酶工程--蛋白酶第一頁，共26頁。目錄2應(yīng)用結(jié)構(gòu)與功能來源與分類143

概況與展望第二頁，共26頁。認(rèn)識蛋白酶基本信息：中文名稱:蛋白酶(枯草桿菌)英文名稱:bacillopeptidasebCASNO.:9014-01-1（CAS登錄號）EINECS:232-752-2（EINECS登錄號）中文別名:蛋白酶A.S1398;枯草溶菌素；蛋白酶2709;蛋白酶A.S1398;解朊酶;舒替蘭酶;蛋白酶,得自地衣芽孢桿菌

中文別名:蛋白酶A.S1398;枯草溶菌素；蛋白酶2709;蛋白酶A.S1398;解朊酶;舒替蘭酶;蛋白酶,得自地衣芽孢桿菌第三頁，共26頁。01定義

是指能水解肽鏈中肽鍵的一類酶的總稱。凡是能水解蛋白質(zhì)的酶,在剛合成時都沒有活性,被稱為酶原.以無活性形式合成酶有利于酶的貯存及在機體內(nèi)的輸送、轉(zhuǎn)移。這種無活性的酶原可以通過自催化反應(yīng)或通過金屬離子進(jìn)行活化。蛋白酶第四頁，共26頁。02來源蛋白質(zhì)主要來源于高等植物的種子和果實，動物的內(nèi)臟和腺體，以及某些微生物如酵母、霉菌和桿菌等。植物動物微生物目前已商品化的酶制劑中第五頁，共26頁。作用位點來源最適PH活性中心03分類

①內(nèi)肽酶：切開蛋白質(zhì)分子內(nèi)部肽鍵-CO-NH-，生成分子質(zhì)量較小的多肽類，這類酶一般叫做類肽酶。②外肽酶：切開蛋白質(zhì)或多肽分子氨基或羧基末端的肽鍵，產(chǎn)生游離氨基酸。這類酶叫做外肽酶。作用于氨基端的叫氨肽酶；作用于羧基端的叫羧肽酶。③水解蛋白質(zhì)或多肽的酯鍵：④水解蛋白質(zhì)或多肽的酰氨鍵：第六頁，共26頁。作用位點來源最適PH活性中心03分類①植物蛋白酶。②動物蛋白酶。③微生物蛋白酶。第七頁，共26頁。作用位點來源最適PH活性中心03分類①酸性蛋白酶，最適酸性蛋白酶是指蛋白酶具有較低的最適pH，而不是指酸性基團存在于酶的活性部位，酸性蛋白酶的最適PH從2左右(胃蛋白酶)到4左右。從酶的活力-PH曲線分析，在酶的活性部位中含有一個或更多的羧基。這一類蛋白酶中研究最徹底的是胃蛋白酶。②中性蛋白酶，pH7-8中性蛋白酶是由枯草芽孢桿菌經(jīng)發(fā)酵提取而得的，屬于一種內(nèi)切酶，可用于各種蛋白質(zhì)水解處理。在一定溫度、PH值下，本品能將大分子蛋白質(zhì)水解為氨基酸等產(chǎn)物?？蓮V泛應(yīng)用于動植物蛋白的水解，制取生產(chǎn)高級調(diào)味品和食品營養(yǎng)強化劑的HAP和HVP，此外還可用于皮革脫毛、軟化、羊毛絲綢脫膠等加工。③堿性蛋白酶，又稱絲氨酸蛋白酶。常見的有兩種,一為Novo蛋白酶,另一為Carsberg蛋白酶,兩者的性質(zhì)和構(gòu)造相近,分別含275和274個氨基酸殘基,由一條多肽鏈構(gòu)成。在pH6～10下穩(wěn)定,低于6或大于11時很快失活。其活性中心含絲氨酸,故稱絲氨酸蛋白酶。它不但能水解肽鍵,還具有水解酰胺鍵、酯鍵以及轉(zhuǎn)酯和轉(zhuǎn)肽的功能。由于酶的專一性，它只能對蛋白質(zhì)水解，不能作用于淀粉、脂肪等物質(zhì)。外觀一般呈粉末狀，也有部分呈微球狀。第八頁，共26頁。作用位點來源最適PH活性中心根據(jù)國際生物化學(xué)酶學(xué)委員會建議，除特殊的外肽酶外，所有蛋白酶均納入肽類水解酶中（其編號為）根據(jù)活性中心及其抑制劑Classification第九頁，共26頁。蛋白酶結(jié)構(gòu)雖然蛋白酶在長期的進(jìn)化過程中，其分子結(jié)構(gòu)、大小、功能等差別很大，但各家族蛋白酶仍然保持了一個高度保守的結(jié)構(gòu)域，擁有較高的序列相似性。絲氨酸蛋白酶是一類以絲氨酸為活性中心的重要蛋白水解。絲氨酸蛋白酶在結(jié)構(gòu)上為全β蛋白，其核心結(jié)構(gòu)由C端和N端結(jié)構(gòu)域組成，其中C結(jié)構(gòu)域執(zhí)行催化功能，C端結(jié)構(gòu)域含有兩個十分重要的保守二硫鍵且包含了絕大部分的功能位點，而N結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)與C結(jié)構(gòu)域相配合，共同維持催化中心三聯(lián)體的構(gòu)象穩(wěn)定性和催化活性。第十頁，共26頁。巰基蛋白酶是一類活性中心含有巰基（半胱氨酸），并且依靠巰基催化水解肽鍵的蛋白水解酶。巰基蛋白酶家族以木瓜蛋白酶研究的最為詳盡，其酶前體中己形成大小相當(dāng)?shù)?個結(jié)構(gòu)域，這2個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的裂隙底部是催化位點。

天冬氨酸蛋白酶一類活性中心含有兩個催化性天冬氨酸殘基的蛋白水解酶。天冬氨酸蛋白酶多擁有以C2為對稱軸的兩個雙葉型三級結(jié)構(gòu)，而且在N一和C一末端發(fā)現(xiàn)幾乎相同的鏈纏繞，雙重對稱的兩個功能域具有高度的相似性，即使在小葉內(nèi)部，其多肽鏈折疊亦具有雙重對稱性。木瓜蛋白酶第十一頁，共26頁。金屬蛋白酶是活性中心含有金屬離子的一類蛋白水解酶。金屬蛋白酶成員均含有一個穩(wěn)定的基本結(jié)構(gòu)域：N端疏水信號肽、前肽區(qū)、催化活性區(qū)。尤其在催化活性區(qū)含1個或2個金屬離子，以Zn2+最多，這是金屬蛋白酶與上述三類蛋白酶最大的不同，多數(shù)動物的基質(zhì)金屬蛋白酶中還含有C端的血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域。前肽區(qū)與催化活性區(qū)中的鋅原子相互協(xié)調(diào)，共同維持酶分子的功能穩(wěn)定性，而血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域主要起調(diào)節(jié)酶活性和底物專一性的作用。第十二頁，共26頁。蛋白酶的功能一方面蛋白酶可以在外部直接抑制病原微生物的生長并幫助清除炎癥環(huán)境下的蛋白質(zhì)和壞死組織等細(xì)菌滋生的營養(yǎng)基礎(chǔ);另一方面,蛋白酶可從體內(nèi)降解清除血栓、致炎多肽和纖維蛋白,降低血清粘稠度,并能增強巨噬細(xì)胞的吞噬作用,還能間接激活酶原和產(chǎn)生消炎肽。蛋白酶還可作為消化助劑和膳食補充劑使用。蛋白酶不僅可以降解食物,同時在物質(zhì)吸收過程中發(fā)揮重要作用。如蛋白酶能夠幫助消化蛋白類食物,使其分解為多肽和氨基酸然后通過腸道被人體吸收。其中大部分用作養(yǎng)分,而一小部分特殊多肽具有調(diào)節(jié)機能,叫功能性多肽如大豆肽。絲氨酸蛋白酶是一類以絲氨酸為活性中心的重要的蛋白水解酶，在生物有機體中起著重要而廣泛的生理作用，它們通過對蛋白酶原的激活或抑制而起調(diào)節(jié)因子作用。絲氨酸蛋白酶還在胚胎發(fā)育、組織重建、細(xì)胞分化、血管形成和病原侵入等過程中發(fā)揮著重要的作用第十三頁，共26頁。天冬氨酸蛋白酶的主要功能是降解蛋白、抗原和促進(jìn)其他酶的活化等。除此之外，該家族不同的蛋白酶間還具有一些不同的分子特性，如哺乳動物中的胃蛋白酶主要與食物消化有關(guān)，腎素能調(diào)節(jié)血壓水平，過量表達(dá)的組織蛋白酶D酶原能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，而組織蛋白酶E卻能抑制腫瘤細(xì)胞的生長；植物中天冬氨酸蛋白酶還存在特有的促進(jìn)蛋白裂解的序列。

基質(zhì)金屬蛋白酶在降解細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞生長、促進(jìn)新生血管形成方面有著一定的作用，并且能廣泛參與人體生理病理過程,還存在特有的促進(jìn)蛋白裂解的序列

巰基蛋白酶參與蛋白質(zhì)代謝、組織生長和分化、抗原產(chǎn)生等過程。許多病理過程如發(fā)炎、肌肉營養(yǎng)不良、自身免疫疾病、腫瘤等都與巰基蛋白酶有關(guān)。第十四頁，共26頁。蛋白酶的應(yīng)用1234蛋白酶在明膠工業(yè)中的作用蛋白酶在皮革及皮毛處理中的應(yīng)用蛋白酶在絲綢脫膠中的應(yīng)用56蛋白酶在食品工業(yè)上的應(yīng)用蛋白酶在酒精、釀酒和釀造醋生產(chǎn)中的應(yīng)用蛋白酶在洗滌劑中的應(yīng)用第十五頁，共26頁。蛋白酶在洗滌劑中的應(yīng)用蛋白酶中作為洗滌劑的添加劑主要堿性蛋白酶為主，全世界堿性蛋白酶占總蛋白酶銷量的25%左右。而在這些堿性蛋白酶中又以細(xì)菌細(xì)菌堿性蛋白酶為主在bre6is芽孢桿菌中分離得到的噬堿性蛋白酶于各種洗滌劑存在的條件下在PH8~11這樣的一個范圍內(nèi)酶活都能保持在80%以上，在20°C~70°C都能保持一定的酶活性，且60°C為最適溫度。這樣的一種酶無疑是適合作為洗滌劑添加劑的。蛋白酶還可以用來清潔隱形眼鏡。一種在芽孢桿菌(Bacillussp.158)中分離得到的中性蛋白酶其能在PH6~7，溫度30°C~40°C擁有較高的活性和穩(wěn)定性[3]，可以用來除去隱形眼鏡上的蛋白質(zhì)來增加眼鏡的透光率第十六頁，共26頁。蛋白酶在皮革及皮毛處理中的應(yīng)用傳統(tǒng)的皮革脫毛技術(shù)是利用主要是用硫化鈉使生皮上的毛和表皮的硬角蛋白在堿液中水解，破壞雙硫鍵，削弱毛和表皮對真皮的依附，達(dá)到脫毛的目的。傳統(tǒng)方法處理時纖維間質(zhì)也被部分除去，使膠原纖維得到分離。而且脫毛廢液中產(chǎn)生大量有害的硫化物和廢水、廢氣，嚴(yán)重的污染了環(huán)境，且脫毛時間長，膠原蛋白損失大，易造成革的粒面破壞，革空松，毛不能完全去除等問題。脫毛時可分解毛皮與表皮間連接的類粘蛋白,使膠原纖維松散,使鞣制后的皮革柔軟。利用蛋白酶來進(jìn)行脫毛則沒有以上問題。蛋白酶不作用膠原,而只能水解角蛋白、彈性蛋白和球蛋白等雜質(zhì),在浸水時可促進(jìn)皮子吸水。第十七頁，共26頁。蛋白酶在明膠工業(yè)中的應(yīng)用傳統(tǒng)工藝制造明膠周期長,出膠率低,污水量多明膠工業(yè)傳統(tǒng)上是用動物皮、骨為原料,先用石灰水長時間(1～3個月)的浸泡,使之脫脂和去除蛋白,然后再在高溫(70～90℃)煮熬,使膠原轉(zhuǎn)化成明膠利用蛋白酶消化膠原之外的雜蛋白,然后將膠原洗凈后直接加熱抽膠,可節(jié)省工藝時間并提高明膠質(zhì)量,減少污水。第十八頁，共26頁。蛋白酶在絲綢脫膠中的應(yīng)用絲綢的脫膠歷來是用堿皂法煮煉的,但此法易損傷絲質(zhì)而影響產(chǎn)品質(zhì)量。生絲因含絲膠(是一種蛋白質(zhì),在蠶絲中含量20%～30%,柞蠶絲中約含6%,其間還夾雜尿酸鈣)必須加以脫除才能具有柔軟的手感和特有的絲鳴現(xiàn)象。利用蛋白酶消化膠原之外的雜蛋白,然后將膠原洗凈后直接加熱抽膠,可節(jié)省工藝時間并提高明膠質(zhì)量,減少污水。第十九頁，共26頁。蛋白酶在食品工業(yè)上的應(yīng)用制干酪肉類嫩化蛋白質(zhì)水解調(diào)味液功能性低聚肽和阿斯巴甜的合成第二十頁，共26頁。蛋白酶在酒精、釀酒和釀造醋生產(chǎn)中的應(yīng)用蛋白酶用于谷物原料的酒精發(fā)酵,可分解谷物蛋白質(zhì),增加酵母營養(yǎng)而促進(jìn)酵母生長和發(fā)酵向玉米原料酒精發(fā)酵醪添加酸性蛋白酶,發(fā)酵周期可縮短1/3,原料出酒率提高10%～20%蛋白酶用于谷物原料的酒精發(fā)酵有助于縮短發(fā)酵時間,提高原料出酒率酸性蛋白酶用于白酒生產(chǎn),除出酒率得以提高,發(fā)酵時間縮短外,還有助于白酒香味物質(zhì)的形成,并可降低白酒中雜醇油含量。第二十一頁，共26頁。part4概況

1956以來，我國陸續(xù)選育了一批優(yōu)良產(chǎn)酶菌種，其中包括:中性蛋白酶生產(chǎn)菌枯草桿菌1.398,S114,172,放線菌166，棲土曲霉3.942；

堿性蛋白酶生產(chǎn)菌地衣芽孢桿菌2709，短小芽孢桿菌289，209；酸性蛋白酶生產(chǎn)菌黑曲霉3.350，宇佐美曲霉537，肉桂色曲霉No.81，漿油工業(yè)用的米曲霉3042。美國曾規(guī)定，用在食品和藥物的蛋白酶生產(chǎn)菌種都需經(jīng)食品和藥物管理局批準(zhǔn)，并嚴(yán)格限制在枯草桿菌，黑曲霉，米曲霉三種菌的菌株。第二十二頁，共26頁。概況

微生物酸性蛋白酶國外從20世紀(jì)oo年代就開始研制,而我國1970年上海工業(yè)微生物研究所首先從黑曲霉中篩選一株3.350產(chǎn)酸性蛋白酶菌株,并和上海酒精廠協(xié)作進(jìn)行中試生產(chǎn),填補了我國酸性蛋白酶制劑的空白。part4

中性蛋白酶作用條件溫和,可應(yīng)用于食品、制藥、化妝品和絲紡行業(yè),但由于其熱穩(wěn)定性差,生產(chǎn)與使用條件復(fù)雜限制了它的應(yīng)用范圍。高溫中性蛋白酶具有良好的熱穩(wěn)定性,彌補了一般中性蛋白酶的不足,生產(chǎn)和使用條件簡單,因而有廣闊的應(yīng)用前景。所以自二十世紀(jì)七十年代至今,研究和生產(chǎn)高溫中性蛋白酶成為酶學(xué)領(lǐng)域研究的熱點之于一。第二十三頁，共26頁。概況

part4

美國也曾有過規(guī)定，用在食品和藥物的蛋白酶生產(chǎn)菌種都需經(jīng)食品和藥物管理局批準(zhǔn)，并嚴(yán)格限制在枯草桿菌，黑曲霉，米曲霉三種菌的菌株。

早在1945年瑞士Dr.Jaag等發(fā)現(xiàn)微生物堿性蛋白酶便開創(chuàng)了堿性蛋白酶應(yīng)用的新紀(jì)元,在我國,60年代末選育出產(chǎn)堿性蛋白酶的2709菌并于1971年投產(chǎn),目前,它已成為研究比較深入的一種酶類,同時也是酶制劑工業(yè)的主要產(chǎn)品。第二十四頁，共26頁。展望

已報道的蛋白酶的種類估計已超過900種，蛋白酶與人類密切相關(guān)，涉及到我們生活的各個方面。我國的酶制劑工業(yè)已具備一定的規(guī)模和水平，有力地促進(jìn)了相關(guān)行業(yè)的發(fā)展，但總體來說與國際先進(jìn)水平還是有很大差距。技術(shù)不夠成