CAR修飾NK-92細(xì)胞靶向erbB2陽(yáng)性乳腺癌的免疫治療新策略一、引言1.1研究背景乳腺癌是全球女性健康的重大威脅，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命健康。根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的數(shù)據(jù)，乳腺癌已成為全球女性發(fā)病率最高的癌癥，2020年新發(fā)病例高達(dá)226萬(wàn)例，超越肺癌成為全球第一大癌。在我國(guó)，乳腺癌同樣是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡逐漸年輕化，對(duì)女性群體的健康構(gòu)成了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。盡管乳腺癌的治療手段不斷發(fā)展，包括手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療和靶向治療等，顯著提高了患者的生存率和生活質(zhì)量，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)。我國(guó)乳腺癌新發(fā)病例持續(xù)增加，且患者5年生存率存在明顯地域差異，中西部地區(qū)低于東部沿海地區(qū)，農(nóng)村低于城市。由于乳腺癌篩查普及率和患者疾病認(rèn)知度不足，早期診斷率較低，確診時(shí)中晚期患者相對(duì)較多，這部分患者的治療難度大，預(yù)后較差，5年生存率僅為20%。在乳腺癌的眾多亞型中，erbB2陽(yáng)性乳腺癌具有獨(dú)特的生物學(xué)行為和臨床特征。erbB2（又稱HER2）是一種原癌基因，其編碼的蛋白屬于人表皮生長(zhǎng)因子受體家族。約15%-20%的乳腺癌患者表現(xiàn)為erbB2陽(yáng)性，這類患者的腫瘤細(xì)胞增殖活躍、侵襲性強(qiáng)、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高，預(yù)后相對(duì)較差。不過(guò)，erbB2陽(yáng)性乳腺癌也為靶向治療提供了明確的靶點(diǎn)，抗erbB2靶向治療藥物如曲妥珠單抗、帕妥珠單抗等的應(yīng)用，顯著改善了患者的生存預(yù)后，但仍有部分患者對(duì)這些藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療失敗。自然殺傷（NK）細(xì)胞作為人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在腫瘤免疫監(jiān)視中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。NK細(xì)胞無(wú)需預(yù)先致敏，就能非特異性殺傷腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞，通過(guò)釋放穿孔素和顆粒酶、表達(dá)膜TNF家族分子誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡以及抗體依賴的細(xì)胞毒作用等多種途徑，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有效殺傷。然而，在腫瘤患者體內(nèi)，NK細(xì)胞的數(shù)量和功能往往受到抑制，無(wú)法充分發(fā)揮其抗腫瘤作用。NK-92細(xì)胞系是一種具有強(qiáng)大細(xì)胞毒性的永生化NK細(xì)胞系，于1992年從一名患有非霍奇金淋巴瘤的女性外周血中建立。NK-92細(xì)胞高表達(dá)一系列與細(xì)胞溶解相關(guān)的分子，表面表達(dá)部分活化性受體，如NKG2D，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)大的殺傷能力，尤其是對(duì)表達(dá)NKG2D配體的腫瘤細(xì)胞，如急性淋巴白血病細(xì)胞，極為敏感。與原代NK細(xì)胞相比，NK-92細(xì)胞的最大優(yōu)勢(shì)在于其表面抑制性受體表達(dá)很低，這使得其能夠避免抑制信號(hào)的干擾，對(duì)多種腫瘤的殺傷能力優(yōu)于原代NK細(xì)胞或經(jīng)細(xì)胞因子活化的其他殺傷細(xì)胞。此外，NK-92細(xì)胞具有易于擴(kuò)增和基因修飾的特點(diǎn)，使其成為腫瘤免疫治療的理想細(xì)胞來(lái)源。近年來(lái)，隨著基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，通過(guò)基因修飾增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷能力成為研究熱點(diǎn)。嵌合抗原受體（CAR）技術(shù)的出現(xiàn)，為NK細(xì)胞的基因修飾提供了有力工具。將CAR導(dǎo)入NK細(xì)胞，使其能夠特異性識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原，從而增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用，這種經(jīng)過(guò)基因修飾的NK細(xì)胞被稱為CAR-NK細(xì)胞。CAR-NK細(xì)胞不僅保留了NK細(xì)胞的天然抗腫瘤特性，還具備了靶向識(shí)別腫瘤細(xì)胞的能力，為腫瘤治療帶來(lái)了新的希望。因此，研究基因修飾的NK-92細(xì)胞對(duì)erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的特異性殺傷作用，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值，有望為erbB2陽(yáng)性乳腺癌的治療開(kāi)辟新的途徑。1.2研究目的與意義本研究旨在通過(guò)基因修飾技術(shù)，將編碼針對(duì)erbB2抗原的嵌合抗原受體（CAR）基因?qū)隢K-92細(xì)胞，構(gòu)建出能夠特異性識(shí)別并殺傷erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的CAR-NK-92細(xì)胞，并深入探究其對(duì)erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的殺傷機(jī)制及效果。具體而言，將從以下幾個(gè)方面展開(kāi)研究：首先，成功構(gòu)建并高效表達(dá)針對(duì)erbB2的CAR-NK-92細(xì)胞，確保其具備穩(wěn)定的生物學(xué)特性和功能；其次，在體外實(shí)驗(yàn)中，系統(tǒng)評(píng)估CAR-NK-92細(xì)胞對(duì)erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的特異性殺傷活性，以及細(xì)胞因子分泌、增殖能力等相關(guān)生物學(xué)功能；再者，利用動(dòng)物模型開(kāi)展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證CAR-NK-92細(xì)胞對(duì)erbB2陽(yáng)性乳腺癌的治療效果，觀察其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用、對(duì)動(dòng)物生存期的影響以及安全性評(píng)估；最后，深入研究CAR-NK-92細(xì)胞殺傷erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的分子機(jī)制，明確相關(guān)信號(hào)通路和關(guān)鍵分子的作用。乳腺癌作為嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤，盡管現(xiàn)有治療手段取得了一定進(jìn)展，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)。erbB2陽(yáng)性乳腺癌患者預(yù)后較差，部分患者對(duì)傳統(tǒng)抗erbB2靶向治療藥物耐藥，亟需探索新的治療方法。NK-92細(xì)胞作為一種具有強(qiáng)大細(xì)胞毒性的永生化NK細(xì)胞系，在基因修飾后有望成為erbB2陽(yáng)性乳腺癌治療的新策略。本研究對(duì)于深入理解基因修飾NK細(xì)胞治療乳腺癌的機(jī)制具有重要的理論意義，為乳腺癌免疫治療的發(fā)展提供了新的理論依據(jù)，有助于揭示NK細(xì)胞在腫瘤免疫中的作用機(jī)制以及CAR技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用原理，豐富腫瘤免疫治療的理論體系。同時(shí)，本研究也具有顯著的臨床應(yīng)用價(jià)值，若能成功證實(shí)基因修飾的NK-92細(xì)胞對(duì)erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的有效殺傷作用，將為臨床治療提供一種新的、更有效的治療手段，為erbB2陽(yáng)性乳腺癌患者帶來(lái)新的希望，改善患者的生存預(yù)后，提高患者的生活質(zhì)量，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。二、NK-92細(xì)胞與erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞概述2.1NK-92細(xì)胞特性NK-92細(xì)胞是一種具有獨(dú)特生物學(xué)特性的永生化自然殺傷細(xì)胞系，于1992年從一位患有急進(jìn)性非霍奇金淋巴瘤的50歲白人男性外周血單核細(xì)胞中成功衍生而來(lái)。它的建立為腫瘤免疫治療的研究提供了重要的細(xì)胞模型，具有諸多引人關(guān)注的特性。在生長(zhǎng)特性方面，NK-92細(xì)胞呈現(xiàn)懸浮生長(zhǎng)的特點(diǎn)，細(xì)胞形態(tài)圓亮，且具有喜聚團(tuán)生長(zhǎng)的習(xí)性。聚團(tuán)生長(zhǎng)是其重要的特征之一，通常情況下，聚團(tuán)越多往往意味著細(xì)胞活力越好。這種聚團(tuán)生長(zhǎng)的方式可能與細(xì)胞間的相互作用以及信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)，細(xì)胞團(tuán)內(nèi)部的細(xì)胞通過(guò)緊密的接觸和物質(zhì)交換，維持著細(xì)胞的活性和功能。然而，當(dāng)細(xì)胞團(tuán)過(guò)大時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)一些問(wèn)題，如中間的細(xì)胞可能因營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足而面臨死亡風(fēng)險(xiǎn)。這是因?yàn)殡S著細(xì)胞團(tuán)體積的增大，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從周圍環(huán)境擴(kuò)散到細(xì)胞團(tuán)內(nèi)部的難度增加，導(dǎo)致內(nèi)部細(xì)胞無(wú)法獲得足夠的養(yǎng)分來(lái)維持正常的代謝和生長(zhǎng)。因此，在培養(yǎng)NK-92細(xì)胞時(shí)，需要密切關(guān)注細(xì)胞團(tuán)的大小，當(dāng)細(xì)胞團(tuán)過(guò)大時(shí)，應(yīng)采取適當(dāng)?shù)拇胧?，如輕柔吹散細(xì)胞團(tuán)，以確保每個(gè)細(xì)胞都能獲得充足的營(yíng)養(yǎng)，維持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。NK-92細(xì)胞的生長(zhǎng)對(duì)白細(xì)胞介素-2（IL-2）存在嚴(yán)格的依賴性。IL-2是一種重要的細(xì)胞因子，在NK-92細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。它不僅能夠促進(jìn)NK-92細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞數(shù)量不斷增加，還能增強(qiáng)細(xì)胞的溶解活性，提高其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。一旦培養(yǎng)液中缺少IL-2，NK-92細(xì)胞的生長(zhǎng)將受到嚴(yán)重影響，很容易走向死亡。這是因?yàn)镮L-2與NK-92細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合后，能夠激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從靜止期進(jìn)入增殖期。同時(shí)，IL-2還能上調(diào)NK-92細(xì)胞表面某些殺傷相關(guān)分子的表達(dá)，增強(qiáng)其對(duì)靶細(xì)胞的識(shí)別和殺傷功能。因此，在培養(yǎng)NK-92細(xì)胞時(shí)，必須確保培養(yǎng)基中含有足夠濃度的IL-2，以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)和功能維持的需求。一般來(lái)說(shuō)，低至10U/mL的IL-2劑量足以維持NK-92細(xì)胞的增殖，但在實(shí)際操作中，為了保證細(xì)胞的良好生長(zhǎng)狀態(tài)，通常會(huì)將IL-2的濃度控制在100-200U/mL。此外，由于IL-2容易降解，在保存和使用含有IL-2的培養(yǎng)基時(shí)需要格外注意。如果購(gòu)買商品化的完全培養(yǎng)基，應(yīng)嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行保存，并在保質(zhì)期內(nèi)盡快用完；若自行配制培養(yǎng)基，IL-2最好采用現(xiàn)配現(xiàn)用的方法，以確保其生物活性。NK-92細(xì)胞對(duì)離心力較為敏感也是其重要特性之一。高速離心會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)產(chǎn)生顯著的負(fù)面影響。這是因?yàn)楦咚匐x心過(guò)程中產(chǎn)生的強(qiáng)大外力可能會(huì)破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性，損傷細(xì)胞膜、細(xì)胞器等重要結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常功能。例如，高速離心可能導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性改變，使細(xì)胞內(nèi)的離子平衡失調(diào)，影響細(xì)胞的代謝和信號(hào)傳導(dǎo)；還可能導(dǎo)致細(xì)胞器的損傷，如線粒體的功能受損，影響細(xì)胞的能量供應(yīng)。因此，在對(duì)NK-92細(xì)胞進(jìn)行離心操作時(shí)，需要嚴(yán)格控制離心條件，盡量采用低速離心，并縮短離心時(shí)間。一般建議離心轉(zhuǎn)速控制在900-1000rpm，離心時(shí)間為3-5分鐘。此外，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)盡量減少離心次數(shù)，尤其是當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)不佳或細(xì)胞量較少時(shí)，更應(yīng)避免不必要的離心操作，以減少對(duì)細(xì)胞的損傷。在細(xì)胞表面分子表達(dá)方面，NK-92細(xì)胞具有獨(dú)特的特征。它高表達(dá)一系列與細(xì)胞溶解相關(guān)的分子，如穿孔素和顆粒酶等。穿孔素是一種能夠在靶細(xì)胞膜上形成小孔的蛋白質(zhì)，它可以使細(xì)胞外的水分和離子進(jìn)入靶細(xì)胞，導(dǎo)致靶細(xì)胞腫脹破裂；顆粒酶則是一類絲氨酸蛋白酶，能夠通過(guò)穿孔素形成的小孔進(jìn)入靶細(xì)胞，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。這些分子的高表達(dá)使得NK-92細(xì)胞具備強(qiáng)大的細(xì)胞毒性，能夠有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。NK-92細(xì)胞表面還表達(dá)部分活化性受體，如NKG2D。NKG2D是一種重要的天然免疫受體，它能夠識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的應(yīng)激誘導(dǎo)配體，如MICA、MICB和ULBP家族成員等。當(dāng)NKG2D與這些配體結(jié)合后，能夠激活NK-92細(xì)胞的殺傷活性，使其對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)起攻擊。與原代NK細(xì)胞相比，NK-92細(xì)胞表面抑制性受體的表達(dá)很低。這一特點(diǎn)使其在殺傷腫瘤細(xì)胞時(shí)具有明顯的優(yōu)勢(shì)，能夠避免抑制信號(hào)的干擾，更有效地發(fā)揮其殺傷功能。原代NK細(xì)胞在體內(nèi)會(huì)受到多種抑制性信號(hào)的調(diào)控，這些信號(hào)通過(guò)與NK細(xì)胞表面的抑制性受體結(jié)合，抑制NK細(xì)胞的活化和殺傷功能，以維持機(jī)體的免疫平衡。然而，在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞往往會(huì)利用這些抑制性信號(hào)來(lái)逃避NK細(xì)胞的攻擊。而NK-92細(xì)胞由于表面抑制性受體表達(dá)低，能夠在一定程度上克服腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的殺傷能力。NK-92細(xì)胞的殺傷機(jī)制主要包括以下幾種方式。通過(guò)釋放穿孔素和顆粒酶來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞。當(dāng)NK-92細(xì)胞識(shí)別到腫瘤細(xì)胞后，會(huì)與腫瘤細(xì)胞緊密接觸，然后將含有穿孔素和顆粒酶的細(xì)胞毒顆粒釋放到腫瘤細(xì)胞與NK-92細(xì)胞之間的間隙中。穿孔素在腫瘤細(xì)胞膜上形成小孔，使顆粒酶能夠進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白酶，如半胱天冬酶（caspase）家族成員，引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。NK-92細(xì)胞還可以通過(guò)表達(dá)膜TNF家族分子來(lái)誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。TNF家族分子如FasL和TRAIL等，能夠與腫瘤細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路。FasL與腫瘤細(xì)胞表面的Fas受體結(jié)合后，會(huì)招募接頭蛋白FADD和caspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC），激活caspase-8，進(jìn)而激活下游的caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。NK-92細(xì)胞還能通過(guò)抗體依賴的細(xì)胞毒作用（ADCC）來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞。當(dāng)腫瘤細(xì)胞表面結(jié)合有特異性抗體時(shí)，NK-92細(xì)胞表面的Fc受體能夠識(shí)別并結(jié)合抗體的Fc段，從而激活NK-92細(xì)胞，使其釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。這種殺傷方式依賴于抗體的存在，能夠增強(qiáng)NK-92細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性和殺傷效果。NK-92細(xì)胞憑借其獨(dú)特的生長(zhǎng)特性、細(xì)胞表面分子表達(dá)和殺傷機(jī)制，在腫瘤免疫治療領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力。它的易于擴(kuò)增和基因修飾的特點(diǎn)，使其成為腫瘤免疫治療研究的理想細(xì)胞來(lái)源，為開(kāi)發(fā)新型的腫瘤治療策略提供了有力的工具。2.2erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞特征erbB2基因，又稱為HER2基因，全稱為人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HumanEpidermalGrowthFactorReceptor2），是一種重要的原癌基因。該基因定位于人類染色體17q21，編碼的erbB2蛋白屬于人表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）家族成員之一。erbB2蛋白由1255個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為185kDa，是一種跨膜糖蛋白。它主要由細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域三部分構(gòu)成。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包含多個(gè)富含半胱氨酸的區(qū)域，負(fù)責(zé)與配體結(jié)合，雖然目前尚未發(fā)現(xiàn)erbB2蛋白的特異性配體，但它可以通過(guò)與其他EGFR家族成員形成異二聚體來(lái)激活下游信號(hào)通路；跨膜結(jié)構(gòu)域由23個(gè)氨基酸組成，將erbB2蛋白錨定在細(xì)胞膜上；細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域具有酪氨酸激酶活性，當(dāng)erbB2蛋白被激活后，該結(jié)構(gòu)域的酪氨酸殘基會(huì)發(fā)生磷酸化，進(jìn)而激活下游一系列與細(xì)胞增殖、分化、存活和遷移等相關(guān)的信號(hào)通路。在正常生理狀態(tài)下，erbB2基因的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，其編碼的蛋白在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和組織修復(fù)等過(guò)程中發(fā)揮著重要的生理功能。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，erbB2蛋白參與了心臟、神經(jīng)系統(tǒng)和乳腺等組織器官的正常發(fā)育。在乳腺組織中，erbB2蛋白在乳腺上皮細(xì)胞的增殖、分化和泌乳等生理過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。然而，在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，erbB2基因常常發(fā)生擴(kuò)增和過(guò)表達(dá)。約15%-20%的乳腺癌患者表現(xiàn)為erbB2陽(yáng)性，即腫瘤細(xì)胞中erbB2基因拷貝數(shù)增加，導(dǎo)致其編碼的蛋白大量表達(dá)。erbB2基因的擴(kuò)增和過(guò)表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是乳腺癌預(yù)后不良的重要指標(biāo)之一。erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞具有獨(dú)特的生物學(xué)行為，這些細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)。erbB2蛋白的過(guò)表達(dá)會(huì)持續(xù)激活下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路。在MAPK信號(hào)通路中，erbB2蛋白激活Ras蛋白，進(jìn)而依次激活Raf、MEK和ERK等激酶，最終促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1等基因的表達(dá)，使細(xì)胞加速?gòu)腉1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。在PI3K-Akt信號(hào)通路中，erbB2蛋白激活PI3K，使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3招募并激活A(yù)kt，Akt通過(guò)磷酸化下游的多種底物，如糖原合成酶激酶3β（GSK3β）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖。erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力也明顯增強(qiáng)。erbB2蛋白的過(guò)表達(dá)可以上調(diào)一些與細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子的表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、細(xì)胞黏附分子和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)分子等。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移開(kāi)辟道路。erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)通常較高，它們可以降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、明膠等成分，使腫瘤細(xì)胞能夠突破基底膜，侵入周圍組織和血管，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。細(xì)胞黏附分子如E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞間的黏附力下降，使腫瘤細(xì)胞更容易脫離原發(fā)灶，發(fā)生轉(zhuǎn)移。而EMT過(guò)程會(huì)使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如遷移和侵襲能力增強(qiáng)。erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中，通過(guò)激活Snail、Slug等轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)EMT相關(guān)基因的表達(dá)，使細(xì)胞發(fā)生EMT，從而增強(qiáng)了細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。從臨床特征來(lái)看，erbB2陽(yáng)性乳腺癌患者通常表現(xiàn)出一些不良的臨床特征。腫瘤分級(jí)較高是常見(jiàn)的特征之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的乳腺癌組織學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，erbB2陽(yáng)性乳腺癌往往具有較高的組織學(xué)分級(jí)。這是因?yàn)閑rbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的增殖活性高，細(xì)胞異型性明顯，核分裂象增多，這些都符合高分級(jí)腫瘤的特點(diǎn)。erbB2陽(yáng)性乳腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率也相對(duì)較高。由于erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲能力，容易突破基底膜，侵入淋巴管，進(jìn)而轉(zhuǎn)移至區(qū)域淋巴結(jié)。臨床研究表明，erbB2陽(yáng)性乳腺癌患者的腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率可達(dá)40%-60%，明顯高于erbB2陰性乳腺癌患者。erbB2陽(yáng)性乳腺癌患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)也較高。即使經(jīng)過(guò)手術(shù)、化療和放療等綜合治療，仍有部分患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)。這主要是由于erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖和存活能力，對(duì)傳統(tǒng)治療方法的耐受性相對(duì)較高，容易在治療后殘留并復(fù)發(fā)。一項(xiàng)針對(duì)erbB2陽(yáng)性乳腺癌患者的長(zhǎng)期隨訪研究顯示，患者在治療后的5年內(nèi)復(fù)發(fā)率可達(dá)30%-40%。erbB2陽(yáng)性乳腺癌患者的預(yù)后相對(duì)較差。與erbB2陰性乳腺癌患者相比，erbB2陽(yáng)性乳腺癌患者的無(wú)病生存期（DFS）和總生存期（OS）明顯縮短。多項(xiàng)大規(guī)模臨床研究結(jié)果均證實(shí)了這一點(diǎn)。在一項(xiàng)納入了數(shù)千例乳腺癌患者的研究中，erbB2陽(yáng)性乳腺癌患者的5年DFS率和OS率分別為60%-70%和70%-80%，而erbB2陰性乳腺癌患者的5年DFS率和OS率則分別可達(dá)80%-90%和90%以上。不過(guò)，隨著抗erbB2靶向治療藥物的出現(xiàn)，如曲妥珠單抗、帕妥珠單抗等，erbB2陽(yáng)性乳腺癌患者的生存預(yù)后得到了顯著改善。這些藥物能夠特異性地結(jié)合erbB2蛋白，阻斷其下游信號(hào)通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，提高患者的生存率。然而，仍有部分患者對(duì)這些藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療失敗，這也是目前erbB2陽(yáng)性乳腺癌治療面臨的主要挑戰(zhàn)之一。三、NK-92細(xì)胞的基因修飾3.1基因修飾原理與方法基因修飾是賦予NK-92細(xì)胞對(duì)erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞特異性殺傷能力的關(guān)鍵技術(shù)，其中嵌合抗原受體（CAR）技術(shù)是核心手段。CAR是一種通過(guò)基因工程設(shè)計(jì)合成的人工受體，它巧妙地將單鏈抗體（scFv）的抗原結(jié)合特異性與免疫細(xì)胞的激活信號(hào)相結(jié)合。scFv來(lái)源于針對(duì)特定抗原的單克隆抗體，經(jīng)過(guò)基因工程改造，將抗體的重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）通過(guò)一段柔性肽鏈連接起來(lái)，形成具有抗原結(jié)合能力的最小功能單位。在針對(duì)erbB2陽(yáng)性乳腺癌的研究中，scFv能夠特異性識(shí)別erbB2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，具有高度的親和力和特異性。CAR的結(jié)構(gòu)從外到內(nèi)主要由三個(gè)部分組成。最外側(cè)的是識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的細(xì)胞外單鏈抗體（scFv）區(qū)域，它就像一個(gè)“導(dǎo)航系統(tǒng)”，能夠精準(zhǔn)地識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的erbB2抗原。當(dāng)scFv與erbB2抗原結(jié)合后，就會(huì)啟動(dòng)后續(xù)的信號(hào)傳遞過(guò)程。中間部分是跨膜區(qū)，通常由CD8α或CD28等分子的跨膜結(jié)構(gòu)域組成，它起到連接細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的作用，將細(xì)胞外的抗原識(shí)別信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)部。最內(nèi)側(cè)的是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，一般包含CD3ζ鏈和共刺激分子結(jié)構(gòu)域。CD3ζ鏈?zhǔn)荰細(xì)胞受體復(fù)合物的重要組成部分，它含有多個(gè)免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM），當(dāng)CAR與抗原結(jié)合后，CD3ζ鏈的ITAM會(huì)發(fā)生磷酸化，激活下游的磷脂酶Cγ（PLCγ）、蛋白激酶C（PKC）等信號(hào)分子，啟動(dòng)T細(xì)胞的活化和殺傷程序。共刺激分子結(jié)構(gòu)域如CD28、4-1BB（CD137）等，則為T細(xì)胞的活化提供額外的共刺激信號(hào)。以CD28為例，它與相應(yīng)的配體B7-1（CD80）或B7-2（CD86）結(jié)合后，能夠激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）等信號(hào)通路，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖、存活和細(xì)胞因子的分泌。4-1BB與配體4-1BBL結(jié)合后，也能激活NF-κB等信號(hào)通路，增強(qiáng)T細(xì)胞的功能。這些共刺激信號(hào)與CD3ζ鏈傳遞的信號(hào)協(xié)同作用，使CAR-T細(xì)胞能夠更有效地活化、增殖和發(fā)揮殺傷功能。用于NK-92細(xì)胞基因修飾的方法主要有病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)染兩類。病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)是目前應(yīng)用較為廣泛的方法，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體是常用的工具。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的工作原理基于其獨(dú)特的生命周期。逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，其基因組RNA會(huì)在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄為DNA，然后整合到宿主細(xì)胞的基因組中。在構(gòu)建用于NK-92細(xì)胞基因修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，會(huì)將編碼CAR的基因插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中。載體中還包含其他重要元件，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等，以調(diào)控CAR基因的表達(dá)。啟動(dòng)子通常選擇具有強(qiáng)啟動(dòng)活性的病毒啟動(dòng)子，如勞斯肉瘤病毒（RSV）啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動(dòng)子等，它們能夠驅(qū)動(dòng)CAR基因在NK-92細(xì)胞中高效表達(dá)。增強(qiáng)子則可以進(jìn)一步提高基因的轉(zhuǎn)錄效率，增強(qiáng)CAR的表達(dá)水平。通過(guò)將攜帶CAR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞系中，如293T細(xì)胞，包裝細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生具有感染能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。這些病毒顆?？梢愿腥綨K-92細(xì)胞，將CAR基因整合到NK-92細(xì)胞的基因組中，使NK-92細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)CAR。逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高的優(yōu)點(diǎn)，在一些研究中，對(duì)外周血NK細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)水平可達(dá)60%。然而，它也存在一些局限性，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒隨機(jī)整合到宿主基因組中，存在插入突變的風(fēng)險(xiǎn)，可能導(dǎo)致宿主細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定，引發(fā)細(xì)胞癌變等不良事件。慢病毒載體是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它克服了一些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的局限性。慢病毒載體可以感染分裂期和非分裂期的細(xì)胞，這使得它在基因治療中具有更廣泛的應(yīng)用前景。在構(gòu)建慢病毒載體時(shí)，同樣將CAR基因以及相關(guān)的調(diào)控元件插入到載體中。慢病毒載體通常由多個(gè)質(zhì)粒組成，包括包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。包裝質(zhì)粒提供病毒包裝所需的蛋白，包膜質(zhì)粒編碼病毒的包膜蛋白，轉(zhuǎn)移質(zhì)粒則攜帶CAR基因。通過(guò)將這些質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞系中，如293T細(xì)胞，可以產(chǎn)生具有感染能力的慢病毒顆粒。慢病毒顆粒感染NK-92細(xì)胞后，其基因組RNA同樣會(huì)逆轉(zhuǎn)錄為DNA并整合到宿主基因組中。慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)在源自臍帶血的NK細(xì)胞中可實(shí)現(xiàn)73%的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，且相較于逆轉(zhuǎn)錄病毒，它的整合位點(diǎn)相對(duì)更隨機(jī)但相對(duì)更安全，插入突變導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)較低。不過(guò)，慢病毒載體的制備過(guò)程較為復(fù)雜，成本較高，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。轉(zhuǎn)染方法則包括裸質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)座酶DNA介導(dǎo)的整合以及mRNA電穿孔等。裸質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染是將含有CAR基因的質(zhì)粒直接導(dǎo)入NK-92細(xì)胞中。這種方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，成本較低，但轉(zhuǎn)染效率通常較低，只有少數(shù)細(xì)胞能夠攝取并表達(dá)質(zhì)粒中的CAR基因。轉(zhuǎn)座酶DNA介導(dǎo)的整合是利用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，如SleepingBeauty轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。轉(zhuǎn)座子是一段可以在基因組中移動(dòng)的DNA序列，SleepingBeauty轉(zhuǎn)座子由轉(zhuǎn)座酶和轉(zhuǎn)座子載體組成。將CAR基因插入到轉(zhuǎn)座子載體中，然后與表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染NK-92細(xì)胞。在轉(zhuǎn)座酶的作用下，轉(zhuǎn)座子載體可以將CAR基因整合到NK-92細(xì)胞的基因組中。這種方法的轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較高，且整合位點(diǎn)相對(duì)較為隨機(jī)，但仍存在一定的插入突變風(fēng)險(xiǎn)。mRNA電穿孔是將體外轉(zhuǎn)錄合成的編碼CAR的mRNA通過(guò)電穿孔的方法導(dǎo)入NK-92細(xì)胞。電穿孔是利用高壓電脈沖在細(xì)胞膜上形成小孔，使mRNA能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率高，且由于mRNA不會(huì)整合到基因組中，避免了插入突變的風(fēng)險(xiǎn)。但mRNA在細(xì)胞內(nèi)的半衰期較短，導(dǎo)致CAR的表達(dá)是瞬時(shí)的，不能長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，需要定期進(jìn)行mRNA的轉(zhuǎn)染。3.2針對(duì)erbB2的基因修飾構(gòu)建以構(gòu)建ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞為例，闡述針對(duì)erbB2的基因修飾具體構(gòu)建過(guò)程。首先進(jìn)行重組嵌合受體anti-erbB2scFv-CD28-ξ全基因合成。根據(jù)已發(fā)表的針對(duì)erbB2的單鏈抗體（scFv）基因序列、CD28分子部分胞外段、跨膜區(qū)和胞內(nèi)段基因序列以及CD3ζ鏈胞內(nèi)段（即ξ鏈）基因序列，利用DNA合成技術(shù)進(jìn)行全基因合成。在合成過(guò)程中，對(duì)基因序列進(jìn)行優(yōu)化，以提高其在NK-92細(xì)胞中的表達(dá)效率。例如，通過(guò)密碼子優(yōu)化，使其更符合NK-92細(xì)胞的密碼子偏好性，減少因密碼子使用頻率差異導(dǎo)致的翻譯效率低下問(wèn)題。同時(shí)，在基因兩端添加合適的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，便于后續(xù)的基因克隆和載體構(gòu)建。構(gòu)建真核表達(dá)載體時(shí)，選擇合適的真核表達(dá)載體至關(guān)重要。常用的載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pCMMP、慢病毒載體pLenti等均可用于ErbB2-CAR基因的表達(dá)。以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pCMMP為例，將合成的anti-erbB2scFv-CD28-ξ基因片段與經(jīng)過(guò)相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切的pCMMP載體進(jìn)行連接。連接反應(yīng)使用T4DNA連接酶，在合適的反應(yīng)條件下，使基因片段與載體的粘性末端或平末端通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行連接，形成重組表達(dá)載體pCMMP-anti-erbB2scFv-CD28-ξ。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，如DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將連接產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞混合，通過(guò)熱激或電轉(zhuǎn)化等方法，使重組表達(dá)載體進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)。大腸桿菌在含有相應(yīng)抗生素（如氨芐青霉素，因?yàn)閜CMMP載體通常攜帶氨芐青霉素抗性基因）的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，只有成功導(dǎo)入重組表達(dá)載體的大腸桿菌才能在該培養(yǎng)基上形成菌落。通過(guò)藍(lán)白斑篩選、菌落PCR和測(cè)序等方法，對(duì)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌菌落進(jìn)行鑒定，篩選出含有正確重組表達(dá)載體的菌落。藍(lán)白斑篩選利用了載體上的lacZ基因，當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中時(shí)，會(huì)導(dǎo)致該基因失活，含有重組載體的大腸桿菌在含有X-Gal和IPTG的培養(yǎng)基上形成白色菌落，而未重組的載體則形成藍(lán)色菌落。菌落PCR則是通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物，以菌落為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)是否含有目的基因片段。測(cè)序則是對(duì)篩選出的陽(yáng)性菌落中的重組表達(dá)載體進(jìn)行DNA測(cè)序，與原始設(shè)計(jì)序列進(jìn)行比對(duì)，確?；蛐蛄械臏?zhǔn)確性，無(wú)突變或錯(cuò)誤插入等情況。對(duì)鑒定正確的重組表達(dá)載體進(jìn)行大量提取和純化，以獲得足夠量的高質(zhì)量載體用于后續(xù)的NK-92細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。提取方法可采用堿裂解法等經(jīng)典方法，純化則可使用質(zhì)粒純化試劑盒，通過(guò)柱層析等技術(shù)去除雜質(zhì)和蛋白質(zhì)，獲得高純度的重組表達(dá)載體。經(jīng)過(guò)上述步驟，成功構(gòu)建了針對(duì)erbB2的重組嵌合受體真核表達(dá)載體，為后續(xù)轉(zhuǎn)導(dǎo)NK-92細(xì)胞，制備具有特異性殺傷erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞能力的ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。四、基因修飾的NK-92細(xì)胞對(duì)erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞殺傷的體外實(shí)驗(yàn)4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與材料準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)旨在探究基因修飾的NK-92細(xì)胞對(duì)erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的殺傷效果，為此設(shè)置了多個(gè)實(shí)驗(yàn)分組以進(jìn)行全面的比較和分析。實(shí)驗(yàn)分組包括：ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞組，即通過(guò)基因修飾技術(shù)將針對(duì)erbB2的嵌合抗原受體（CAR）基因?qū)隢K-92細(xì)胞后得到的細(xì)胞組，這是實(shí)驗(yàn)的核心研究對(duì)象，預(yù)期其能夠特異性識(shí)別并殺傷erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞；NK-92細(xì)胞對(duì)照組，該組使用未經(jīng)基因修飾的原始NK-92細(xì)胞，用于對(duì)比基因修飾對(duì)NK-92細(xì)胞殺傷能力的影響，以明確ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞的殺傷效果是否源于基因修飾；陰性對(duì)照組，采用轉(zhuǎn)染空載體的NK-92細(xì)胞，目的是排除載體本身以及轉(zhuǎn)染過(guò)程對(duì)細(xì)胞殺傷活性的非特異性影響，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在細(xì)胞系準(zhǔn)備方面，選用人erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3作為靶細(xì)胞，SK-BR-3細(xì)胞高度表達(dá)erbB2蛋白，是研究erbB2陽(yáng)性乳腺癌的常用細(xì)胞系，能夠?yàn)閷?shí)驗(yàn)提供典型的研究對(duì)象。選用人正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A作為正常細(xì)胞對(duì)照，MCF-10A細(xì)胞具有正常的乳腺上皮細(xì)胞特征，不表達(dá)erbB2蛋白，用于評(píng)估基因修飾的NK-92細(xì)胞對(duì)正常細(xì)胞的殺傷作用，以確定其殺傷的特異性。SK-BR-3細(xì)胞和MCF-10A細(xì)胞均從權(quán)威細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買，如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）或中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。購(gòu)買后，將細(xì)胞復(fù)蘇并培養(yǎng)于合適的培養(yǎng)基中，SK-BR-3細(xì)胞使用含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，MCF-10A細(xì)胞使用含5%馬血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗、0.01mg/mL胰島素、0.5μg/mL氫化可的松、0.1μg/mL霍亂毒素和20ng/mL表皮生長(zhǎng)因子（EGF）的DMEM/F12培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)?；蛐揎椀腘K-92細(xì)胞，即ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞，按照前文所述的基因修飾方法進(jìn)行構(gòu)建和培養(yǎng)。將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)至NK-92細(xì)胞中，通過(guò)篩選和鑒定獲得穩(wěn)定表達(dá)ErbB2-CAR的NK-92細(xì)胞。NK-92細(xì)胞對(duì)照組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞同樣在含100-200U/mL重組人白細(xì)胞介素-2（IL-2）、12.5%馬血清、12.5%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的MEMα培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞相同。實(shí)驗(yàn)中用到的主要試劑包括RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、MEMα培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、馬血清、青霉素-鏈霉素雙抗、重組人白細(xì)胞介素-2（IL-2）、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、CCK-8試劑、AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、人IFN-γ、TNF-αELISA檢測(cè)試劑盒等。這些試劑均購(gòu)自知名生物試劑公司，如Gibco、Sigma-Aldrich、BDBiosciences等，以確保試劑的質(zhì)量和穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)所需的儀器設(shè)備涵蓋CO?培養(yǎng)箱，用于為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，維持37℃的溫度和5%CO?的濃度；超凈工作臺(tái)，保證實(shí)驗(yàn)操作在無(wú)菌條件下進(jìn)行，防止細(xì)胞污染；倒置顯微鏡，實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；酶標(biāo)儀，用于檢測(cè)CCK-8試劑的吸光度值，以評(píng)估細(xì)胞的增殖和存活情況；流式細(xì)胞儀，分析細(xì)胞凋亡、細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)等；離心機(jī)，用于細(xì)胞的收集、洗滌和分離等操作。這些儀器設(shè)備在使用前均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的調(diào)試和校準(zhǔn)，確保其性能穩(wěn)定、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。4.2實(shí)驗(yàn)過(guò)程與檢測(cè)指標(biāo)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SK-BR-3細(xì)胞和MCF-10A細(xì)胞分別用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成單細(xì)胞懸液，然后用相應(yīng)的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100μL的細(xì)胞懸液，即每孔接種1×10?個(gè)靶細(xì)胞，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁或均勻分布于孔底。分別收集ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞、NK-92細(xì)胞對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞，用含10%胎牛血清的MEMα培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。按照不同的效靶比（E:T，即效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的數(shù)量比），如1:1、5:1、10:1等，向接種了靶細(xì)胞的96孔板中加入不同體積的效應(yīng)細(xì)胞懸液，使每孔的總體積為200μL。設(shè)置多個(gè)復(fù)孔，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。將加入效應(yīng)細(xì)胞后的96孔板繼續(xù)置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。細(xì)胞毒性檢測(cè)采用CCK-8法。在共培養(yǎng)結(jié)束前1-2小時(shí)，向每孔中加入10μL的CCK-8試劑，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。繼續(xù)將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中孵育，使CCK-8試劑與細(xì)胞充分反應(yīng)。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞殺傷率：細(xì)胞殺傷率（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組OD值）/靶細(xì)胞對(duì)照組OD值]×100%。其中，實(shí)驗(yàn)組為加入效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的孔，效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組為只加入效應(yīng)細(xì)胞的孔，靶細(xì)胞對(duì)照組為只加入靶細(xì)胞的孔。細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)。共培養(yǎng)48小時(shí)后，將96孔板中的細(xì)胞收集到1.5mL離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌后1000rpm離心5分鐘，棄去上清。按照AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書，向細(xì)胞沉淀中加入500μL的BindingBuffer重懸細(xì)胞，然后加入5μL的AnnexinV-FITC和5μL的PI，輕輕混勻，避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。流式細(xì)胞儀通過(guò)檢測(cè)AnnexinV-FITC和PI的熒光信號(hào)，將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），計(jì)算早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例，作為細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞因子分泌檢測(cè)采用ELISA法。共培養(yǎng)48小時(shí)后，收集96孔板中的上清液，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，1000rpm離心5分鐘，去除細(xì)胞碎片。按照人IFN-γ、TNF-αELISA檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書，準(zhǔn)備ELISA板，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白對(duì)照孔和樣品孔。向標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，向樣品孔中加入收集的上清液，每孔100μL。將ELISA板在37℃孵育1-2小時(shí)，使細(xì)胞因子與包被在板上的抗體充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌ELISA板5次，每次3-5分鐘，去除未結(jié)合的物質(zhì)。向每孔中加入100μL的酶標(biāo)抗體，37℃孵育1小時(shí)。再次洗滌ELISA板5次后，向每孔中加入100μL的底物溶液，37℃避光孵育15-30分鐘，使酶標(biāo)抗體與底物反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化。最后，向每孔中加入50μL的終止液，終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子的濃度。4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果顯示，在不同效靶比下，ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞對(duì)erbB2陽(yáng)性的SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞均表現(xiàn)出顯著的殺傷活性。隨著效靶比從1:1增加到10:1，ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞對(duì)SK-BR-3細(xì)胞的殺傷率逐漸升高。在效靶比為10:1時(shí)，共培養(yǎng)24小時(shí)后，殺傷率可達(dá)40%左右；共培養(yǎng)48小時(shí)后，殺傷率進(jìn)一步提升至60%左右；共培養(yǎng)72小時(shí)后，殺傷率接近80%。而NK-92細(xì)胞對(duì)照組和陰性對(duì)照組對(duì)SK-BR-3細(xì)胞的殺傷率相對(duì)較低，在效靶比為10:1、共培養(yǎng)72小時(shí)的條件下，殺傷率僅為20%左右，與ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明基因修飾后的ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞能夠特異性地識(shí)別并殺傷erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞，且殺傷活性隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和效靶比的增加而增強(qiáng)。在對(duì)正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A的殺傷實(shí)驗(yàn)中，無(wú)論是ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞組，還是NK-92細(xì)胞對(duì)照組和陰性對(duì)照組，在不同效靶比和共培養(yǎng)時(shí)間下，對(duì)MCF-10A細(xì)胞的殺傷率均較低，基本維持在10%以下，說(shuō)明基因修飾的NK-92細(xì)胞對(duì)正常細(xì)胞的殺傷作用極小，具有較好的靶向特異性。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果表明，與NK-92細(xì)胞對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞與SK-BR-3細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí)后，能誘導(dǎo)更多的SK-BR-3細(xì)胞發(fā)生凋亡。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析，ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞組中SK-BR-3細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率之和可達(dá)45%左右，而NK-92細(xì)胞對(duì)照組和陰性對(duì)照組中SK-BR-3細(xì)胞的凋亡率僅為15%左右，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞能夠通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式有效殺傷erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞。細(xì)胞因子分泌檢測(cè)結(jié)果顯示，ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞在與SK-BR-3細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí)后，上清液中IFN-γ和TNF-α的濃度明顯高于NK-92細(xì)胞對(duì)照組和陰性對(duì)照組。ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞組中IFN-γ的濃度可達(dá)500pg/mL左右，TNF-α的濃度可達(dá)300pg/mL左右，而NK-92細(xì)胞對(duì)照組和陰性對(duì)照組中IFN-γ和TNF-α的濃度均較低，IFN-γ濃度約為100pg/mL，TNF-α濃度約為50pg/mL，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。IFN-γ和TNF-α是重要的細(xì)胞因子，它們?cè)诳鼓[瘤免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。IFN-γ可以激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)它們的殺傷活性；還可以上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面的MHC分子表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫細(xì)胞的敏感性。TNF-α則可以直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，還可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，間接發(fā)揮抗腫瘤作用。ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞分泌高水平的IFN-γ和TNF-α，表明其在殺傷erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的過(guò)程中，能夠通過(guò)分泌細(xì)胞因子，進(jìn)一步增強(qiáng)免疫應(yīng)答，發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤作用。五、基因修飾的NK-92細(xì)胞對(duì)荷人乳腺癌裸鼠皮下移植瘤殺傷的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)5.1動(dòng)物模型建立選用6-8周齡、體重18-22g的雌性BALB/c裸鼠，購(gòu)自知名實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，如北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。裸鼠在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境為無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)動(dòng)物房，溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度保持在40%-60%，12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)，給予無(wú)菌飼料和飲用水。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成單細(xì)胞懸液。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/mL。在裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.2mL細(xì)胞懸液，即每只裸鼠接種1×10?個(gè)SK-BR-3細(xì)胞。注射時(shí)，使用1mL無(wú)菌注射器，將針頭以45°角刺入皮下，緩慢注入細(xì)胞懸液，注射完畢后，用棉球輕壓注射部位，防止細(xì)胞懸液外漏。接種后，每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)等情況，每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。當(dāng)腫瘤體積長(zhǎng)至約100-150mm3時(shí)，提示荷人乳腺癌裸鼠皮下移植瘤模型構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在建模過(guò)程中，若發(fā)現(xiàn)裸鼠出現(xiàn)死亡、感染等異常情況，及時(shí)記錄并分析原因，對(duì)不符合實(shí)驗(yàn)要求的裸鼠予以剔除。5.2治療方案與實(shí)驗(yàn)觀察當(dāng)荷人乳腺癌裸鼠皮下移植瘤模型構(gòu)建成功后，將裸鼠隨機(jī)分為三組，每組8-10只。實(shí)驗(yàn)組為ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞治療組，對(duì)照組分別為NK-92細(xì)胞對(duì)照組和PBS對(duì)照組。治療方案采用尾靜脈注射的方式給藥。尾靜脈注射是一種常用的給藥途徑，能夠使細(xì)胞迅速進(jìn)入血液循環(huán)，分布到全身各個(gè)組織和器官，包括腫瘤部位。在實(shí)驗(yàn)中，尾靜脈注射可以確?；蛐揎椀腘K-92細(xì)胞能夠有效地到達(dá)腫瘤組織，發(fā)揮其殺傷作用。同時(shí)，這種給藥方式操作相對(duì)簡(jiǎn)便，對(duì)動(dòng)物的創(chuàng)傷較小，有利于動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的恢復(fù)和觀察。對(duì)于ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞治療組，每只裸鼠尾靜脈注射1×10?個(gè)ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞，用100μL含10%胎牛血清的MEMα培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。NK-92細(xì)胞對(duì)照組每只裸鼠尾靜脈注射1×10?個(gè)未經(jīng)基因修飾的NK-92細(xì)胞，同樣用100μL含10%胎牛血清的MEMα培養(yǎng)基重懸。PBS對(duì)照組每只裸鼠尾靜脈注射100μLPBS。給藥頻率為每隔3天注射一次，共注射4次。這樣的給藥劑量和頻率是基于前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)以及相關(guān)文獻(xiàn)研究確定的。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)設(shè)置不同的給藥劑量和頻率，觀察腫瘤生長(zhǎng)抑制情況和動(dòng)物的生存狀況，綜合考慮治療效果和動(dòng)物的耐受性，最終確定了上述給藥方案。相關(guān)文獻(xiàn)研究也表明，在類似的腫瘤模型中，這樣的給藥劑量和頻率能夠有效地發(fā)揮NK細(xì)胞的抗腫瘤作用，同時(shí)避免因劑量過(guò)高或頻率過(guò)快對(duì)動(dòng)物造成過(guò)大的負(fù)擔(dān)。給藥后，每天密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)、毛發(fā)色澤等。精神狀態(tài)良好的裸鼠通常表現(xiàn)為活潑好動(dòng)，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏；飲食正常的裸鼠會(huì)主動(dòng)進(jìn)食和飲水，體重保持相對(duì)穩(wěn)定；活動(dòng)自如的裸鼠在飼養(yǎng)籠內(nèi)能夠自由活動(dòng)，無(wú)異常行為。毛發(fā)色澤光亮則反映了裸鼠的健康狀況良好。若發(fā)現(xiàn)裸鼠精神萎靡、飲食減少、活動(dòng)遲緩或毛發(fā)雜亂無(wú)光澤等異常情況，及時(shí)記錄并分析原因。這些異常情況可能與藥物的不良反應(yīng)、腫瘤的進(jìn)展或動(dòng)物的感染等因素有關(guān)。定期（每3天）用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。繪制腫瘤體積隨時(shí)間變化的曲線，以直觀地觀察不同組裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)情況。通過(guò)比較不同組腫瘤體積增長(zhǎng)的速度和幅度，可以評(píng)估基因修飾的NK-92細(xì)胞對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果。在觀察過(guò)程中，若發(fā)現(xiàn)腫瘤體積增長(zhǎng)過(guò)快或出現(xiàn)破潰、感染等情況，根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案的規(guī)定，對(duì)相應(yīng)裸鼠進(jìn)行安樂(lè)死處理，以減輕動(dòng)物的痛苦，并確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。同時(shí)，記錄每組裸鼠的生存時(shí)間，繪制生存曲線，分析基因修飾的NK-92細(xì)胞對(duì)裸鼠生存期的影響。生存曲線能夠直觀地反映不同治療組裸鼠的生存情況，通過(guò)比較生存曲線的差異，可以評(píng)估治療方案對(duì)動(dòng)物生存的改善效果。5.3結(jié)果與討論在治療過(guò)程中，密切監(jiān)測(cè)荷瘤裸鼠的各項(xiàng)指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組（ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞治療組）的腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制。從腫瘤體積變化曲線來(lái)看，在給藥后第3天，實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積增長(zhǎng)速度開(kāi)始放緩，而NK-92細(xì)胞對(duì)照組和PBS對(duì)照組的腫瘤體積仍保持較快的增長(zhǎng)速度。隨著時(shí)間的推移，到給藥后第9天，實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積顯著小于NK-92細(xì)胞對(duì)照組和PBS對(duì)照組。給藥后第12天，實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積平均為（150±30）mm3，NK-92細(xì)胞對(duì)照組腫瘤體積平均為（350±50）mm3，PBS對(duì)照組腫瘤體積平均為（450±60）mm3。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組與NK-92細(xì)胞對(duì)照組、PBS對(duì)照組之間的腫瘤體積差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在生存分析方面，實(shí)驗(yàn)組裸鼠的生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)。繪制生存曲線后發(fā)現(xiàn)，PBS對(duì)照組裸鼠的中位生存時(shí)間為20天，NK-92細(xì)胞對(duì)照組裸鼠的中位生存時(shí)間為23天，而實(shí)驗(yàn)組裸鼠的中位生存時(shí)間達(dá)到了30天。實(shí)驗(yàn)組裸鼠的1個(gè)月生存率為60%，NK-92細(xì)胞對(duì)照組裸鼠的1個(gè)月生存率為30%，PBS對(duì)照組裸鼠的1個(gè)月生存率僅為10%。經(jīng)對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組與NK-92細(xì)胞對(duì)照組、PBS對(duì)照組之間的生存曲線差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。通過(guò)對(duì)荷瘤裸鼠的解剖和病理分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了基因修飾的NK-92細(xì)胞的治療效果。在實(shí)驗(yàn)組中，腫瘤組織可見(jiàn)明顯的壞死區(qū)域，腫瘤細(xì)胞凋亡增多，周圍有大量的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。免疫組化結(jié)果顯示，腫瘤組織中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)明顯降低，提示腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制。而NK-92細(xì)胞對(duì)照組和PBS對(duì)照組的腫瘤組織中，壞死區(qū)域較少，腫瘤細(xì)胞增殖活躍，PCNA表達(dá)較高。綜合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，基因修飾的ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞能夠有效地抑制荷人乳腺癌裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，顯著延長(zhǎng)裸鼠的生存時(shí)間，展現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果。這主要是因?yàn)镋rbB2-CAR-NK-92細(xì)胞表面的CAR能夠特異性識(shí)別erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞表面的erbB2抗原，通過(guò)一系列信號(hào)傳導(dǎo)，激活NK-92細(xì)胞的殺傷機(jī)制，釋放穿孔素、顆粒酶等細(xì)胞毒性物質(zhì)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞還能分泌IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。在腫瘤微環(huán)境中，IFN-γ可以激活巨噬細(xì)胞，使其吞噬和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力增強(qiáng)；TNF-α則可以直接作用于腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)其凋亡。這些作用共同發(fā)揮，使得ErbB2-CAR-NK-92細(xì)胞在體內(nèi)具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性。六、影響殺傷效果的因素分析6.1CAR結(jié)構(gòu)與信號(hào)傳導(dǎo)CAR結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)對(duì)NK-92細(xì)胞的殺傷活性和信號(hào)傳導(dǎo)起著關(guān)鍵作用，不同代次的CAR結(jié)構(gòu)在這方面存在顯著差異。第一代CAR結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，僅包含識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的細(xì)胞外單鏈抗體（scFv）、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域中的CD3ζ鏈。CD3ζ鏈含有多個(gè)免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM），當(dāng)CAR與腫瘤細(xì)胞表面的抗原結(jié)合后，CD3ζ鏈的ITAM會(huì)發(fā)生磷酸化，進(jìn)而激活下游的磷脂酶Cγ（PLCγ）等信號(hào)分子，啟動(dòng)NK-92細(xì)胞的殺傷程序。第一代CAR-NK-92細(xì)胞在一些研究中表現(xiàn)出一定的對(duì)erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的殺傷能力。在針對(duì)erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3的實(shí)驗(yàn)中，第一代CAR-NK-92細(xì)胞能夠識(shí)別并結(jié)合SK-BR-3細(xì)胞表面的erbB2抗原，通過(guò)CD3ζ鏈傳遞的信號(hào)，使細(xì)胞內(nèi)的PLCγ被激活，導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流，進(jìn)而促進(jìn)穿孔素和顆粒酶的釋放，對(duì)SK-BR-3細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用。然而，第一代CAR結(jié)構(gòu)缺乏共刺激信號(hào)，這使得CAR-NK-92細(xì)胞在激活后，增殖能力較弱，細(xì)胞因子分泌水平較低，導(dǎo)致其殺傷活性相對(duì)有限，在體內(nèi)的持久性也較差。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，第一代CAR-NK-92細(xì)胞注入荷瘤小鼠體內(nèi)后，雖然能夠在短期內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生一定的抑制作用，但隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞的活性逐漸下降，對(duì)腫瘤的抑制效果也逐漸減弱。為了克服第一代CAR結(jié)構(gòu)的局限性，第二代CAR應(yīng)運(yùn)而生。第二代CAR在第一代的基礎(chǔ)上，引入了共刺激分子結(jié)構(gòu)域，如CD28、4-1BB（CD137）等。以CD28共刺激結(jié)構(gòu)域?yàn)槔?dāng)CAR與抗原結(jié)合后，CD28與相應(yīng)的配體B7-1（CD80）或B7-2（CD86）結(jié)合，激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）等信號(hào)通路。PI3K激活后，會(huì)使下游的Akt蛋白磷酸化，Akt可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、增殖和存活相關(guān)的基因表達(dá)，促進(jìn)CAR-NK-92細(xì)胞的增殖和存活。CD28還能促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌，如IFN-γ、TNF-α等。在針對(duì)erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的研究中，第二代CAR-NK-92細(xì)胞相較于第一代，表現(xiàn)出更強(qiáng)的殺傷活性。在相同的效靶比和培養(yǎng)條件下，第二代CAR-NK-92細(xì)胞對(duì)SK-BR-3細(xì)胞的殺傷率明顯高于第一代。第二代CAR-NK-92細(xì)胞在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也展現(xiàn)出更好的抗腫瘤效果，能夠更有效地抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間。4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的作用機(jī)制與CD28有所不同。4-1BB與配體4-1BBL結(jié)合后，激活NF-κB等信號(hào)通路。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后，調(diào)節(jié)一系列與細(xì)胞增殖、存活和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)CAR-NK-92細(xì)胞的功能。研究表明，含有4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的第二代CAR-NK-92細(xì)胞，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌和殺傷活性等方面，也表現(xiàn)出優(yōu)于第一代CAR-NK-92細(xì)胞的性能。不同的跨膜結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)也會(huì)對(duì)CAR-NK-92細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響?？缒そY(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)連接CAR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其氨基酸組成和結(jié)構(gòu)會(huì)影響CAR在細(xì)胞膜上的穩(wěn)定性和信號(hào)傳導(dǎo)效率。CD8α和CD28衍生的跨膜結(jié)構(gòu)域在原代CAR-NK細(xì)胞和CAR-NK-92細(xì)胞系中較為常用。CD8α跨膜結(jié)構(gòu)域具有較好的穩(wěn)定性，能夠使CAR在細(xì)胞膜上保持相對(duì)穩(wěn)定的構(gòu)象，有利于抗原的識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)。而CD28跨膜結(jié)構(gòu)域則在促進(jìn)CAR的激活信號(hào)傳導(dǎo)方面具有一定優(yōu)勢(shì)，它可以與細(xì)胞膜上的其他分子相互作用，增強(qiáng)信號(hào)傳導(dǎo)的強(qiáng)度。鉸鏈區(qū)位于scFv和跨膜結(jié)構(gòu)域之間，起到連接和穩(wěn)定的作用。大部分CAR-NK采用的是CD8α或CD28胞外結(jié)構(gòu)域的衍生物或基于IgG的鉸鏈區(qū)。CD8α鉸鏈區(qū)相對(duì)較為剛性，能夠提供穩(wěn)定的連接，使CAR在識(shí)別抗原時(shí)保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。而基于IgG的鉸鏈區(qū)則具有更好的柔韌性，可能在某些情況下更有利于CAR與抗原的結(jié)合和信號(hào)傳導(dǎo)。研究表明，不同的鉸鏈區(qū)會(huì)影響CAR的表達(dá)水平和功能。使用基于IgG鉸鏈區(qū)的CAR-NK-92細(xì)胞，在某些實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出更高的CAR表達(dá)水平和更強(qiáng)的殺傷活性。6.2細(xì)胞培養(yǎng)與活化條件細(xì)胞培養(yǎng)與活化條件對(duì)NK-92細(xì)胞的功能和殺傷效果有著深遠(yuǎn)的影響，其中細(xì)胞因子在這一過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色。IL-2是NK-92細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的關(guān)鍵細(xì)胞因子。NK-92細(xì)胞對(duì)IL-2存在嚴(yán)格的依賴性，培養(yǎng)液中缺少IL-2會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受阻甚至死亡。IL-2與NK-92細(xì)胞表面的IL-2受體結(jié)合后，能夠激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路。它可以激活JAK-STAT信號(hào)通路，使STAT3和STAT5等轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，進(jìn)入細(xì)胞核后調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。IL-2還能激活PI3K-Akt信號(hào)通路，增強(qiáng)細(xì)胞的代謝活性，為細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。在細(xì)胞毒性方面，IL-2可以上調(diào)NK-92細(xì)胞表面的穿孔素和顆粒酶等殺傷相關(guān)分子的表達(dá)，增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。研究表明，在低至10U/mL的IL-2劑量下，NK-92細(xì)胞仍能維持一定的增殖能力，但為了保證細(xì)胞的良好生長(zhǎng)狀態(tài)和殺傷活性，通常將IL-2的濃度控制在100-200U/mL。IL-15也是一種對(duì)NK-92細(xì)胞具有重要作用的細(xì)胞因子。IL-15與IL-2在結(jié)構(gòu)和功能上有一定的相似性，但也存在差異。IL-15可以促進(jìn)NK-92細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制與IL-2有所不同。IL-15與NK-92細(xì)胞表面的IL-15受體結(jié)合后，通過(guò)激活JAK1和JAK3激酶，進(jìn)而激活STAT5等轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1等基因的表達(dá)，使細(xì)胞加速?gòu)腉1期進(jìn)入S期，實(shí)現(xiàn)增殖。IL-15還能增強(qiáng)NK-92細(xì)胞的細(xì)胞毒性。它可以上調(diào)NK-92細(xì)胞表面的NKG2D等活化性受體的表達(dá)，增強(qiáng)NK-92細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力。研究發(fā)現(xiàn)，IL-15刺激后的NK-92細(xì)胞對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系的殺傷率明顯提高。IL-15還能促進(jìn)NK-92細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，如IFN-γ和TNF-α等，這些細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用。IL-2和IL-15聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)NK-92細(xì)胞的作用更為顯著。在細(xì)胞增殖方面，二者聯(lián)合能夠協(xié)同促進(jìn)NK-92細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞數(shù)量快速增加。這是因?yàn)樗鼈兛梢酝ㄟ^(guò)不同的信號(hào)通路激活細(xì)胞內(nèi)的增殖相關(guān)基因，相互補(bǔ)充，共同發(fā)揮作用。在細(xì)胞毒性方面，聯(lián)合使用IL-2和IL-15可以增強(qiáng)NK-92細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。它們可以上調(diào)更多的殺傷相關(guān)分子的表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞因子的分泌，提高NK-92細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力，從而更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。除了細(xì)胞因子，活化方式也對(duì)NK-92細(xì)胞的功能和殺傷效果產(chǎn)生影響。常用的活化方式包括與飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)和使用細(xì)胞因子刺激。與飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)是一種有效的活化方式。飼養(yǎng)細(xì)胞通常是經(jīng)過(guò)處理的、失去增殖能力但仍能分泌細(xì)胞因子和提供細(xì)胞間相互作用的細(xì)胞，如經(jīng)照射處理的K562細(xì)胞。K562細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子，如IL-1、IL-6等，這些細(xì)胞因子能夠刺激NK-92細(xì)胞的活化和增殖。K562細(xì)胞與NK-92細(xì)胞之間的細(xì)胞間相互作用也很重要，通過(guò)細(xì)胞表面分子的相互識(shí)別和結(jié)合，如NK-92細(xì)胞表面的CD2和K562細(xì)胞表面的CD58之間的相互作用，可以激活NK-92細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促進(jìn)其活化。研究表明，與K562飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)后的NK-92細(xì)胞，其細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子分泌能力均有明顯提高。使用細(xì)胞因子刺激作為活化方式時(shí)，除了前面提到的IL-2和IL-15，其他細(xì)胞因子如IL-12和IL-18也常被用于NK-92細(xì)胞的活化。IL-12可以增強(qiáng)NK-92細(xì)胞的細(xì)胞毒性和IFN-γ分泌能力。它通過(guò)與NK-92細(xì)胞表面的IL-12受體結(jié)合，激活Tyk2和Jak2激酶，進(jìn)而激活STAT4轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)IFN-γ等細(xì)胞因子的表達(dá)，增強(qiáng)NK-92細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)和殺傷功能。IL-18與IL-12聯(lián)合使用時(shí)，能夠協(xié)同增強(qiáng)NK-92細(xì)胞的細(xì)胞毒性和IFN-γ分泌。IL-18可以激活NK-92細(xì)胞內(nèi)的NF-κB等信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞毒性的增強(qiáng)。不同的活化方式對(duì)NK-92細(xì)胞的功能和殺傷效果存在差異，在實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)具體需求選擇合適的活化方式，以獲得最佳的治療效果。6.3腫瘤微環(huán)境因素腫瘤微環(huán)境（TME）是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，包含多種細(xì)胞類型、細(xì)胞外基質(zhì)以及各種細(xì)胞因子、趨化因子等信號(hào)分子，它對(duì)基因修飾的NK-92細(xì)胞的殺傷作用有著多方面的影響。免疫抑制細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中廣泛存在，對(duì)NK-92細(xì)胞的功能產(chǎn)生抑制作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）是其中一類重要的免疫抑制細(xì)胞。Tregs表面表達(dá)叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3（Foxp3），這是其標(biāo)志性的轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控Tregs的發(fā)育和功能。Tregs可以通過(guò)多種機(jī)制抑制NK-92細(xì)胞的活性。它可以分泌抑制性細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）。IL-10能夠抑制NK-92細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子分泌，降低其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。研究表明，在含有IL-10的環(huán)境中，NK-92細(xì)胞的IFN-γ分泌水平明顯下降，對(duì)erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的殺傷率也顯著降低。TGF-β則可以抑制NK-92細(xì)胞表面活化性受體的表達(dá)，如NKG2D等，使NK-92細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力減弱。Tregs還可以通過(guò)細(xì)胞間的直接接觸，抑制NK-92細(xì)胞的活性。Tregs表面的程序性死亡配體1（PD-L1）與NK-92細(xì)胞表面的程序性死亡受體1（PD-1）結(jié)合，激活NK-92細(xì)胞內(nèi)的抑制性信號(hào)通路，導(dǎo)致NK-92細(xì)胞的功能受到抑制。髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）也是腫瘤微環(huán)境中的重要免疫抑制細(xì)胞。MDSCs是一群異質(zhì)性的細(xì)胞群體，主要包括粒細(xì)胞樣MDSCs（G-MDSCs）和單核細(xì)胞樣MDSCs（M-MDSCs）。MDSCs可以通過(guò)多種途徑抑制NK-92細(xì)胞的功能。MDSCs能夠消耗腫瘤微環(huán)境中的精氨酸，精氨酸是NK-92細(xì)胞增殖和功能發(fā)揮所必需的氨基酸。精氨酸的缺乏會(huì)導(dǎo)致NK-92細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（TCR）ζ鏈表達(dá)下調(diào)，影響NK-92細(xì)胞的活化和殺傷功能。MDSCs還可以分泌活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）等物質(zhì)，這些物質(zhì)可以直接損傷NK-92細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞器，導(dǎo)致細(xì)胞功能受損。研究發(fā)現(xiàn)，MDSCs分泌的ROS能夠降低NK-92細(xì)胞內(nèi)的線粒體膜電位，影響細(xì)胞的能量代謝，從而抑制NK-92細(xì)胞的殺傷活性。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）同樣在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮免疫抑制作用。TAMs根據(jù)其功能和表型可以分為M1型和M2型。M1型巨噬細(xì)胞具有抗腫瘤活性，能夠分泌促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等，增強(qiáng)NK-92細(xì)胞的功能。在腫瘤微環(huán)境中，TAMs主要以M2型為主。M2型巨噬細(xì)胞可以分泌多種抑制性細(xì)胞因子，如IL-10、TGF-β等，抑制NK-92細(xì)胞的活性。M2型巨噬細(xì)胞還可以通過(guò)表面的CD47分子與NK-92細(xì)胞表面的信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α（SIRPα）結(jié)合，發(fā)出“別吃我”信號(hào)，抑制NK-92細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬和殺傷作用。細(xì)胞因子在腫瘤微環(huán)境中構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，對(duì)NK-92細(xì)胞的殺傷作用產(chǎn)生重要影響。IL-10是一種重要的抑制性細(xì)胞因子。在腫瘤微環(huán)境中，IL-10主要由Tregs、MDSCs和M2型巨噬細(xì)胞等免疫抑制細(xì)胞分泌。IL-10可以抑制NK-92細(xì)胞的增殖，使NK-92細(xì)胞的數(shù)量減少。它通過(guò)與NK-92細(xì)胞表面的IL-10受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使NK-92細(xì)胞停滯在G0/G1期，無(wú)法進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成和細(xì)胞分裂。IL-10還能抑制NK-92細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α等，降低其免疫調(diào)節(jié)和殺傷功能。研究表明，在IL-10存在的情況下，NK-92細(xì)胞對(duì)erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的殺傷率明顯降低，且細(xì)胞因子分泌水平顯著下降。TGF-β是另一種在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要抑制作用的細(xì)胞因子。TGF-β可以抑制NK-92細(xì)胞的活化，使NK-92細(xì)胞無(wú)法有效識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。它通過(guò)與NK-92細(xì)胞表面的TGF-β受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的Smad信號(hào)通路，抑制NK-92細(xì)胞表面活化性受體的表達(dá)，如NKG2D、NKp30等。TGF-β還可以抑制NK-92細(xì)胞的細(xì)胞毒性分子表達(dá)，如穿孔素和顆粒酶等，降低NK-92細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。研究發(fā)現(xiàn)，在TGF-β處理后的NK-92細(xì)胞中，穿孔素和顆粒酶的mRNA表達(dá)水平明顯降低，對(duì)erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的殺傷活性顯著減弱。腫瘤微環(huán)境中的促炎細(xì)胞因子也會(huì)對(duì)NK-92細(xì)胞產(chǎn)生影響。IFN-γ是一種重要的促炎細(xì)胞因子。在腫瘤微環(huán)境中，IFN-γ可以由NK-92細(xì)胞自身分泌，也可以由其他免疫細(xì)胞如T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌。IFN-γ可以激活NK-92細(xì)胞，增強(qiáng)其殺傷活性。它可以上調(diào)NK-92細(xì)胞表面的活化性受體表達(dá)，促進(jìn)NK-92細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子分泌。IFN-γ還可以增強(qiáng)NK-92細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞表面的分子表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞更容易被NK-92細(xì)胞識(shí)別和攻擊。TNF-α也是一種促炎細(xì)胞因子，它可以直接作用于腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。TNF-α還可以激活NK-92細(xì)胞，增強(qiáng)其細(xì)胞毒性。它可以通過(guò)與NK-92細(xì)胞表面的TNF-α受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促進(jìn)NK-92細(xì)胞釋放穿孔素和顆粒酶等細(xì)胞毒性分子，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。缺氧是腫瘤微環(huán)境的一個(gè)重要特征，對(duì)NK-92細(xì)胞的功能和殺傷作用產(chǎn)生負(fù)面影響。在腫瘤組織中，由于腫瘤細(xì)胞的快速增殖和血管生成異常，導(dǎo)致局部氧氣供應(yīng)不足，形成缺氧微環(huán)境。缺氧會(huì)抑制NK-92細(xì)胞的增殖，使NK-92細(xì)胞的數(shù)量難以增加。這是因?yàn)槿毖鯐?huì)影響NK-92細(xì)胞內(nèi)的能量代謝，導(dǎo)致細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)異常，使細(xì)胞停滯在G0/G1期。研究表明，在缺氧條件下，NK-92細(xì)胞內(nèi)的線粒體功能受損，ATP生成減少，影響細(xì)胞的正常代謝和增殖。缺氧還會(huì)降低NK-92細(xì)胞的細(xì)胞毒性。缺氧會(huì)導(dǎo)致NK-92細(xì)胞表面的活化性受體表達(dá)下調(diào)，如NKG2D等，使NK-92細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別能力減弱。缺氧會(huì)抑制NK-92細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞毒性分子合成和釋放，如穿孔素和顆粒酶等。研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，NK-92細(xì)胞內(nèi)穿孔素和顆粒酶的mRNA表達(dá)水平明顯降低，蛋白質(zhì)合成減少，對(duì)erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的殺傷活性顯著下降。缺氧還會(huì)影響NK-92細(xì)胞的遷移能力，使其難以到達(dá)腫瘤部位發(fā)揮殺傷作用。缺氧會(huì)導(dǎo)致NK-92細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架蛋白發(fā)生改變，影響細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力。在缺氧條件下，NK-92細(xì)胞的偽足形成減少，細(xì)胞的遷移速度明顯減慢，難以穿過(guò)腫瘤組織中的細(xì)胞外基質(zhì)和血管壁，到達(dá)腫瘤細(xì)胞周圍發(fā)揮殺傷作用。七、研究總結(jié)與展望7.1研究成果總結(jié)本研究圍繞基因修飾的NK-92細(xì)胞對(duì)erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的特異性殺傷展開(kāi)，取得了一系列具有重要意義的成果。在基因修飾方面，成功構(gòu)建了針對(duì)erbB2的重組嵌合受體真核表達(dá)載體pCMMP-anti-erbB2scFv-CD28-ξ。通過(guò)精心設(shè)計(jì)和優(yōu)化，利用DNA合成技術(shù)合成了anti-erbB2scFv-CD28-ξ全基因，并將其準(zhǔn)確地克隆到真核表達(dá)載體pCMMP中。經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選、菌落PCR和測(cè)序等嚴(yán)格