實驗四動物細(xì)胞培養(yǎng)基的配置和原代培養(yǎng)一實驗項目簡介1、實驗學(xué)時6學(xué)時2實驗過程：A動物細(xì)胞培養(yǎng)液的配置B采用組織培養(yǎng)法培養(yǎng)魚類細(xì)胞二、實驗原理原代細(xì)胞培養(yǎng)是指直接從動物體內(nèi)獲取的細(xì)胞、組織或器官，經(jīng)體外培養(yǎng)后，直到第一次傳代為止。這種培養(yǎng)，首先用無菌操作的方法，從動物體內(nèi)取出所需的組織(或器官)，經(jīng)消化，分散為單個游離的細(xì)胞，在人工培養(yǎng)下，使其不斷的地生長及繁殖。細(xì)胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒灱夹g(shù)。三、實驗?zāi)康?、掌握動物細(xì)胞培養(yǎng)緩沖液、消化液的配置。2掌握動物細(xì)胞原代培養(yǎng)的基本過程。四、實驗試劑DMEM培養(yǎng)基胰蛋白酶Hanks緩沖液抗生素溶液牛血清70%乙醇去離子水五、實驗用品器材：解剖剪、解剖鑷、培養(yǎng)皿、量筒、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、培養(yǎng)瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均須徹底清洗、烤干、包裝好，六、實驗步驟培養(yǎng)液的配置1、DMEM培養(yǎng)液的配置：將1袋袋裝的干粉溶解于1L去離子水中，加3.7gNaHCO3,溶解，調(diào)節(jié)PH7.2,過濾除菌，4℃保存。2、雙抗溶液的配置：將青霉素、鏈霉素溶解于生理鹽水中，至青霉素最終濃度為100U/mL。六、實驗步驟3、D-Hanks緩沖溶液：稱取8gNaCl，0.4gKCl,0.06gNa2HPO4,0.06gKH2PO4,0.35gNaHCO3溶解于1000mL去離子水中，高壓滅菌，4℃保存。六、實驗步驟魚類細(xì)胞的組織培養(yǎng)法1．取材：迅速處死動物，無菌分離肝臟,置D-Hanks液中,沖洗肝臟至灰白色。六、實驗步驟2.接種、培養(yǎng)：將肝臟剪成1mm×1mm×1mm的組織塊,用D-Hanks液洗3次,去掉血細(xì)胞,37℃下用0.25%的胰蛋白酶消化10min,倒掉消化液后用D-Hanks液洗2次,培養(yǎng)液洗2次,將肝組織塊貼壁于組織培養(yǎng)瓶中,每個培養(yǎng)瓶放組織塊20～25塊。加少許培養(yǎng)液,將培養(yǎng)瓶倒轉(zhuǎn)置于培養(yǎng)箱中,在37℃條件下培養(yǎng),2h后補充培養(yǎng)液,并翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。六、實驗步驟3．觀察置于37℃培養(yǎng)的細(xì)胞．需逐日進(jìn)行觀察．主要觀察：(1)培養(yǎng)物是否被污染，如培養(yǎng)液變?yōu)辄S色且混濁，表示該瓶被污染。(2)細(xì)胞生長狀況與培養(yǎng)液顏色的變化，如培養(yǎng)液變?yōu)樽霞t色，一般細(xì)胞生長不好。可能是瓶塞未蓋緊或營養(yǎng)液pH過高。六、實驗步驟待細(xì)胞已基本長成致密單層時，此時即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)了。七、注意事項

細(xì)胞培養(yǎng)要求無菌操作。無菌是細(xì)胞培養(yǎng)成功的首要條件。重視進(jìn)人無菌室操作前必須將培養(yǎng)瓶外表消毒提防試劑瓶中的液體浸濕瓶蓋,這往往是試驗污染的重要因素之一。八魚類細(xì)胞原代培養(yǎng)意義魚類培養(yǎng)細(xì)胞作實驗驗對象，有著活體魚無法比擬的優(yōu)點：(I)成本低，細(xì)胞系的維護(hù)不需要大型的養(yǎng)殖設(shè)備和大量的換水與換氣。(2)重復(fù)性好，實驗條件可以精確控制。因此，對魚類細(xì)胞系進(jìn)行深入研究，無論在理論研究方面，還是在實際應(yīng)用方面，都具有深遠(yuǎn)意義。八魚類細(xì)胞原代培養(yǎng)意義在對細(xì)胞的營養(yǎng)需求有比較深人認(rèn)識的基礎(chǔ)上,化學(xué)成分明確的無蛋白培養(yǎng)基已被用于中國倉鼠卵巢細(xì)胞匯和雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)。雖然魚類細(xì)胞