新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術(shù)指南中國疾病預(yù)防控制中心病毒病所應(yīng)急技術(shù)中心目錄1.

2.3.概論病原學流行病學臨床表現(xiàn)檢測、治療4.檢測技術(shù)儲備核酸檢測病毒的分離血清學檢測2019-nCoV的實驗室檢測技術(shù)儲備√√為指導(dǎo)各級疾控部門和其他相關(guān)機構(gòu)開展2019新型冠狀病毒的實驗室檢測工作，特制定本技術(shù)指南。本指南主要介紹目前已經(jīng)比較成熟、易于實施的核酸檢測方法。新型冠狀病毒實時熒光定量RT-PCR檢測技術(shù)參考標準新型冠狀病毒實驗室生物安全指南（第二版）

新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術(shù)指南（第三版）標本采集對象新型冠狀病毒感染疑似病例、疑似聚集性病例患者；其他需要進行新型冠狀病毒感染診斷或鑒別診斷者；或其他需要進一步篩查檢測的環(huán)境或生物材料（如溯源分析）。標本采集要求1.從事新型冠狀病毒檢測標本采集的技術(shù)人員應(yīng)經(jīng)過生物安全培訓（培訓合格）和具備相應(yīng)的實驗技能。在標本采集過程中，采樣人員著PPE。2.住院病例的標本由所在醫(yī)院醫(yī)護人員或當?shù)丶部貦C構(gòu)專業(yè)人員采集。3.密切接觸者標本由當?shù)丶部貦C構(gòu)負責采集。4.根據(jù)實驗室檢測工作的需要，可結(jié)合病程及研究需求多次采樣。采集標本種類和要求每個病例必須采集呼吸道標本；重癥病例優(yōu)先采集下呼吸道標本（如支氣管或肺泡灌洗液等），出現(xiàn)眼部感染癥狀的病例，需采集眼結(jié)膜拭子標本；出現(xiàn)腹瀉癥狀的病例，需留取便標本。1．上呼吸道標本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物。2．下呼吸道標本：包括呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液。3．血清標本：應(yīng)盡量采集急性期血清和恢復(fù)期血清標本，建議使用真空采血管。4．眼結(jié)膜標本：出現(xiàn)眼部感染癥狀的病例需采集眼結(jié)膜拭子標本。5．便標本：出現(xiàn)腹瀉癥狀的患者需采集便標本。標本的包裝標本采集后在生物安全二級實驗室生物安全柜內(nèi)分裝。1．所有標本應(yīng)放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有墊圈、耐冷凍的樣本采集管里，擰緊。容器外注明樣本編號、種類、姓名及采樣日期。2．將密閉后的標本放入大小合適的塑料袋內(nèi)密封，每袋裝一份標本。標本的保存用于病毒分離和核酸檢測的標本應(yīng)盡快進行檢測，24小時內(nèi)能檢測的標本可置于4℃保存；24小時內(nèi)無法檢測的標本則應(yīng)置于-70℃或以下保存（如無-70℃保存條件，則于-20℃冰箱暫存）。血清可在4℃存放3天，可在-20℃以下長期保存。標本運送期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。上送標本各?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）首例檢測結(jié)果陽性，或疑似聚集性病例或聚集性病例的標本，上送中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所進行檢測復(fù)核，并附樣本送檢單（見附件）。新型冠狀病毒毒株或其他潛在感染性生物材料的運輸包裝分類屬于A類，對應(yīng)的聯(lián)合國編號為UN2814，包裝符合國際民航組織文件Doc9284《危險品航空安全運輸技術(shù)細則》的PI602分類包裝要求；環(huán)境樣本屬于B類，對應(yīng)的聯(lián)合國編號為UN3373，包裝符合國際民航組織文件Doc9284《危險品航空安全運輸技術(shù)細則》的PI650分類包裝要求；通過其他交通工具運輸?shù)目蓞⒄找陨蠘藴拾b。新型冠狀病毒毒株或其他潛在感染性材料運輸應(yīng)按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規(guī)定》（原衛(wèi)生部令第45號）辦理《準運證書》。標本運輸

新型冠狀病毒感染實驗室檢測方法新型冠狀病毒的實驗室檢測靶標在實驗室要確認一個病例為陽性，滿足以下條件：同一份標本中新型冠狀病毒2個靶標（orf1ab、N）特異性rRT-PCR檢測結(jié)果為陽性。靶標一（orf1ab）:正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA熒光探針（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'靶標二（N）:正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG熒光探針（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'分子檢測引物與探針熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果判斷陰性:無Ct值或Ct為40。陽性：Ct值<37，可報告為陽性。Ct值在37-40之間，建議重復(fù)實驗，若重做結(jié)果Ct值<40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。√√√√中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所建立了高特異性、高靈敏度的核酸檢測體系A(chǔ)BCD

新型冠狀病毒生物安全實驗活動要求根據(jù)目前掌握的新型冠狀病毒的生物學性狀、傳播特性、致病性、臨床資料等信息，考慮到新型冠狀病毒感染聚集性發(fā)病且有重癥病例，并有死亡病例的特點，屬于病原微生物危害程度分類中第二類病原微生物。

病原生物安全實驗活動要求（一）病毒的培養(yǎng)：指病毒的分離、培養(yǎng)、滴定、中和試驗、活病毒及其蛋白純化、病毒凍干以及產(chǎn)生活病毒的重組實驗等操作。上述操作應(yīng)當在生物安全三級實驗室的生物安全柜內(nèi)進行。使用病毒培養(yǎng)物提取核酸，裂解劑或滅活劑的加入必須在與病毒培養(yǎng)等同級別的實驗室和防護條件下進行，裂解劑或滅活劑加入后可比照未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的防護等級進行操作。實驗室開展相關(guān)活動前，應(yīng)當報經(jīng)國家衛(wèi)生健康委批準，取得開展相應(yīng)活動的資質(zhì)。

（二）動物感染實驗指以活病毒感染動物、感染動物取樣、感染性樣本處理和檢測、感染動物特殊檢查、感染動物排泄物處理等實驗操作，應(yīng)當在生物安全三級實驗室的生物安全柜內(nèi)操作。實驗室開展相關(guān)活動前，應(yīng)當報經(jīng)國家衛(wèi)生健康委批準，取得開展相應(yīng)活動的資質(zhì)。（三）未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作指未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料在采用可靠的方法滅活前進行的病毒抗原檢測、血清學檢測、核酸提取、生化分析，以及臨床樣本的滅活等操作，應(yīng)當在生物安全二級實驗室進行，同時采用生物安全三級實驗室的個人防護。

（四）滅活材料的操作感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后進行的核酸檢測、抗原檢測、血清學檢測、生化分析等操作應(yīng)當在生物安全二級實驗室進行。分子克隆等不含致病性活病毒的其他操作，可以在生物安全一級實驗室進行。中國CDC病毒病所實驗室檢測技術(shù)儲備和前期工作已建立新型冠狀病毒的核酸rRT-PCR檢測方法；測定新型冠狀病毒的基因組序列；分離獲得新型冠狀病毒毒株；撰寫并上報《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術(shù)指南》?！蚣芫唧w內(nèi)容第二版第三版一、標本采集(二)標本采集要求個人防護措施的具體化1、N95防護口罩、護目鏡、防護服、乳膠手套、防水靴套；如果接觸了患者血液、體液、分泌物或排泄物，應(yīng)及時更換手套。

1、增加了“個人防護裝備（personalprotectiveequipment，PPE）要求：N95及以上防護口罩、護目鏡、連體防護服、雙層乳膠手套、防水靴套；如果直接接觸了患者血液、體液、分泌物或排泄物時，應(yīng)及時更換外層乳膠手套。”（三）標本采集種類表述的細化和內(nèi)容調(diào)整，刪除“肺組織活檢標本”，增加“眼結(jié)膜標本、便標本”，修訂血清標本的詳細情況1．上呼吸道標本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、深咳痰液。2．下呼吸道標本：包括呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、肺組織活檢標本。4.血清標本：盡量釆集急性期、恢復(fù)期雙份血清。第一份血清應(yīng)盡早（最好在發(fā)病后7天內(nèi)）釆集，第二份血清應(yīng)在發(fā)病后第3～4周釆集。采集量5ml,以空腹血為佳，建議使用真空釆血管。1．上呼吸道標本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物。2．下呼吸道標本：包括深咳痰液、呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液。4．血清標本：盡量釆集急性期、恢復(fù)期雙份血清。第一份血清應(yīng)盡早（最好在發(fā)病后7天內(nèi)）釆集，第二份血清應(yīng)在發(fā)病后第3～4周釆集。采集量5ml，建議使用無抗凝劑的真空釆血管。血清標本主要用于抗體的測定，從血清抗體水平對病例的感染狀況進行確認。血清標本不進行核酸檢測。4．眼結(jié)膜標本：出現(xiàn)眼部感染癥狀的病例需采集眼結(jié)膜拭子標本。5．便標本：出現(xiàn)腹瀉癥狀的患者需采集便標本。（四）標本采集方法表述的細化和規(guī)范化，標本類型變化同上一條1、采樣液2、螺口塑料管3、肺組織活檢標本4、無1、病毒保存液（也可使用等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液）2、無菌螺口塑料管3、刪除4、增加“9．糞便標本：如果發(fā)病早期存在腹瀉癥狀，則留取糞便標本3-5ml；10．眼結(jié)膜拭子標本：眼結(jié)膜表面用拭子輕輕擦拭后，將拭子頭進入采樣管中，尾部棄去，懸緊管蓋。其它材料：依據(jù)設(shè)計需求規(guī)范采集?！保吮颈４姹硎稣{(diào)整可在-20℃以下可長期保存。標本運送期間應(yīng)避免反復(fù)凍融，并應(yīng)設(shè)立專庫或?qū)９駟为毐４鏄吮尽?20℃以下可長期保存。應(yīng)設(shè)立專庫或?qū)９駟为毐４鏄吮?。標本運送期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。（七）標本送檢增加短途運輸內(nèi)容，表述標本采集后應(yīng)盡快送往實驗室，如果需要長途運輸標本，建議采用干冰等制冷方式進行保藏。標本采集后應(yīng)盡快送往實驗室，如果需要長途運輸標本，建議采用干冰等制冷方式進行保藏；在短途運輸中，則可由普通冰袋保持低溫。二、2019新型冠狀病毒的實驗室檢測表述調(diào)整和規(guī)范化1、RT-PCR2、同一份標本中新型冠狀病毒2個靶標（ORF1ab、N）特異性實時熒光RT-PCR檢測結(jié)果均為陽性。陰性結(jié)果也不能排除新型冠狀病毒感染，需要排除可能產(chǎn)生假陰性的因素1、實時反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（real-timereversetranscriptionpolymerasechainreaction，rRT-PCR）2、同一份標本中2019新型冠狀病毒2個靶標（ORF1ab、N）特異性rRT-PCR檢測結(jié)果均為陽性。如果出一陰一陽的檢測結(jié)果，則需要重新采樣，重新檢測。（五）檢測項目表述調(diào)整和規(guī)范化1、可疑3、無1、灰度區(qū)2、新增“注：如使用的是商品化試劑盒，則以廠家所提供的說明書為準?！彼摹⒉≡锇踩珜嶒灮顒右螅ㄒ唬┎《九囵B(yǎng)表述調(diào)整指病毒的分離、培養(yǎng)、滴定、中和試驗、活病毒及其蛋白純化、病毒凍干以及產(chǎn)生活病毒的重組實驗等操作。上述操作應(yīng)當在生物安全三級實驗室內(nèi)進行。使用病毒培養(yǎng)物提取核酸，裂解劑或滅活劑的加入必須在與病毒培養(yǎng)同級別的實驗室和防護條件下進行，裂解劑或滅活劑加入后可比照未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的防護等級進行操作。實驗室開展相關(guān)活動前，應(yīng)當報經(jīng)國家衛(wèi)生健康委批準，取得開展相應(yīng)活動的資質(zhì)。

指病毒的分離、培養(yǎng)、滴定、中和試驗、活病毒及其蛋白純化、病毒凍干以及產(chǎn)生活病毒的重組實驗等操作。上述操作應(yīng)當在生物安全三級實驗室的生物安全柜內(nèi)進行。使用病毒培養(yǎng)物提取核酸，裂解劑或滅活劑的加入必須在與病毒培養(yǎng)等同級別的實驗室和防護條件下進行，裂解劑或滅活劑加入后可比照未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的防護等級進行操作。實驗室開展相關(guān)活動前，應(yīng)當報經(jīng)國家衛(wèi)生健康委批準，取得開展相應(yīng)活動的資質(zhì)。（二）動物感染實驗表述調(diào)整指以活病毒感染動物的實驗。應(yīng)在具有開展相應(yīng)活動資質(zhì)的動物（animal）BSL-3（ABSL-3）實驗室進行操作。

指以活病毒感染動物、感染動物取樣、感染性樣本處理和檢測、感染動物特殊檢查、感染動物排泄物處理等實驗操作，應(yīng)當在生物安全三級實驗室的生物安全柜內(nèi)操作。實驗室開展相關(guān)活動前，應(yīng)當報經(jīng)國家衛(wèi)生健康委批準，取得開展相應(yīng)活動的資質(zhì)。（三）未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作表述調(diào)整應(yīng)在生物安全二級實驗室操作，但個人防護裝備參照生物安全三級實驗室的防護要求。指未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料在采用可靠的方法滅活前進行的病毒抗原檢測、血清學檢測、核酸提取、生化分析，以及臨床樣本的滅活等操作，