有研究多依賴于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型，與臨床實(shí)際情況存在一定差距。如何建立更貼近臨床的研究模型，以更準(zhǔn)確地模擬HPV感染、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路激活與宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在患者體內(nèi)的真實(shí)過(guò)程，是亟待解決的問(wèn)題。此外，針對(duì)三者關(guān)系的研究成果向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化也相對(duì)滯后，目前缺乏基于這些機(jī)制研究的有效臨床治療策略和診斷方法。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1宮頸癌概述宮頸癌是發(fā)生于子宮頸部位的惡性腫瘤，是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。其發(fā)病情況在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出一定的地域差異，在發(fā)展中國(guó)家，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率相對(duì)較高，是嚴(yán)重威脅女性健康的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題；而在發(fā)達(dá)國(guó)家，由于廣泛開(kāi)展宮頸癌篩查，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率已顯著下降。在我國(guó)，每年新發(fā)病例數(shù)眾多，且近年來(lái)呈現(xiàn)出年輕化趨勢(shì)，對(duì)年輕女性的身心健康造成了極大影響。從病理類(lèi)型來(lái)看，宮頸癌主要包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和腺鱗癌。其中，鱗狀細(xì)胞癌最為常見(jiàn)，約占宮頸癌的75%-80%，其癌細(xì)胞起源于宮頸鱗狀上皮細(xì)胞，形態(tài)上呈現(xiàn)出不同程度的角化和細(xì)胞間橋形成。腺癌占比約為20%-25%，起源于宮頸腺體細(xì)胞，癌細(xì)胞排列成腺樣結(jié)構(gòu)。腺鱗癌相對(duì)少見(jiàn)，約占3%-5%，兼具鱗癌和腺癌的特征。不同病理類(lèi)型的宮頸癌在發(fā)病機(jī)制、臨床特征和治療反應(yīng)等方面存在一定差異。宮頸癌在早期通常無(wú)明顯癥狀，部分患者可能僅表現(xiàn)為宮頸糜爛樣改變，容易被忽視。隨著病情進(jìn)展，患者會(huì)逐漸出現(xiàn)一系列典型癥狀。接觸性陰道出血是最常見(jiàn)的癥狀之一，多發(fā)生在性生活后或婦科檢查后，這是由于腫瘤組織質(zhì)地脆弱，受到外力刺激后容易出血。不規(guī)則陰道流血也是常見(jiàn)表現(xiàn)，可表現(xiàn)為月經(jīng)量增多、經(jīng)期延長(zhǎng)或非經(jīng)期出血。陰道排液也較為常見(jiàn)，多數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)白色或血性、稀薄如水樣或米泔狀的陰道分泌物，晚期患者因癌組織壞死伴感染，可出現(xiàn)大量米泔樣或膿性惡臭白帶。當(dāng)癌灶累及鄰近組織器官或神經(jīng)時(shí)，還會(huì)引起一系列繼發(fā)性癥狀，如尿頻、尿急、便秘、下肢腫痛等；癌腫壓迫或累及輸尿管時(shí)，可導(dǎo)致輸尿管梗阻、腎盂積水及尿毒癥；此外，患者還可能出現(xiàn)貧血、惡病質(zhì)等全身衰竭癥狀。目前，宮頸癌的診斷主要依靠多種方法的綜合應(yīng)用。宮頸細(xì)胞學(xué)檢查是宮頸癌篩查的重要手段之一，通過(guò)采集宮頸表面的細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化，以發(fā)現(xiàn)異常細(xì)胞，常用的方法包括傳統(tǒng)的巴氏涂片和液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查（TCT），TCT技術(shù)能更有效地收集細(xì)胞，提高診斷準(zhǔn)確性。人乳頭瘤病毒（HPV）檢測(cè)也是重要的篩查方法，由于高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌的主要病因，檢測(cè)HPV病毒類(lèi)型及感染情況對(duì)于評(píng)估宮頸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。對(duì)于細(xì)胞學(xué)檢查或HPV檢測(cè)異常的患者，通常需要進(jìn)一步進(jìn)行陰道鏡檢查，陰道鏡可以將宮頸放大數(shù)倍，直接觀察宮頸表面的病變情況，并在可疑部位取組織進(jìn)行活檢。宮頸活檢是確診宮頸癌的金標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)對(duì)活檢組織進(jìn)行病理檢查，明確病變的性質(zhì)、類(lèi)型和分級(jí)，為后續(xù)治療提供重要依據(jù)。此外，影像學(xué)檢查如超聲、磁共振成像（MRI）、計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）等也可用于評(píng)估宮頸癌的病變范圍、有無(wú)轉(zhuǎn)移等情況，為制定治療方案提供參考。2.2HPV生物學(xué)特性及其與宮頸癌的關(guān)系HPV屬于乳頭瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，是一類(lèi)無(wú)包膜的雙鏈環(huán)狀DNA病毒。其病毒顆粒呈二十面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，直徑約為55nm。病毒基因組長(zhǎng)度約為7.9kb，包含早期開(kāi)放閱讀框（E1、E2、E4、E5、E6和E7）、晚期開(kāi)放閱讀框（L1和L2）以及一個(gè)長(zhǎng)調(diào)控區(qū)（LCR）。E1和E2基因主要參與病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控；E4基因產(chǎn)物與病毒的裝配和釋放有關(guān)；E5、E6和E7基因則是病毒的癌基因，在病毒致癌過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中，E6蛋白能夠與宿主細(xì)胞內(nèi)的抑癌蛋白p53結(jié)合，促進(jìn)p53的泛素化降解，使細(xì)胞失去p53對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的調(diào)控作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖；E7蛋白則與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑制蛋白pRB結(jié)合，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，啟動(dòng)細(xì)胞周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，推動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入增殖狀態(tài)。L1和L2基因編碼病毒的主要衣殼蛋白和次要衣殼蛋白，它們共同組裝形成病毒的衣殼結(jié)構(gòu)，保護(hù)病毒基因組。長(zhǎng)調(diào)控區(qū)則包含多個(gè)順式作用元件，對(duì)病毒基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制起著重要的調(diào)控作用。根據(jù)HPV與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性，可將其分為高危型和低危型。高危型HPV如HPV16、18、31、33、45、52、58等亞型，持續(xù)感染可引起宮頸癌、肛門(mén)癌、陰道癌等惡性腫瘤，尤其是HPV16和HPV18，它們?cè)趯m頸癌組織中的檢出率最高，是導(dǎo)致宮頸癌的主要亞型。低危型HPV如HPV6、11等亞型，主要引起良性病變，如尖銳濕疣、喉乳頭瘤等。不同亞型的HPV在基因序列、蛋白結(jié)構(gòu)和功能以及致癌能力等方面存在差異。例如，HPV16E6蛋白與p53的結(jié)合能力更強(qiáng)，對(duì)p53的降解作用更顯著，因此其致癌風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)更高。高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要原因。在正常情況下，機(jī)體的免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別和清除HPV感染。然而，當(dāng)機(jī)體免疫功能下降或HPV持續(xù)感染時(shí)，病毒基因組可整合到宿主細(xì)胞基因組中。病毒基因的整合會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞基因表達(dá)紊亂，一方面，病毒癌基因E6和E7的持續(xù)表達(dá)，使p53和pRB的功能喪失，細(xì)胞增殖失控；另一方面，病毒整合還可能引起宿主細(xì)胞染色體的不穩(wěn)定，導(dǎo)致一系列與腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因突變和染色體異常。這些變化逐步推動(dòng)宮頸上皮細(xì)胞從正常細(xì)胞向癌前病變細(xì)胞，再向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。在這個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞周期調(diào)控失衡，細(xì)胞凋亡受阻，細(xì)胞獲得無(wú)限增殖能力，同時(shí)，細(xì)胞的分化和形態(tài)也發(fā)生改變，逐漸失去上皮細(xì)胞的特性，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特征，即發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，這使得癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。2.3上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）概述上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指在特定的生理和病理?xiàng)l件下，上皮細(xì)胞失去其原有的極性和細(xì)胞間連接，逐漸獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過(guò)程。在這個(gè)過(guò)程中，上皮細(xì)胞的形態(tài)從緊密排列的立方狀或柱狀轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂休^強(qiáng)遷移能力的紡錘形或梭形，同時(shí)細(xì)胞的生物學(xué)功能也發(fā)生顯著改變，如獲得更強(qiáng)的遷移、侵襲和抗凋亡能力。EMT的發(fā)生過(guò)程涉及多個(gè)關(guān)鍵步驟。首先是細(xì)胞連接的改變，上皮細(xì)胞間緊密連接（如緊密連接蛋白ZO-1等）和黏著連接（如E-鈣粘蛋白、α-連環(huán)素、β-連環(huán)素等）的表達(dá)減少或功能受損。以E-鈣粘蛋白為例，它是維持上皮細(xì)胞間黏附的重要分子，其表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降，使得上皮細(xì)胞易于分離。同時(shí)，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)也發(fā)生重構(gòu)，角蛋白等上皮細(xì)胞特異性的中間絲蛋白表達(dá)減少，而波形蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）等間質(zhì)細(xì)胞特異性的細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)增加。波形蛋白的增多使得細(xì)胞的形態(tài)更具可塑性，有利于細(xì)胞的遷移。此外，細(xì)胞極性也發(fā)生喪失，上皮細(xì)胞原本具有的頂端-基底極性消失，細(xì)胞表面分子的分布發(fā)生改變，這進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，EMT發(fā)揮著不可或缺的作用。在原腸胚形成階段，通過(guò)EMT，胚胎外層的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有遷移能力的間質(zhì)細(xì)胞，這些間質(zhì)細(xì)胞遷移到胚胎內(nèi)部，參與形成內(nèi)胚層和中胚層等不同胚層結(jié)構(gòu)，為后續(xù)器官的形成奠定基礎(chǔ)。在神經(jīng)嵴形成過(guò)程中，神經(jīng)上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，轉(zhuǎn)化為神經(jīng)嵴細(xì)胞，這些神經(jīng)嵴細(xì)胞隨后遷移到身體的不同部位，分化為多種細(xì)胞類(lèi)型，如神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、色素細(xì)胞等，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能形成至關(guān)重要。在器官發(fā)育方面，如肺、腎、心臟等器官的形成過(guò)程中，EMT也參與其中，調(diào)控細(xì)胞的遷移和分化，塑造器官的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。在腫瘤領(lǐng)域，EMT與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，使得它們能夠突破腫瘤組織周?chē)幕啄??；啄な且粚游挥谏掀ぜ?xì)胞和結(jié)締組織之間的細(xì)胞外基質(zhì)，正常情況下能夠限制上皮細(xì)胞的遷移。腫瘤細(xì)胞通過(guò)下調(diào)E-鈣粘蛋白等細(xì)胞黏附分子，削弱與周?chē)?xì)胞的連接，同時(shí)上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），如MMP-2、MMP-9等，這些酶能夠降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)成分，為腫瘤細(xì)胞的遷移開(kāi)辟道路。腫瘤細(xì)胞借助獲得的遷移和侵襲能力，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，隨著循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)遠(yuǎn)處組織器官。在遠(yuǎn)處組織中，腫瘤細(xì)胞又可以通過(guò)間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（MET），重新獲得上皮細(xì)胞特性，實(shí)現(xiàn)腫瘤的定植和生長(zhǎng)，形成轉(zhuǎn)移灶。此外，EMT還與腫瘤細(xì)胞的耐藥性相關(guān)。發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞往往對(duì)化療藥物、放療等治療手段的敏感性降低，這是因?yàn)樗鼈兊募?xì)胞生物學(xué)特性改變，如細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)變化，導(dǎo)致藥物攝取減少或外排增加；細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的改變，使得細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的抵抗增強(qiáng)等。這給腫瘤的治療帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。2.4轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路相關(guān)理論轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在細(xì)胞和組織的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化中起關(guān)鍵作用，對(duì)細(xì)胞的增殖、細(xì)胞間質(zhì)產(chǎn)生、分化、凋亡，胚胎發(fā)育，器官的形成，免疫功能，炎性反應(yīng)，創(chuàng)傷修復(fù)等有重要的調(diào)節(jié)作用。TGF-β超家族包含多種成員，如TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3等，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能上具有一定的相似性，但在組織分布和生物學(xué)效應(yīng)上也存在差異。以TGF-β1為例，它在多種組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞外基質(zhì)合成、細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)控等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TGF-β超家族成員發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)依賴于其相應(yīng)的受體，目前發(fā)現(xiàn)的TGF-β超家族受體主要有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ和TGF-βRⅢ型受體3種亞型，均包含胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。其中，TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ在信號(hào)傳導(dǎo)中起核心作用，兩個(gè)TGF-βRⅠ和兩個(gè)TGF-βRⅡ分子組成的異源四聚體構(gòu)成功能性受體。TGF-βRⅢ型受體屬于輔助型受體，雖不直接參與信號(hào)傳導(dǎo)，但其主要功能是增加細(xì)胞表面上TGF-β的結(jié)合，并將其提供給Ⅰ型和Ⅱ型受體，且能抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)、生長(zhǎng)和血管的發(fā)生，在腫瘤治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。TGF-β信號(hào)通路的激活起始于配體與受體的結(jié)合。首先，TGF-βRⅡ需要自身磷酸化其氨基酸殘基中Ser213、Ser409才能被激活，其后與TGF-βRⅠ相互作用并激活TGF-βRⅠ。在與TGF-β反應(yīng)之后，TGF-βRⅠ也能發(fā)生酪氨酸殘基的磷酸化，在不存在Ⅱ型受體的情況下，Ⅰ型受體無(wú)法獨(dú)立與TGF-β結(jié)合。被TGF-β活化的Ⅱ型受體磷酸化Ⅰ型受體的GS功能區(qū)（一個(gè)高度保守的甘氨酸及絲氨酸殘基結(jié)構(gòu)域），該區(qū)域在TGF-βRⅠ激酶活化中起著重要作用?；罨蘑裥褪荏w可以磷酸化其下游信號(hào)分子——受體活化的Smad2和Smad3。Smad2和Smad3被SARA（smad-anchorforreceptoractivation）募集到Ⅰ型受體上。被磷酸化的Smad2和Smad3接著與Smad4形成三聚體復(fù)合物，這一復(fù)合物可進(jìn)入細(xì)胞核，在DNA結(jié)合輔助因子的幫助下與DNA上被稱(chēng)為Smad結(jié)合元件（Smad-bindingelement）的區(qū)域結(jié)合后誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、移行、凋亡。完成轉(zhuǎn)錄之后，Smad復(fù)合物能夠解離，磷酸化的R-Smads被細(xì)胞核內(nèi)的磷酸酶（例如PPM1A/PP2C）脫去磷酸基，使這些R-Smads分子重新回到細(xì)胞質(zhì)中，形成一個(gè)“Smad循環(huán)”。在生物體中，TGF-β信號(hào)通路受多種因素控制。微環(huán)境條件，如細(xì)胞外基質(zhì)的組成、酸堿度、氧化還原狀態(tài)等，可影響TGF-β的活性及其信號(hào)通路的傳導(dǎo)；激素，如雌激素、雄激素等，能夠調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)，進(jìn)而影響信號(hào)傳導(dǎo)；細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，像表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）等，可與TGF-β信號(hào)通路相互作用，共同調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為；microRNAs（MiRNAs）也參與TGF-β信號(hào)通路的調(diào)控，通過(guò)與相關(guān)mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，影響其穩(wěn)定性和翻譯過(guò)程，從而調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)；長(zhǎng)的非編碼RNA、磷酸化和去磷酸化激酶，泛素連接酶和去泛素酶以及其他因子等，也都在TGF-β信號(hào)通路的調(diào)控中發(fā)揮作用。此外，TGF-β1/Smads信號(hào)通路與其他信號(hào)途徑存在著廣泛的交流，如與表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、脂多糖、腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等信號(hào)通路相互影響，還可與Wnt信號(hào)、P38等相互作用，不同通路共同構(gòu)成了復(fù)雜的調(diào)節(jié)體系，在保證TGF-β信號(hào)通路正常運(yùn)行的同時(shí)，賦予其復(fù)雜多樣的生物學(xué)效應(yīng)。在腫瘤領(lǐng)域，TGF-β信號(hào)通路具有雙重作用。在腫瘤發(fā)生早期，TGF-β可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，它能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，促使細(xì)胞進(jìn)入靜止期，從而抑制細(xì)胞的增殖；還可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通過(guò)激活一系列凋亡相關(guān)的信號(hào)分子，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。然而，在腫瘤中、晚期，TGF-β對(duì)腫瘤的影響主要表現(xiàn)為促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。它可以通過(guò)誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），使上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力；還能促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，支持腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；此外，TGF-β還具有免疫抑制作用，能夠抑制T、B淋巴細(xì)胞的增殖和分化，削弱機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散創(chuàng)造有利條件。三、HPV對(duì)宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響3.1HPV感染促進(jìn)宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)證據(jù)眾多研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型為HPV感染促進(jìn)宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，宋穎輝等人通過(guò)體外培養(yǎng)HPV16陽(yáng)性的鱗癌SiHa細(xì)胞系和HPV18陽(yáng)性的腺癌HeLa細(xì)胞系開(kāi)展研究。針對(duì)HPV16和HPV18的E6、E7基因，分別設(shè)計(jì)并構(gòu)建了相應(yīng)的MiRNA干擾載體，采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞系中。Real-TimePCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在SiHa細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染針對(duì)HPV16E6的質(zhì)粒16E6-MiR后，HPV16E6基因表達(dá)顯著下降，有效抑制率達(dá)77％(P=0)；轉(zhuǎn)染針對(duì)HPV16E7的質(zhì)粒16E7-MiR-2和16E7-MiR-4后，HPV16E7基因表達(dá)也明顯受到抑制，有效抑制率分別達(dá)到66％（P=0）和51％(P=0.003)。在HeLa細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染針對(duì)HPV18E6的質(zhì)粒18E6-MiR后，HPV18E6基因表達(dá)下降約87％(P=0)；轉(zhuǎn)染針對(duì)HPV18E7的質(zhì)粒18E7-MiR-1和18E7-MiR-4后，HPV18E7基因表達(dá)分別下降約68％(P=0)和55％(P=0)。當(dāng)HPV16E6、E7基因在SiHa細(xì)胞系中表達(dá)被抑制后，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志物E-鈣粘蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，而N-鈣粘蛋白和β-連環(huán)素則明顯下降(P＜0.05)；同樣，在HeLa細(xì)胞系中，當(dāng)HPV18E6、E7基因表達(dá)被明顯抑制后，E-鈣粘蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，N-鈣粘蛋白和β-連環(huán)素表達(dá)下降(P＜0.05)。這表明HPV病毒的E6、E7基因可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，當(dāng)這些基因被抑制后，細(xì)胞則發(fā)生間質(zhì)向上皮細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)過(guò)程。除上述實(shí)驗(yàn)外，還有研究人員利用基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對(duì)宮頸癌細(xì)胞系中的HPV基因進(jìn)行敲除，進(jìn)一步驗(yàn)證HPV感染與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系。在對(duì)HPV16陽(yáng)性的宮頸癌細(xì)胞系進(jìn)行HPV16基因敲除后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)從原本具有間質(zhì)細(xì)胞特征的紡錘形逐漸向具有上皮細(xì)胞特征的多邊形轉(zhuǎn)變。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲除HPV16基因后的宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著下降。同時(shí)，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘蛋白的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣粘蛋白、波形蛋白的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。這一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了HPV感染能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，且HPV基因的存在對(duì)于維持宮頸癌細(xì)胞的間質(zhì)細(xì)胞特性至關(guān)重要。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，構(gòu)建荷瘤小鼠模型是常用的研究手段。研究人員將HPV陽(yáng)性的宮頸癌細(xì)胞接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，成功建立荷瘤小鼠模型。一段時(shí)間后，對(duì)荷瘤小鼠的腫瘤組織進(jìn)行檢測(cè)分析。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，腫瘤組織中E-鈣粘蛋白的表達(dá)明顯降低，而N-鈣粘蛋白、波形蛋白的表達(dá)顯著升高，表明腫瘤細(xì)胞發(fā)生了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。此外，通過(guò)對(duì)腫瘤組織進(jìn)行切片觀察，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)特征，如細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、極性喪失等。同時(shí)，利用熒光原位雜交（FISH）技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中的HPVDNA，發(fā)現(xiàn)HPVDNA在腫瘤細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化存在關(guān)聯(lián)。這些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果在體內(nèi)水平驗(yàn)證了HPV感染能夠促進(jìn)宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，為進(jìn)一步研究其分子機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.2HPV感染引起EMT的分子機(jī)制HPV感染引發(fā)宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的分子機(jī)制較為復(fù)雜，其中下調(diào)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）和上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）是兩個(gè)關(guān)鍵的分子事件。EGFR作為一種細(xì)胞膜受體酪氨酸激酶，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和存活等過(guò)程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。其信號(hào)通路的正常激活對(duì)于維持細(xì)胞的正常生理功能至關(guān)重要。在正常生理狀態(tài)下，配體如表皮生長(zhǎng)因子（EGF）與EGFR結(jié)合，使EGFR發(fā)生二聚化和自身磷酸化，激活下游的一系列信號(hào)分子，如Ras-Raf-MEK-ERK通路、PI3K-AKT通路等。這些信號(hào)通路進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，推動(dòng)細(xì)胞增殖；同時(shí)，它們還參與調(diào)控細(xì)胞的存活和凋亡，抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)。然而，當(dāng)宮頸細(xì)胞受到HPV感染后，HPV病毒的某些蛋白產(chǎn)物會(huì)干擾EGFR的正常表達(dá)和功能。研究表明，HPVE6和E7蛋白可以通過(guò)多種途徑下調(diào)EGFR的表達(dá)。E6蛋白能夠與細(xì)胞內(nèi)的一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，抑制EGFR基因的轉(zhuǎn)錄，從而減少EGFR的mRNA水平；E7蛋白則可能通過(guò)影響蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程或加速EGFR蛋白的降解，降低細(xì)胞表面EGFR的蛋白含量。EGFR表達(dá)下調(diào)后，其下游的信號(hào)通路受到抑制。以Ras-Raf-MEK-ERK通路為例，由于EGFR無(wú)法正常激活，Ras蛋白不能被有效招募到細(xì)胞膜上，Raf激酶的活性也無(wú)法被激活，進(jìn)而導(dǎo)致MEK和ERK的磷酸化水平降低。這使得細(xì)胞周期調(diào)控出現(xiàn)異常，細(xì)胞周期蛋白D1等的表達(dá)減少，細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞周期被阻滯在G1期或G2/M期。同時(shí)，細(xì)胞的凋亡信號(hào)通路相對(duì)增強(qiáng)，細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡。這種細(xì)胞周期的異常和凋亡的增加，使得宮頸細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖平衡被打破，為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化創(chuàng)造了條件。TGF-β1是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族的重要成員，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成等過(guò)程中發(fā)揮著廣泛的調(diào)節(jié)作用。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，TGF-β1具有雙重作用。在腫瘤早期，它可以作為腫瘤抑制因子，通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制血管生成等機(jī)制，阻止腫瘤的發(fā)生。然而，在腫瘤進(jìn)展期，TGF-β1卻能促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，其中誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是其重要的促癌機(jī)制之一。HPV感染能夠上調(diào)TGF-β1的表達(dá)。一方面，HPV的E6和E7蛋白可以激活細(xì)胞內(nèi)的一些轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB等。這些轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到TGF-β1基因的啟動(dòng)子區(qū)域，增強(qiáng)TGF-β1基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而使TGF-β1的mRNA水平升高。另一方面，HPV感染可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路紊亂，引起一些細(xì)胞因子的釋放，這些細(xì)胞因子又可以間接誘導(dǎo)TGF-β1的表達(dá)。例如，HPV感染可能促使腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-6（IL-6）等細(xì)胞因子，IL-6可以作用于宮頸癌細(xì)胞，通過(guò)JAK-STAT信號(hào)通路誘導(dǎo)TGF-β1的表達(dá)。上調(diào)的TGF-β1通過(guò)經(jīng)典的TGF-β/Smads信號(hào)通路和非經(jīng)典的信號(hào)通路誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。在經(jīng)典通路中，TGF-β1與細(xì)胞膜上的TGF-βRⅡ和TGF-βRⅠ結(jié)合形成復(fù)合物，TGF-βRⅡ磷酸化TGF-βRⅠ的GS結(jié)構(gòu)域，激活TGF-βRⅠ。激活的TGF-βRⅠ進(jìn)而磷酸化Smad2和Smad3，磷酸化的Smad2/3與Smad4形成復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞核與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達(dá)。例如，上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣粘蛋白、波形蛋白等的表達(dá)，下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘蛋白的表達(dá)。在非經(jīng)典通路中，TGF-β1可以激活MAPK家族的成員，如p38MAPK、JNK等。以p38MAPK為例，TGF-β1刺激使p38MAPK發(fā)生磷酸化而激活，激活的p38MAPK可以磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，如ATF2等。這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核后，與EMT相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，從而誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。此外，TGF-β1還可以通過(guò)激活PI3K-AKT等信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、遷移和侵襲能力，進(jìn)一步促進(jìn)EMT的進(jìn)程。3.3實(shí)例分析：以HPV16和HPV18為例HPV16和HPV18作為高危型HPV的典型代表，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著極為關(guān)鍵的角色，二者引發(fā)宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過(guò)程和結(jié)果具有重要的研究?jī)r(jià)值。在實(shí)驗(yàn)中，選取HPV16陽(yáng)性的鱗癌SiHa細(xì)胞系和HPV18陽(yáng)性的腺癌HeLa細(xì)胞系作為研究對(duì)象。對(duì)SiHa細(xì)胞系進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作，當(dāng)采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法將針對(duì)HPV16E6的質(zhì)粒16E6-MiR轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中后，通過(guò)Real-TimePCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HPV16E6基因表達(dá)顯著下降，有效抑制率高達(dá)77％(P=0)。同時(shí)，轉(zhuǎn)染針對(duì)HPV16E7的質(zhì)粒16E7-MiR-2和16E7-MiR-4后，HPV16E7基因表達(dá)也明顯受到抑制，有效抑制率分別達(dá)到66％（P=0）和51％(P=0.003)。在HeLa細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染針對(duì)HPV18E6的質(zhì)粒18E6-MiR后，HPV18E6基因表達(dá)下降約87％(P=0)；轉(zhuǎn)染針對(duì)HPV18E7的質(zhì)粒18E7-MiR-1和18E7-MiR-4后，HPV18E7基因表達(dá)分別下降約68％(P=0)和55％(P=0)。隨著HPV16E6、E7基因在SiHa細(xì)胞系中的表達(dá)被有效抑制，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志物發(fā)生顯著變化。上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣粘蛋白和β-連環(huán)素則明顯下降(P＜0.05)。同樣，在HeLa細(xì)胞系中，當(dāng)HPV18E6、E7基因表達(dá)被明顯抑制后，E-鈣粘蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，N-鈣粘蛋白和β-連環(huán)素表達(dá)下降(P＜0.05)。這一系列結(jié)果清晰地表明，HPV16和HPV18的E6、E7基因?qū)m頸癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化具有促進(jìn)作用，當(dāng)這些基因的表達(dá)被抑制時(shí)，細(xì)胞則呈現(xiàn)出間質(zhì)向上皮細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)過(guò)程。進(jìn)一步探究HPV16和HPV18感染導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路密切相關(guān)。在SiHa細(xì)胞系中，當(dāng)HPV16E6、E7基因表達(dá)明顯被抑制后，通過(guò)Real-TimePCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子TGF-β1、TβRⅡ和Smad4基因的表達(dá)水平均明顯下降(P＜0.05)。在HeLa細(xì)胞系中也觀察到類(lèi)似現(xiàn)象，當(dāng)HPV18E6、E7基因表達(dá)明顯被抑制后，TGF-β1、TβRⅡ和Smad4基因的表達(dá)均下降(P＜0.05)。這說(shuō)明HPV16和HPV18的E6、E7基因可能通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，來(lái)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。具體而言，HPV16和HPV18的E6、E7蛋白可能激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，從而上調(diào)TGF-β1的表達(dá)。TGF-β1與其受體TβRⅡ結(jié)合后，激活下游的Smad4等信號(hào)分子，進(jìn)而調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的表達(dá)，促使宮頸癌細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，增強(qiáng)其遷移和侵襲能力。四、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路在宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用機(jī)制4.1TGF-β信號(hào)通路的激活與傳導(dǎo)在宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中，TGF-β信號(hào)通路的激活與傳導(dǎo)是一個(gè)關(guān)鍵且復(fù)雜的分子事件，涉及一系列精細(xì)的步驟和分子間的相互作用。TGF-β1作為T(mén)GF-β超家族的重要成員，在生理和病理?xiàng)l件下發(fā)揮著廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。在細(xì)胞外環(huán)境中，TGF-β1通常以無(wú)活性的前體形式存在，與潛在相關(guān)肽（LAP）和潛在TGF-β結(jié)合蛋白（LTBP）形成復(fù)合物。當(dāng)受到特定刺激時(shí)，如細(xì)胞外基質(zhì)的改變、炎癥因子的釋放或細(xì)胞表面受體的激活等，TGF-β1從復(fù)合物中釋放出來(lái)，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩锘钚缘某墒煨问?。一旦被激活，TGF-β1便迅速與細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合，啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。TGF-β受體主要包括TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ，二者均為跨膜蛋白，包含胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。TGF-βRⅡ具有組成型激酶活性，在與TGF-β1結(jié)合前，其胞內(nèi)區(qū)的絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域處于自我磷酸化的激活狀態(tài)。當(dāng)TGF-β1與TGF-βRⅡ結(jié)合后，TGF-βRⅡ發(fā)生構(gòu)象變化，進(jìn)而招募TGF-βRⅠ，形成穩(wěn)定的TGF-β1-TGF-βRⅡ-TGF-βRⅠ復(fù)合物。在這個(gè)復(fù)合物中，TGF-βRⅡ利用其激酶活性，對(duì)TGF-βRⅠ胞內(nèi)區(qū)的一段富含甘氨酸和絲氨酸的區(qū)域（GS結(jié)構(gòu)域）進(jìn)行磷酸化修飾。GS結(jié)構(gòu)域的磷酸化是TGF-βRⅠ激活的關(guān)鍵步驟，它使得TGF-βRⅠ的激酶活性被激活，從而能夠進(jìn)一步磷酸化下游的信號(hào)分子。Smad蛋白家族是TGF-β信號(hào)通路的關(guān)鍵胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分子，根據(jù)其功能可分為受體調(diào)控的Smad（R-Smad）、通用Smad（Co-Smad）和抑制型Smad（I-Smad）。其中，Smad2和Smad3屬于R-Smad，它們?cè)赥GF-β信號(hào)傳導(dǎo)中起著核心作用。在未被激活時(shí)，Smad2和Smad3主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，并與一種名為SARA（Smad-anchorforreceptoractivation）的錨定蛋白結(jié)合。當(dāng)TGF-βRⅠ被激活并磷酸化后，它能夠與SARA-Smad2/3復(fù)合物相互作用，將Smad2和Smad3招募到受體復(fù)合物附近。隨后，TGF-βRⅠ直接磷酸化Smad2和Smad3的C末端的絲氨酸殘基，使其發(fā)生激活。磷酸化后的Smad2和Smad3從SARA上解離下來(lái)，并與Co-Smad（即Smad4）結(jié)合，形成異源三聚體復(fù)合物。這個(gè)復(fù)合物具有入核信號(hào)，能夠在多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的協(xié)助下，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核中，Smad復(fù)合物與特定的DNA序列（Smad結(jié)合元件，SBE）相互作用，招募其他轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔助因子，如p300、CBP等，共同調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。這些靶基因包括多種與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)的基因，如Snail、Slug、Twist等轉(zhuǎn)錄因子基因，以及N-鈣粘蛋白、波形蛋白等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物基因，同時(shí)抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘蛋白等基因的表達(dá)。通過(guò)這種方式，TGF-β1信號(hào)最終導(dǎo)致上皮細(xì)胞逐漸失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，實(shí)現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。4.2TGF-β信號(hào)通路對(duì)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化生物學(xué)效應(yīng)的調(diào)控機(jī)制TGF-β信號(hào)通路對(duì)宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化生物學(xué)效應(yīng)的調(diào)控機(jī)制是多方面且精細(xì)復(fù)雜的，其中直接促進(jìn)干細(xì)胞在與腫瘤微環(huán)境相互作用下對(duì)生長(zhǎng)因子和細(xì)胞基質(zhì)材料的SMAZL-1基因表達(dá)，為腫瘤進(jìn)行EMT提供條件，是其重要的調(diào)控方式之一。在腫瘤微環(huán)境中，存在著多種細(xì)胞成分和細(xì)胞外基質(zhì)，以及各類(lèi)生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子。干細(xì)胞作為具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞群體，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色。TGF-β信號(hào)通路能夠直接作用于干細(xì)胞，影響其基因表達(dá)譜，進(jìn)而調(diào)控干細(xì)胞的生物學(xué)行為。當(dāng)TGF-β與其受體結(jié)合并激活信號(hào)通路后，通過(guò)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，能夠上調(diào)干細(xì)胞中SMAZL-1基因的表達(dá)。SMAZL-1基因編碼的蛋白在細(xì)胞骨架重塑、細(xì)胞遷移和侵襲等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其表達(dá)的增加使得干細(xì)胞能夠更好地適應(yīng)腫瘤微環(huán)境中的各種信號(hào)刺激，增強(qiáng)自身的遷移和侵襲能力。TGF-β信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)干細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)材料的相互作用，為腫瘤進(jìn)行EMT創(chuàng)造條件。細(xì)胞基質(zhì)材料主要由膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等組成，它們構(gòu)成了細(xì)胞生存的微環(huán)境支架。TGF-β激活的信號(hào)通路能夠促使干細(xì)胞分泌更多的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）。MMPs是一類(lèi)鋅離子依賴的內(nèi)肽酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種成分。以MMP-2和MMP-9為例，它們可以特異性地降解膠原蛋白和纖連蛋白。當(dāng)這些細(xì)胞外基質(zhì)成分被降解后，干細(xì)胞周?chē)奈h(huán)境結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，原本限制細(xì)胞遷移的物理屏障被破壞，使得干細(xì)胞更容易脫離原位，向周?chē)M織遷移。同時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)的降解產(chǎn)物還可以作為信號(hào)分子，進(jìn)一步激活干細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促進(jìn)其向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。TGF-β信號(hào)通路還可以通過(guò)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子的表達(dá)和活性，間接影響干細(xì)胞的行為，為腫瘤EMT提供支持。在腫瘤微環(huán)境中，存在著多種生長(zhǎng)因子，如表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）等。TGF-β信號(hào)通路可以與這些生長(zhǎng)因子信號(hào)通路相互作用。TGF-β可以上調(diào)干細(xì)胞表面EGF受體的表達(dá)，使得干細(xì)胞對(duì)EGF的敏感性增加。當(dāng)EGF與其受體結(jié)合后，激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路。該信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)干細(xì)胞的增殖和遷移，同時(shí)也能夠調(diào)節(jié)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。ERK可以磷酸化并激活轉(zhuǎn)錄因子Elk-1，Elk-1進(jìn)入細(xì)胞核后，與EMT相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，從而推動(dòng)干細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤的EMT進(jìn)程。此外，TGF-β還可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子和信號(hào)通路，如Wnt/β-catenin信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路等，協(xié)同促進(jìn)干細(xì)胞的EMT過(guò)程。這些信號(hào)通路之間相互交織，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同決定了腫瘤細(xì)胞在EMT過(guò)程中的命運(yùn)。4.3其他轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子在宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用除了TGF-β1外，其他轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子在宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中也發(fā)揮著重要作用。胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF1）便是其中之一。IGF1是一種多功能蛋白質(zhì)，在調(diào)節(jié)組織細(xì)胞增殖、分化、有絲分裂等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，IGF1在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，尤其在誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化方面具有顯著作用。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)用IGF1處理宮頸癌細(xì)胞系時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)和生物學(xué)行為發(fā)生了明顯改變。細(xì)胞逐漸失去上皮細(xì)胞的典型形態(tài)，如細(xì)胞間連接減弱，極性喪失，細(xì)胞形態(tài)從立方狀或柱狀轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N形或梭形，呈現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞的特征。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘蛋白的表達(dá)顯著降低，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣粘蛋白、波形蛋白的表達(dá)明顯升高。這表明IGF1能夠誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。IGF1誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制較為復(fù)雜。首先，IGF1與其受體IGF1R結(jié)合后，激活下游的PI3K-AKT信號(hào)通路。PI3K被激活后，催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3招募并激活A(yù)KT，激活的AKT可以磷酸化多種下游底物。AKT可以磷酸化GSK-3β，使其活性受到抑制。GSK-3β是一種蛋白激酶，正常情況下能夠磷酸化β-連環(huán)素，促進(jìn)其降解。當(dāng)GSK-3β活性被抑制后，β-連環(huán)素在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核中，β-連環(huán)素與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，啟動(dòng)一系列EMT相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如上調(diào)N-鈣粘蛋白、波形蛋白等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，下調(diào)E-鈣粘蛋白等上皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，從而誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。IGF1還可以通過(guò)激活Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。IGF1與IGF1R結(jié)合后，使受體發(fā)生二聚化和自身磷酸化，招募生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2（Grb2）和鳥(niǎo)苷酸交換因子SOS。SOS催化Ras蛋白上的GDP與GTP交換，使Ras蛋白激活。激活的Ras蛋白進(jìn)一步激活Raf激酶，Raf激酶磷酸化并激活MEK，MEK再磷酸化并激活ERK。激活的ERK進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化并激活一系列轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、AP-1等。這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到EMT相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，推動(dòng)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。此外，IGF1誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化還可能依賴于Smad信號(hào)通路的招募和核轉(zhuǎn)移。IGF1刺激可能會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的Smad蛋白被招募并磷酸化，磷酸化的Smad蛋白形成復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達(dá)。同時(shí)，IGF1還可能通過(guò)增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的活性，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件，進(jìn)一步促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。五、HPV與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路的交互作用對(duì)宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響5.1HPV如何調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路相關(guān)分子HPV感染對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路相關(guān)分子的調(diào)控作用是其影響宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中HPV感染上調(diào)TGF-β1表達(dá)是一個(gè)重要的分子事件。在宮頸癌細(xì)胞中，HPV病毒的E6和E7蛋白在調(diào)控TGF-β1表達(dá)方面發(fā)揮著核心作用。研究表明，HPVE6和E7蛋白可以通過(guò)多種途徑激活細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而上調(diào)TGF-β1的表達(dá)。具體而言，E6蛋白能夠與細(xì)胞內(nèi)的一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，形成復(fù)合物，該復(fù)合物可以結(jié)合到TGF-β1基因的啟動(dòng)子區(qū)域，增強(qiáng)TGF-β1基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而使TGF-β1的mRNA水平升高。例如，E6蛋白可以與AP-1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，AP-1是一種由c-Jun和c-Fos組成的異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，它能夠識(shí)別并結(jié)合到TGF-β1基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列上，促進(jìn)TGF-β1基因的轉(zhuǎn)錄。E7蛋白則可以通過(guò)與一些細(xì)胞周期調(diào)控蛋白相互作用，間接影響轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而上調(diào)TGF-β1的表達(dá)。E7蛋白與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑制蛋白pRB結(jié)合，使pRB失去對(duì)轉(zhuǎn)錄因子E2F的抑制作用，E2F被釋放后可以激活一系列與細(xì)胞周期和增殖相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，同時(shí)也可能上調(diào)TGF-β1的表達(dá)。HPV感染還可能通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路來(lái)間接調(diào)控TGF-β1的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，HPV感染可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的NF-κB信號(hào)通路激活。HPVE6和E7蛋白能夠通過(guò)多種方式激活NF-κB信號(hào)通路。E6蛋白可以與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）結(jié)合，促進(jìn)TRAF6的泛素化修飾，進(jìn)而激活下游的IKK激酶復(fù)合物。IKK激酶復(fù)合物磷酸化IκB蛋白，使其降解，從而釋放出NF-κB，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后，與TGF-β1基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，增強(qiáng)TGF-β1基因的轉(zhuǎn)錄。激活的NF-κB信號(hào)通路可以誘導(dǎo)一系列細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，其中包括TGF-β1。這些細(xì)胞因子和趨化因子可以進(jìn)一步調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外，HPV感染還可能通過(guò)激活PI3K-AKT等信號(hào)通路來(lái)間接調(diào)控TGF-β1的表達(dá)。PI3K-AKT信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖，同時(shí)也可能影響轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而上調(diào)TGF-β1的表達(dá)。除了TGF-β1，HPV感染還會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路中的其他關(guān)鍵分子產(chǎn)生影響。以TGF-β受體（TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ）為例，研究發(fā)現(xiàn)HPV感染可能上調(diào)TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ的表達(dá)。在HPV陽(yáng)性的宮頸癌細(xì)胞系中，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和免疫熒光染色等實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ的蛋白表達(dá)水平明顯高于HPV陰性的細(xì)胞系。進(jìn)一步研究表明，HPVE6和E7蛋白可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，促進(jìn)TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加其蛋白表達(dá)。這種上調(diào)作用使得TGF-β1與受體的結(jié)合更加有效，進(jìn)而增強(qiáng)了TGF-β信號(hào)通路的傳導(dǎo)。對(duì)于Smad蛋白家族，HPV感染也會(huì)影響其表達(dá)和活性。在HPV感染的宮頸癌細(xì)胞中，Smad2和Smad3的磷酸化水平可能發(fā)生改變。研究表明，HPVE6和E7蛋白可能通過(guò)干擾細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，影響Smad2和Smad3的磷酸化過(guò)程。E6蛋白可能與一些參與Smad2和Smad3磷酸化的激酶或磷酸酶相互作用，改變它們的活性，從而影響Smad2和Smad3的磷酸化水平。當(dāng)Smad2和Smad3的磷酸化水平發(fā)生改變時(shí)，它們與Smad4形成復(fù)合物并進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄的能力也會(huì)受到影響，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路對(duì)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的調(diào)控。5.2轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路在HPV介導(dǎo)的宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵作用驗(yàn)證為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路在HPV介導(dǎo)的宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵作用，本研究設(shè)計(jì)并實(shí)施了一系列實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)選取HPV16陽(yáng)性的鱗癌SiHa細(xì)胞系和HPV18陽(yáng)性的腺癌HeLa細(xì)胞系作為研究對(duì)象，這兩種細(xì)胞系在宮頸癌研究中具有廣泛的應(yīng)用，能夠較好地模擬HPV感染的宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。首先，采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法，將針對(duì)HPV16E7的MiRNA干擾載體16E7-MiR-1、16E7-MiR-2、16E7-MiR-3和16E7-MiR-4轉(zhuǎn)染到SiHa細(xì)胞系中，同時(shí)將針對(duì)HPV18E7的MiRNA干擾載體18E7-MiR-1、18E7-MiR-2、18E7-MiR-3和18E7-MiR-4轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞系中。通過(guò)Real-TimePCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后E7基因的表達(dá)差異，篩選出沉默效率較高的質(zhì)粒。在SiHa細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒16E7-MiR-2和16E7-MiR-4后，HPV16E7基因的表達(dá)得到有效抑制，Real-TimePCR結(jié)果顯示有效抑制率分別達(dá)到66％（P=0）和51％(P=0.003)，而質(zhì)粒16E7-MiR-1和16E7-MiR-3則無(wú)明顯抑制效果。在HeLa細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒18E7-MiR-1和18E7-MiR-4后，HPV18E7基因的表達(dá)明顯下降，分別下降約68％(P=0)和55％(P=0)，而18E7-MiR-2和18E7-MiR-3則無(wú)明顯抑制效果。將前期課題組使用的針對(duì)HPV16E6和HPV18E6的stealthRNA轉(zhuǎn)換成MiRNA，并構(gòu)建到pcDNA6.2rM.GW/EmGFP.miR載體中，構(gòu)建成分別針對(duì)HPV16E6和HPV18E6的質(zhì)粒16E6-MiR、18E6-MiR。在SiHa細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒16E6-MiR后，HPV16E6基因的表達(dá)明顯下降，Real-TimePCR結(jié)果顯示有效抑制率為77％(P=0)；在HeLa細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染18E6-MiR質(zhì)粒后，HPV18E6基因的表達(dá)明顯下降，與未轉(zhuǎn)染Hela組相比下降約87％(P=0)。利用篩選出的沉默效率較高的質(zhì)粒，構(gòu)建分別沉默HPV16和HPV18病毒E6、E7基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。以質(zhì)粒16E6-MiR和沉默效率較高的質(zhì)粒16E7-MiR-2構(gòu)建SiHa穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，以質(zhì)粒18E6-MiR和沉默效率較高的質(zhì)粒18E7-MiR-1構(gòu)建HeLa穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。通過(guò)Real-TimePCR方法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后EMT的標(biāo)志物E-鈣粘蛋白（E-cadherin）、N-鈣粘蛋白（N-cadherin）和β-連環(huán)素（β-catenin）的表達(dá)差異。在SiHa組中，當(dāng)HPV16E6、E7基因表達(dá)被抑制后，EMT的標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，而N-cadherin和β-catenin則明顯下降(P＜0.05)。在HeLa組中，當(dāng)HPV18E6、E7基因表達(dá)被明顯抑制后，E-cadherin表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，N-cadherin和β-catenin表達(dá)下降(P＜0.05)。這表明沉默HPV16和HPV18的E6、E7基因后，宮頸癌細(xì)胞發(fā)生了間質(zhì)向上皮細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)過(guò)程，說(shuō)明HPV病毒的E6、E7基因可促進(jìn)上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。為了進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路在這一過(guò)程中的作用，采用Real-timePCR方法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后TGF-β1、TGF-βRⅡ（TβRⅡ）和Smad4基因水平的變化。在SiHa組中，當(dāng)HPV16E6、E7基因表達(dá)明顯被抑制后，TGF-β1、TβRⅡ和Smad4基因的表達(dá)水平均明顯下降(P＜0.05)。在HeLa組中，當(dāng)HPV18E6、E7基因表達(dá)明顯被抑制后，TGF-β1、TβRⅡ和Smad4基因的表達(dá)均下降(P＜0.05)。這說(shuō)明HPV16和HPV18的E6、E7基因可能通過(guò)調(diào)控TGF-β/Smads信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，來(lái)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。為了更直觀地觀察干擾轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，進(jìn)行了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，用移液器槍頭在培養(yǎng)板上均勻地劃出劃痕，模擬細(xì)胞遷移的起始狀態(tài)。然后分別在劃痕后0小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)進(jìn)行拍照，測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。結(jié)果顯示，在正常的HPV陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞中，細(xì)胞遷移率較高，隨著時(shí)間推移，劃痕寬度明顯減小。而當(dāng)干擾轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路后，細(xì)胞遷移率顯著降低，劃痕寬度在24小時(shí)和48小時(shí)的減小幅度明顯小于對(duì)照組。在Transwell小室實(shí)驗(yàn)中，在上室接種細(xì)胞，下室加入含有血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。培養(yǎng)一定時(shí)間后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，對(duì)下室遷移到膜表面的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色和計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，正常的HPV陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室膜的細(xì)胞數(shù)量較多，而干擾轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路后，穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，干擾轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路能夠顯著抑制HPV感染的宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，從而驗(yàn)證了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路在HPV介導(dǎo)的宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵作用。5.3交互作用的分子機(jī)制模型構(gòu)建基于上述研究結(jié)果，構(gòu)建HPV與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路交互作用導(dǎo)致宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制模型（圖1）。在正常宮頸上皮細(xì)胞中，HPV未感染，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路處于相對(duì)穩(wěn)定的基礎(chǔ)狀態(tài)。TGF-β1以無(wú)活性的前體形式存在于細(xì)胞外，TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ在細(xì)胞膜表面表達(dá)，Smad蛋白在細(xì)胞質(zhì)中處于非磷酸化狀態(tài)。此時(shí)，上皮細(xì)胞維持正常的極性和細(xì)胞間連接，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘蛋白高表達(dá)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣粘蛋白、波形蛋白等低表達(dá)。當(dāng)宮頸上皮細(xì)胞受到高危型HPV感染后，HPV病毒的E6和E7蛋白發(fā)揮關(guān)鍵作用。E6蛋白通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，以及與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）等相互作用，激活NF-κB信號(hào)通路，上調(diào)TGF-β1基因的轉(zhuǎn)錄，使TGF-β1表達(dá)增加。E7蛋白則通過(guò)與pRB結(jié)合，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，間接影響相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，也可能上調(diào)TGF-β1的表達(dá)。同時(shí)，E6和E7蛋白還可能調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，促進(jìn)TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ基因的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞膜表面的TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ表達(dá)升高。隨著TGF-β1表達(dá)上調(diào)，其與細(xì)胞膜表面的TGF-βRⅡ和TGF-βRⅠ結(jié)合形成復(fù)合物。TGF-βRⅡ磷酸化TGF-βRⅠ的GS結(jié)構(gòu)域，激活TGF-βRⅠ。激活的TGF-βRⅠ磷酸化Smad2和Smad3，磷酸化后的Smad2和Smad3與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核中，該復(fù)合物與其他轉(zhuǎn)錄因子共同作用，調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達(dá)。上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣粘蛋白、波形蛋白等的表達(dá)，下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘蛋白的表達(dá)。同時(shí)，可能激活其他相關(guān)信號(hào)通路，如PI3K-AKT、MAPK等信號(hào)通路。PI3K-AKT信號(hào)通路被激活后，通過(guò)磷酸化GSK-3β等下游分子，使β-連環(huán)素在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，進(jìn)一步促進(jìn)EMT相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。MAPK家族成員如p38MAPK、JNK等被激活后，磷酸化下游轉(zhuǎn)錄因子，如ATF2、Elk-1等，這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核，與EMT相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。在這些信號(hào)通路的協(xié)同作用下，宮頸上皮細(xì)胞逐漸失去上皮細(xì)胞的特性，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。細(xì)胞間連接減弱，極性喪失，細(xì)胞形態(tài)從立方狀或柱狀轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N形或梭形，遷移和侵襲能力增強(qiáng)。這一系列變化使得宮頸癌細(xì)胞更容易突破基底膜，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。[此處插入構(gòu)建的分子機(jī)制模型圖1，圖中應(yīng)清晰展示HPV感染、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路激活以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子的相互作用關(guān)系，如HPVE6、E7蛋白與TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad蛋白、EMT相關(guān)標(biāo)志物等之間的聯(lián)系，以及相關(guān)信號(hào)通路的激活過(guò)程和關(guān)鍵分子的變化情況]六、研究結(jié)論與展望6.1研究主要成果總結(jié)本研究圍繞HPV通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路致宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化這一核心問(wèn)題展開(kāi)，通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)研究和理論分析，取得了以下主要成果：HPV感染促進(jìn)宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化：通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型，有力地證實(shí)了HPV感染能夠促進(jìn)宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)HPV16和HPV18的E6、E7基因設(shè)計(jì)并構(gòu)建MiRNA干擾載體，轉(zhuǎn)染到SiHa和HeLa細(xì)胞系后，發(fā)現(xiàn)當(dāng)HPV16E6、E7基因在SiHa細(xì)胞系中表達(dá)被抑制，以及HPV18E6、E7基因在HeLa細(xì)胞系中表達(dá)被抑制時(shí)，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志物E-鈣粘蛋白表達(dá)明顯升高，而N-鈣粘蛋白和β-連環(huán)素則明顯下降，表明細(xì)胞發(fā)生了間質(zhì)向上皮細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)過(guò)程。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建荷瘤小鼠模型，對(duì)腫瘤組織的檢測(cè)分析顯示，腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)特征，且上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)發(fā)生相應(yīng)改變。HPV感染引起EMT的分子機(jī)制：深入探究了HPV感染引發(fā)宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)下調(diào)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）和上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。HPV的E6和E7蛋白通過(guò)多種途徑下調(diào)EGFR表達(dá)，使EGFR下游信號(hào)通路受阻，細(xì)胞周期調(diào)控異常，為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化創(chuàng)造條件。同時(shí)，E6和E7蛋白通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子、改變細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路等方式上調(diào)TGF-β1表達(dá)。上調(diào)的TGF-β1通過(guò)經(jīng)典的TGF-β/Smads信號(hào)通路和非經(jīng)典的信號(hào)通路，如激活MAPK家族成員、PI3K-AKT等信號(hào)通路，誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路在宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用機(jī)制：詳細(xì)解析了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路在宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用機(jī)制。TGF-β1信號(hào)通路的激活起始于TGF-β1與受體TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ結(jié)合，形成復(fù)合物后激活TGF-βRⅠ，進(jìn)而磷酸化Smad2和Smad3。磷酸化的Smad2/3與Smad4形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性。此外，TGF-β信號(hào)通路還通過(guò)直接促進(jìn)干細(xì)胞在與腫瘤微環(huán)境相互作用下對(duì)生長(zhǎng)因子和細(xì)胞基質(zhì)材料的SMAZL-1基因表達(dá)，以及調(diào)節(jié)干細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)材料的相互作用、生長(zhǎng)因子的表達(dá)和活性等，為腫瘤進(jìn)行EMT提供條件。除TGF-β1外，胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF1）等其他轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子也在宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。IGF1通過(guò)激活PI3K-AKT、Ras-Raf-MEK-ERK等信號(hào)通路，以及依賴于Smad信號(hào)通路的招募和核轉(zhuǎn)移等機(jī)制，誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。HPV與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路的交互作用對(duì)宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響：明確了HPV對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路相關(guān)分子的調(diào)控作用。HPV的E6和E7蛋白通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子、改變細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路等方式上調(diào)TGF-β1表達(dá)，同時(shí)可能上調(diào)TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ的表達(dá)，影響Smad蛋白家族的表達(dá)和活性。通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路在HPV介導(dǎo)的宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵作用。干擾HPV16和HPV18的E6、E7基因表達(dá)后，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子TGF-β1、TβRⅡ和Smad4基因的表達(dá)水平均明顯下降，且細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著降低?；谘芯拷Y(jié)果構(gòu)建了HPV與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路交互作用導(dǎo)致宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制模型，清晰展示了HPV感染、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路激活以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子的相互作用關(guān)系。6.2研究的創(chuàng)新點(diǎn)與局限性本研究在HPV通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路致宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究中具有一定的創(chuàng)新點(diǎn)。在研究?jī)?nèi)容上，深入探討了HPV與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路之間的交互作用，明確了HPV如何調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路相關(guān)分子，以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路在HPV介導(dǎo)的宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵作用，為揭示宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供了新的視角。在研究方法上，采用了多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如構(gòu)建MiRNA干擾載體、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系等，通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和多維度的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，為研究結(jié)果提供了可靠的證據(jù)。構(gòu)建針對(duì)HPV16和HPV18的E6、E7基因的MiRNA干擾載體，轉(zhuǎn)染到宮頸癌細(xì)胞系中