按照ICH程序，本指導(dǎo)原則由相應(yīng)的ICH專家工作組制定，iICH三方協(xié)調(diào)指導(dǎo)原則 2 2.3標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合的調(diào)整 9 4.1檢測(cè)染色體損傷的體內(nèi)試驗(yàn) 4.3體內(nèi)試驗(yàn)的劑量選擇 4.3.3對(duì)具有血液或骨髓毒性化合物的檢測(cè) 4.4對(duì)于體內(nèi)試驗(yàn)陰性結(jié)果的靶組織暴露 4.6分析的動(dòng)物樣本數(shù) 4.7體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)嚙齒類動(dòng)物雄性/雌性的 4.9體內(nèi)試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照的使用 1則本指導(dǎo)原則為ICHS2A和S2B指導(dǎo)原則的替代和合并。原則描述了對(duì)遺傳毒性標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合中的體外試驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果的追加試驗(yàn)和分析（包括對(duì)不相關(guān)發(fā)現(xiàn)的評(píng)本指導(dǎo)原則已考慮了最新的經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）指導(dǎo)原則中的建議和國(guó)際遺傳毒性試驗(yàn)專家組（IWGT）的報(bào)告中的相關(guān)內(nèi)容。在一些情況下，與OECD或IWGT建議存在一些差異，本指導(dǎo)原則對(duì)這些差異進(jìn)行了闡述。本指導(dǎo)原則的下述內(nèi)容應(yīng)與其他ICH指導(dǎo)原則結(jié)合使本指導(dǎo)原則主要適用于新的“小分子”藥物，不適用于生2物制品。ICHM3（R2）中提供了與臨床開(kāi)發(fā)進(jìn)程相關(guān)的試遺傳毒性試驗(yàn)可定義為用于檢測(cè)通過(guò)不同機(jī)制誘導(dǎo)遺傳性損傷的化合物的體外和體內(nèi)試驗(yàn)。這些試驗(yàn)?zāi)軐?duì)DNA這些類別損傷的試驗(yàn)中呈陽(yáng)性的化合物為潛在的人類致癌3（2）還應(yīng)以哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外和/或體內(nèi)試驗(yàn)評(píng)價(jià)遺傳傳毒性試驗(yàn)一起使用時(shí)，這幾個(gè)試驗(yàn)可互換。試驗(yàn)組合中包含了體內(nèi)試驗(yàn)，是因?yàn)橐恍┧幬镌隗w內(nèi)4檢測(cè)中期相細(xì)胞染色體畸變的體外和體內(nèi)試驗(yàn)可檢測(cè)認(rèn)為是足夠合理，且證實(shí)受試物有暴露（見(jiàn)4.4節(jié)通常被5選擇一（2）一項(xiàng)染色體損傷的細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(yàn)（體外中期相染色體畸變?cè)囼?yàn)或體外微核試驗(yàn)或一項(xiàng)體外小鼠淋巴瘤（3）一項(xiàng)體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)，通常為采用嚙齒類造血（2）采用兩種不同組織進(jìn)行的體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)，通的試驗(yàn)是肝DNA鏈斷裂試驗(yàn)，除非其他試驗(yàn)證6有一些體內(nèi)試驗(yàn)可用作試驗(yàn)組合選擇二中的第二項(xiàng)體從體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)和體外或體內(nèi)微核試驗(yàn)中可7建議采用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合并不意味著其他遺傳毒性試驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)組合中的一項(xiàng)或多項(xiàng)試驗(yàn)可能由于技術(shù)原因而82.3.3具有遺傳毒性警示結(jié)構(gòu)的化標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合通?？蓹z出有警示結(jié)構(gòu)的化合物（注釋5因?yàn)榇蟛糠帧熬窘Y(jié)構(gòu)”被定義為與細(xì)菌誘變性有關(guān)。已知少數(shù)化學(xué)類別在哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體損傷試驗(yàn)中比在細(xì)對(duì)有些化合物，很多體內(nèi)試驗(yàn)（尤其是骨髓、外周血、9內(nèi)體細(xì)胞遺傳毒性試驗(yàn)的陰性結(jié)果通常提示對(duì)生殖細(xì)胞無(wú)試驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性是包含有新方法或得到非預(yù)期結(jié)果的當(dāng)不受溶解度或細(xì)胞毒性限制時(shí)，推薦最高濃度為制，應(yīng)對(duì)產(chǎn)生沉淀的濃度進(jìn)行計(jì)數(shù)，且最高濃度不超過(guò)何，應(yīng)按如下所述的根據(jù)細(xì)胞毒性來(lái)確定最高濃度。建議，Moore等（2006）也給出了對(duì)MLA結(jié)果分析的建議，薦的最高濃度是1mM或0.5mg/ml（選擇其中較低者注釋在檢測(cè)中期相染色體畸變或微核的體外細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(yàn)中，最高濃度產(chǎn)生的細(xì)胞毒性應(yīng)不超過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)減少約為80~90%，通過(guò)RTG（相對(duì)總生長(zhǎng)率）在20~10%之間來(lái)測(cè)和陰性對(duì)照情況下進(jìn)行試驗(yàn)。受試物應(yīng)給藥處理3~6小時(shí)，應(yīng)進(jìn)行無(wú)代謝活化條件下持續(xù)給藥約1.5個(gè)正常細(xì)胞周期的況下進(jìn)行試驗(yàn)，受試物應(yīng)給藥處理3~4小時(shí)。在有和無(wú)活化要出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果就應(yīng)進(jìn)行并包括出現(xiàn)最高突變率的培養(yǎng)基，進(jìn)行突變集落大小的測(cè)定。4.對(duì)體內(nèi)試驗(yàn)的建議4.1檢測(cè)染色體損傷的體內(nèi)試驗(yàn)采用骨髓細(xì)胞分析染色體畸變或檢測(cè)含微核的嗜多染種屬的骨髓或外周血上已顯示對(duì)檢測(cè)斷裂劑/非整倍體誘導(dǎo)數(shù)OECD，1997；Hayashi等，2000；2007）。染色體畸變也可通過(guò)給藥的嚙齒類動(dòng)物的外周淋巴細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)進(jìn)4.2其他體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)用作追加試驗(yàn)以在評(píng)價(jià)體外或體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果時(shí)提高證據(jù)權(quán)法在大部分組織上檢測(cè)染色體畸變或內(nèi)源基因的基因突變第二種體內(nèi)試驗(yàn)經(jīng)常以評(píng)價(jià)DNA損傷為終點(diǎn)指標(biāo)來(lái)作為替的試驗(yàn)包括：DNA鏈斷裂試驗(yàn)如單細(xì)胞凝膠電），4.3體內(nèi)試驗(yàn)的劑量選擇4.3.1短期試驗(yàn)對(duì)于短期試驗(yàn)（通常是給藥1~3次），遺傳毒性試驗(yàn)推薦的最高劑量是：限度劑量2000mg/kg（若可耐受），或最等，2003）和轉(zhuǎn)基因突變?cè)囼?yàn)（Heddle等，2000）。劑量選標(biāo)準(zhǔn)組合選擇一該重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)符合支持進(jìn)行人體臨床試驗(yàn)的一個(gè)充分試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)，則通常認(rèn)為對(duì)于遺傳毒性評(píng)價(jià)劑量是合適的；這與OECD指導(dǎo)原則關(guān)于體內(nèi)微核試驗(yàn)的劑量選擇標(biāo)準(zhǔn)即足以證明該高劑量可用于微核分析或其他遺），理-化學(xué)特性（如果在該溶媒中的MFD與急性給藥試驗(yàn)可達(dá)（4）高劑量≥急性給藥試驗(yàn)所采用高劑量的50%，4.3.3對(duì)具有血液或骨髓毒性化合物的檢測(cè)可誘導(dǎo)非整倍體的許多化合物，如強(qiáng)的紡錘體抑制劑，僅在接近毒性劑量的狹窄劑量范圍內(nèi)可被骨髓或血的體內(nèi)示對(duì)紅細(xì)胞系有嚴(yán)重毒性（如明顯的嗜多染紅細(xì)胞（PCE）），高劑量之下、間距不超過(guò)約2倍。如果一個(gè)多周給藥的重復(fù)誘導(dǎo)劑和某些毒性斷裂劑的附加資料可來(lái)源于以下任何一早期采血樣（在第3~4天）。例如，當(dāng)在多周給藥試驗(yàn)（如早期采樣可為檢測(cè)到斷裂劑或潛在的非整倍體誘導(dǎo)劑提供4.4對(duì)于體內(nèi)試驗(yàn)陰性結(jié)果的靶組織暴露試驗(yàn)結(jié)果的價(jià)值與確定受試物在靶組織中有充分暴露直接體內(nèi)暴露的評(píng)估應(yīng)采用與遺傳毒性試驗(yàn)相同的動(dòng)物種體內(nèi)暴露應(yīng)采用以下任何一種方法進(jìn)行證明：采樣時(shí)間點(diǎn)，所用組織（骨髓或外周血）中未成熟紅細(xì)胞占紅細(xì)胞總數(shù)的比例發(fā)生顯著變化來(lái)獲得；或通過(guò)染b.其他體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)：應(yīng)評(píng)價(jià)肝臟或組織的毒性，如通過(guò)組織病理學(xué)檢查或血液生化學(xué)毒性指標(biāo)來(lái)評(píng)注性良好的組織，血液或血漿中藥物相關(guān)物質(zhì)的水平通常與骨髓中觀察到的水平相似。無(wú)論何種給藥途徑，對(duì)如果全身暴露與預(yù)期的臨床暴露相似或更低，可能需采用替代的方法，如：①采用不同的給藥途徑；②采用具有更高暴露的不同種屬；③采用不同的組織或試驗(yàn)（參見(jiàn)2.3.4節(jié)“采用體內(nèi)試驗(yàn)的局限性”）。4.5體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)的采樣時(shí)間體內(nèi)微核（MN）、染色體畸變和UDS試驗(yàn)的采樣時(shí)間原則上，只要最高劑量/暴露是足夠的，任何給藥期限4.6分析的動(dòng)物樣本數(shù)分析的動(dòng)物樣本數(shù)根據(jù)微核試驗(yàn)（OECD）或其他遺傳4.7體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)嚙齒類動(dòng)物雄性/雌性的若檢測(cè)性別特異性藥物，試驗(yàn)可在相應(yīng)性別中進(jìn)行。急資料提示在所用動(dòng)物種屬上存在有毒理學(xué)意義的性別差異4.8給藥途徑4.9體內(nèi)試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照的使用項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)中的陽(yáng)性結(jié)果并不總是意味著受試物對(duì)人雖然體外試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果可提示藥物內(nèi)在的遺傳毒性特輕微增加，但是在該試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的合適的歷史背景數(shù)據(jù)范圍（2）弱/可疑的陽(yáng)性結(jié)果不可重現(xiàn)。若以上任一情況應(yīng)用證據(jù)權(quán)重分析提示其不具有潛在由于Ames試驗(yàn)的陽(yáng)性結(jié)果被認(rèn)為提示了DNA反應(yīng)性，有一些菌落的人為升高而非真正的回復(fù)突變的典型例），突變?cè)囼?yàn)陽(yáng)性結(jié)果不能提示在人體內(nèi)具有遺傳毒性潛力的性試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果時(shí)的證據(jù)權(quán)重評(píng)估和追加試驗(yàn)的建議。另（2）陽(yáng)性結(jié)果僅發(fā)生于產(chǎn)生高細(xì)胞毒性的濃度?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)或已知代謝特征提示標(biāo)準(zhǔn)的體外代謝活化方體內(nèi)試驗(yàn)方法具有考慮到與人體應(yīng)用時(shí)可能相關(guān)的吸體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)也具有給出誤導(dǎo)性假陽(yáng)性結(jié)果的可（2）DNA加合物數(shù)據(jù)應(yīng)根據(jù)內(nèi)源性加合物的已知背景外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果建議進(jìn)行追加試驗(yàn)以提供試（1）有助于對(duì)缺乏生物學(xué)相關(guān)性的遺傳毒性提供證據(jù)染色體畸變或突變的受試物不是DNA損傷性物質(zhì)的證據(jù)（如，除Ames試驗(yàn)之外的其他突變/DNA損傷試驗(yàn)結(jié)果為陰），生活化氧簇，等等Galloway等，1998；Scott等，1991；Muller和Kasper，2000）。類似的試驗(yàn)也可用作體外微核試能提示細(xì)胞周期紊亂；多倍體也常常與細(xì)胞毒性的升高有?？商峁┤狈Ψ钦扼w誘導(dǎo)潛力的充分證據(jù)。如果上述機(jī)制信息和證據(jù)權(quán)重分析支持不具有相關(guān)的如果證據(jù)權(quán)重不充分或無(wú)充分的機(jī)制信息以排除相關(guān)），染色體畸變?cè)囼?yàn)可能更為合適。如果懷疑一個(gè)“真正”的微核），總之，化合物遺傳毒性潛力的評(píng)價(jià)應(yīng)綜合考慮所有結(jié)（2）盡管只有少數(shù)但仍有相當(dāng)數(shù)量的遺傳毒性致癌劑類。Tweats等（2007，II）描述了來(lái)自于公司調(diào)查中的其他以及循環(huán)系統(tǒng)中的含微核紅細(xì)胞不會(huì)被脾臟清除的動(dòng)物種細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)小鼠連續(xù)給藥約4周或更長(zhǎng)時(shí)間時(shí)也可采中可檢測(cè)到由一系列斷裂劑和非整倍體劑誘導(dǎo)的微核微核分析，只要所用方法學(xué)可確保能分析新生網(wǎng)織紅細(xì)胞的最小樣本量大小以保證測(cè)定誤差保持在低于動(dòng)物之間的變異水平。2007；Hotchkiss等，2008（4）雖然標(biāo)準(zhǔn)組合的兩種選擇同等適合，個(gè)別受試物（5）某些具有遺傳毒性警示結(jié)構(gòu)的分子實(shí)體被認(rèn)為與采用特殊的方案調(diào)整/附加試驗(yàn)對(duì)遺傳毒性的優(yōu)化檢測(cè)非常（6）采用皮膚和結(jié)腸進(jìn)行誘導(dǎo)微核的體內(nèi)試驗(yàn)已有一（7）一些化合物采用平板摻入法或預(yù)培養(yǎng)法均可很容差異（Gatehouse等，1994）。制藥工業(yè)界的經(jīng)驗(yàn)是采用兩（8）體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)最高濃度為1mM的理由包該組合優(yōu)化了遺傳毒性致癌劑的檢測(cè)而不僅僅依賴于任何（9）雖然一些遺傳毒性致癌劑在體外遺傳毒性試驗(yàn)中即可被檢測(cè)到（Greenwood等，2004）。隨著細(xì)胞毒性的升細(xì)胞毒性相關(guān)而非遺傳毒性的“陽(yáng)性”結(jié)果。此種繼發(fā)于非在細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(yàn)中，即使已知是致癌劑的弱的斷裂劑，在細(xì)胞計(jì)數(shù)減少不超過(guò)50%時(shí)也得到陽(yáng)性結(jié)果。另一方長(zhǎng)的經(jīng)時(shí)性改變[通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)過(guò)程中的相對(duì)于對(duì)照的細(xì)胞方法可低估毒性。對(duì)于淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，增殖抑制不超過(guò)50%應(yīng)用細(xì)胞松弛素B以允許核分裂而非細(xì)胞分裂來(lái)達(dá)到，使可長(zhǎng)的經(jīng)時(shí)性改變（PDKirsch-Volders等，2003）。兩種方法，將最高劑量設(shè)為相對(duì)總生長(zhǎng)率（RTG）接近20%（10~20%）的濃度，均可達(dá)到合適的靈敏度（Moore等，中僅在低于20%RTG濃度時(shí)得到陽(yáng)性結(jié)果，同時(shí)為嚙齒類動(dòng)于低于20%RTG的情況下進(jìn)行結(jié)果分析時(shí)需謹(jǐn)慎，而且，如果突變升高僅見(jiàn)于≤10%RTG時(shí)，該結(jié)果可能不被認(rèn)為是陽(yáng)初步的范圍探索試驗(yàn)是有益的，但是，在遺傳毒了準(zhǔn)確達(dá)到細(xì)胞生長(zhǎng)減少50%或RTG減少80%而進(jìn)行大量試水平50%的方法，結(jié)果顯示，非突變劑或非致癌劑得到陽(yáng)性物后的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的培養(yǎng)淋巴細(xì)胞檢測(cè)中期相染色體畸變是采用一種對(duì)藥物和/或其代謝物具有良好暴露的組織來(lái)確證大的DNA加合物或Ames試驗(yàn)為陽(yáng)性結(jié)果的化合物。由于細(xì)時(shí)，如在部分肝切除術(shù)后，或在年輕大鼠上（Hayashi等，），用）、應(yīng)激、體溫偏低或體溫過(guò)高所致（由Tweats等回顧性（注意：雖然強(qiáng)微管毒劑諸如秋水仙堿和長(zhǎng)春堿不會(huì)產(chǎn)生100%著絲點(diǎn)陽(yáng)性的微核，但典型的超過(guò)70%~80%，而在風(fēng)并缺乏II相解毒能力，除非添加特異性的輔助因子。而且，在體外測(cè)試底物濃度高時(shí)可發(fā)生非特異的活化作用（參見(jiàn)Kirkland等，2007）。采用人S9或其他人類相關(guān)的活化系統(tǒng)堿基置換（Basesubstitution核苷酸序列中單個(gè)或多）：（測(cè)定在過(guò)濾器中的移動(dòng)速率或通過(guò)單細(xì)胞凝膠電泳或DNA斷裂短片段從細(xì)胞核中遷移出形成“彗尾”）來(lái)檢測(cè)。插入或缺失一個(gè)或兩個(gè)相鄰堿基的一種突變（遺傳密碼改遺傳毒性（Genotoxicity泛指各種機(jī)制導(dǎo)致發(fā)生的任含有整條染色體、或有著絲?；驘o(wú)著絲粒的染色體斷裂片）：）：群體倍增或培養(yǎng)生長(zhǎng)（Populationdoublingrowth其可采用不同的方法來(lái)計(jì)算；一個(gè)合適的公式的例子是：群體倍增(PDs)=最終計(jì)數(shù)（N）除以初始（基線））：），單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)（SinglecellgelElectrophoresis）：轉(zhuǎn)基因（Transgene）：將外源性或外來(lái)基因?qū)胫了轪nd55differenthumancarcinogenexposures.MutatRPfuhlerSetal.ECVAMRetrospectiveValidationoftheinvitromicronucleustest(MNT).Mutagenesis2008;23:271-283.MatsushimaTetal.ReportfromtheworkinggrfGoodman&Gilman.Thepharmacologicalbasisoftherapeutics.York:McGraw-HillProfessional20chromosomalaberrationsthatreducesirrelevantpositiveresults.EnvironMolMutagen2004;43:36etal.Evaluationoftherodentreatmentprotocol:summthecollaborativestudygroupforthe(CSGMT)/EnvironmentalMutagenSociety(JEMS)-MammalianMutagenicityStudyGroup(MMS).EnvironMolMutagen2001;37:93-11BurlinsonB,ClayPetal.RecommendationsinvivoalkalineCometassay.Mutagenesis2003;18:45-51.HayashiM,MacGregorJT,GatehouseDertingerSDetal.Invivorodenterythrocytemicronuscoring.EnvironMolMutagen2000;35:234-52.HayashiM,MacGregorJT,GateDertingerSD,Abramsson-ZetterbergLetal.Imicronucleusassay.III.Validationandregulatoryacceptanceofautomatedscoringandtheuseofratperipheralbloodreticulocytes,withdiscussionofnon-hematopoieticandasingledose-levellimittest.MutatRes2007;627:10-30.HeddleJA,DeanS,NohmiT,MolMutagen2000;35:253-9.MM,MacGregorJT.FlowcytometricanalysisofmicronucleiinperipheralbloodreticulocytesIV:anindexofchromosomalKasperP,UnoY,MautheR,AsanoN,DouglasG,Mattetal.Follow-uptestingofrodentcarcinogensnotpositiveinthestandardgenotoxicityteMutatRes2007;627:106-11KenellyJC,WatersR,AshbyJ,LefevrePA,BurlinsonB,MutagenicityTests,UKEMSRecommendedProcedures.undertakinginvitrogenotoxicitytestingandthusavoidunnecessaryfollow-upanimaltests:reportoftheECVAMworkshop.MutatRes2007;628:31-55.Kirsch-VoldersM,Sofumicronucleusassaywork2003;540:153-63.KisslingGE,DertingerSD,HayashiSensitivityoftheerythrocytemicronucleusassay:MutatRes2007;627:59-MacGregorJT,BishopME,McNameeJP,HayashiM,AsanoN,WakataAetal.FlowCytometricanalyperipheralbloodreticulocytes:II.monitoringchromosomaldamageintherat.ToxicolSci2006;94:92-107.kinaselocusgenemutationassay:workshopongenotoxicitytestprocedures-NewOrleans,Louisiana,April2000.EnvironMolMutagen2002;40:292-9.mutationassay:follow-upmeetingoftheinternationalworkshopongenotoxicitytesting-Aberdeen,Scotland,2003-Assayacceptancecriteria,positivecontrols,anddataevaluation.EnvironMolMutagen2006;47:1-5.MüllerL,KasperP.Human