EV71類病毒顆粒的表達(dá)與免疫原性：基于桿狀病毒系統(tǒng)的深入剖析一、引言1.1研究背景與意義手足口?。℉and,footandmouthdisease,HFMD）是一種由多種腸道病毒引起的常見傳染病，主要影響嬰幼兒和兒童。近年來，手足口病在亞太地區(qū)的發(fā)病率呈上升趨勢，嚴(yán)重危害了嬰幼兒的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的數(shù)據(jù)，每年有大量兒童感染手足口病，其中部分患者會發(fā)展為重癥病例，出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)性并發(fā)癥，如病毒性腦膜炎、腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等，甚至導(dǎo)致死亡。這些并發(fā)癥不僅給患者帶來了巨大的痛苦，也給家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。腸道病毒71型（Enterovirus71,EV71）是手足口病最重要的病原體之一，與其他腸道病毒相比，EV71感染更容易導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床癥狀和并發(fā)癥。柯薩奇A16型（CoxsackiesA16,CA16）也在手足口病中占有一定比例，目前EV71和CA16是我國近幾年流行的兩種重要病原體。由EV71感染引起的手足口病，臨床表現(xiàn)為手足口部位出現(xiàn)皮疹或皰疹、潰瘍等，在嬰幼兒中常會伴有嚴(yán)重的神經(jīng)性并發(fā)癥，包括病毒性腦膜炎、腦炎以及脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹，這些并發(fā)癥引起的肺水腫、肺出血常導(dǎo)致嬰幼兒死亡。目前，針對手足口病，尤其是由EV71感染引起的重癥病例，尚無特效抗病毒藥物。臨床上主要采取對癥治療和支持治療，以緩解癥狀、預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生，但治療效果有限。因此，開發(fā)安全有效的疫苗成為預(yù)防和控制手足口病流行的最有效手段之一。在新型疫苗中，亞單位疫苗以類病毒顆粒（Virus-likeParticles,VLPs）較為理想。類病毒顆粒是由病毒外殼蛋白組成的空殼結(jié)構(gòu)，在構(gòu)象上最接近天然病毒顆粒，具有較好的免疫原性。由于其不含病毒基因組，不會引發(fā)感染和致病風(fēng)險，安全性較高。這些優(yōu)點(diǎn)使得類病毒顆粒疫苗成為基因工程疫苗研究的熱點(diǎn)。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（BaculovirusExpressionSystem,BES）是一個以昆蟲桿狀病毒為外源基因載體，以昆蟲細(xì)胞為受體的真核表達(dá)體系。該系統(tǒng)具有可以容納大片段外源基因進(jìn)行表達(dá)的優(yōu)勢，能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜蛋白的正確折疊和修飾，在疫苗研究中具有獨(dú)特的優(yōu)勢。由于是在真核系統(tǒng)中表達(dá)，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)被認(rèn)為是表達(dá)類病毒顆粒的最佳表達(dá)系統(tǒng)之一。本研究旨在利用流行地區(qū)分離到的EV71毒株，應(yīng)用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)EV71類病毒顆粒，并對其免疫原性進(jìn)行初步評價。通過本研究，期望獲得具有良好免疫原性的EV71類病毒顆粒，為EV71新型疫苗的研發(fā)提供依據(jù)和參考，為手足口病的預(yù)防和控制提供新的策略和方法。1.2EV71概述腸道病毒71型（Enterovirus71,EV71）屬于小RNA病毒科（Picornaviridae）腸道病毒屬（Enterovirus），是一種單股正鏈RNA病毒。其病毒粒子呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，無包膜，直徑約為24-30nm。病毒基因組全長約7.4kb，由5’非編碼區(qū)（5’UTR）、開放閱讀框（ORF）和3’非編碼區(qū)（3’UTR）組成。5’UTR包含內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES），在病毒翻譯起始過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用；ORF編碼一個多聚蛋白，該多聚蛋白在病毒蛋白酶的作用下，裂解為結(jié)構(gòu)蛋白VP1-VP4和非結(jié)構(gòu)蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。其中，VP1、VP2和VP3暴露在病毒粒子表面，含有多個抗原表位，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原；VP4位于病毒粒子內(nèi)部，與病毒基因組緊密結(jié)合，在病毒感染過程中參與病毒的脫殼和基因組的釋放。EV71的致病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及病毒與宿主細(xì)胞的相互作用、免疫反應(yīng)的激活以及炎癥介質(zhì)的釋放等多個環(huán)節(jié)。當(dāng)EV71侵入人體后，首先通過與宿主細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，如P選擇素糖蛋白配體-1（PSGL-1）、清道夫受體B2（SCARB2）等，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和傳播。病毒在細(xì)胞內(nèi)大量增殖，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡，釋放出的病毒粒子進(jìn)一步感染周圍細(xì)胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)。同時，EV71感染還會激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些炎癥介質(zhì)的過度表達(dá)會導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，引起組織損傷和器官功能障礙，進(jìn)而引發(fā)一系列嚴(yán)重的臨床癥狀和并發(fā)癥。在全球范圍內(nèi)，EV71引起的手足口病疫情時有發(fā)生，尤其是在亞太地區(qū)，發(fā)病率一直居高不下。自1969年首次在美國加利福尼亞州被分離鑒定以來，EV71已在多個國家和地區(qū)引發(fā)大規(guī)模疫情。1997年，馬來西亞暴發(fā)了嚴(yán)重的EV71疫情，導(dǎo)致4-5歲以下兒童的病死率高達(dá)26%，神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的發(fā)生率也顯著增加。1998年，我國臺灣地區(qū)經(jīng)歷了一次大規(guī)模的EV71疫情，共有129106例手足口病病例，其中405例為重癥病例，78例死亡，疫情波及范圍廣，對當(dāng)?shù)貎和慕】翟斐闪藰O大的威脅。在中國大陸，手足口病于2008年被納入丙類傳染病管理，此后報告病例數(shù)持續(xù)上升。據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心的數(shù)據(jù)顯示，2008-2019年間，我國累計(jì)報告手足口病病例數(shù)超過1800萬例，其中重癥病例數(shù)超過16萬例，死亡病例數(shù)超過3500例。這些數(shù)據(jù)表明，EV71感染已成為亞太地區(qū)乃至全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)之一，對嬰幼兒的健康和生命安全構(gòu)成了巨大威脅。1.3類病毒顆粒（VLPs）類病毒顆粒（Virus-likeParticles,VLPs）是一種由病毒結(jié)構(gòu)蛋白自我組裝形成的納米級顆粒結(jié)構(gòu)，其形態(tài)和結(jié)構(gòu)與天然病毒顆粒高度相似，但不包含病毒的基因組，因此不具有感染性和致病性。VLPs的大小通常在20-200nm之間，呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，由病毒的衣殼蛋白或包膜蛋白組成。這些蛋白在合適的表達(dá)系統(tǒng)中能夠自發(fā)組裝成具有特定結(jié)構(gòu)和形態(tài)的顆粒，其表面展示的抗原表位與天然病毒粒子相似，能夠有效地模擬天然病毒的免疫原性。VLPs的結(jié)構(gòu)特性使其在疫苗研發(fā)領(lǐng)域具有顯著的優(yōu)勢。首先，由于VLPs在構(gòu)象上最接近天然病毒顆粒，能夠展示與天然病毒相似的抗原表位，因此可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，包括體液免疫和細(xì)胞免疫。在體液免疫方面，VLPs可以刺激B細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體，這些抗體能夠識別并結(jié)合病毒表面的抗原表位，從而中和病毒的活性，阻止病毒感染宿主細(xì)胞。例如，人乳頭瘤病毒（HPV）的VLPs疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的中和抗體，對HPV感染及HPV相關(guān)性宮頸上皮非典型增生起到有效的保護(hù)作用。在細(xì)胞免疫方面，VLPs可以被抗原呈遞細(xì)胞（APCs）攝取和加工，然后通過主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ類和Ⅱ類分子途徑將抗原肽呈遞給T細(xì)胞，激活T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。CD8+T細(xì)胞可以直接殺傷被病毒感染的細(xì)胞，而CD4+T細(xì)胞則可以分泌細(xì)胞因子，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體和激活其他免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。其次，VLPs不含病毒基因組，不會引發(fā)感染和致病風(fēng)險，安全性較高。與傳統(tǒng)的減毒活疫苗相比，VLPs疫苗不存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險，不會導(dǎo)致疫苗相關(guān)的疾病發(fā)生。與滅活疫苗相比，VLPs疫苗不需要經(jīng)過復(fù)雜的滅活處理過程，避免了因滅活不完全而導(dǎo)致的安全隱患。這使得VLPs疫苗在應(yīng)用過程中更加安全可靠，尤其適合用于兒童、老年人和免疫功能低下人群的預(yù)防接種。此外，VLPs的制備相對簡單，可以通過基因工程技術(shù)在多種表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行生產(chǎn)，如細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞等。不同的表達(dá)系統(tǒng)具有各自的特點(diǎn)和優(yōu)勢，可以根據(jù)需要選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)VLPs。例如，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜蛋白的正確折疊和修飾，適合表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的VLPs；酵母表達(dá)系統(tǒng)具有生長迅速、易于培養(yǎng)和成本較低的優(yōu)點(diǎn)，適合大規(guī)模生產(chǎn)VLPs。而且，VLPs的生產(chǎn)過程可以進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，保證產(chǎn)品的一致性和穩(wěn)定性。這些優(yōu)點(diǎn)使得類病毒顆粒疫苗成為基因工程疫苗研究的熱點(diǎn)。目前，已經(jīng)有多種基于VLPs的疫苗成功上市，如乙型肝炎病毒（HBV）疫苗、人乳頭瘤病毒（HPV）疫苗和戊型肝炎病毒（HEV）疫苗等。這些疫苗在預(yù)防相應(yīng)病毒感染方面取得了顯著的成效，為全球公共衛(wèi)生事業(yè)做出了重要貢獻(xiàn)。此外，還有許多針對其他病毒的VLPs疫苗正在進(jìn)行臨床前研究和臨床試驗(yàn)，如流感病毒、寨卡病毒、埃博拉病毒等。隨著研究的不斷深入和技術(shù)的不斷進(jìn)步，相信會有更多安全有效的VLPs疫苗問世，為人類預(yù)防和控制病毒感染性疾病提供更多的選擇和保障。1.4研究目的與內(nèi)容本研究旨在利用流行地區(qū)分離到的EV71毒株，應(yīng)用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)EV71類病毒顆粒，并對其免疫原性進(jìn)行初步評價，為EV71新型疫苗的研發(fā)提供依據(jù)和參考。具體研究內(nèi)容包括以下幾個方面：重組桿狀病毒的構(gòu)建：對科室構(gòu)建保存的攜帶EV71結(jié)構(gòu)蛋白基因P1與非結(jié)構(gòu)蛋白基因3CD的供體質(zhì)粒pFastBac-Dual-P1-3CD進(jìn)行雙酶切鑒定，確保基因序列的正確性和完整性。將鑒定正確的供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliDH10Bac中，與桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid進(jìn)行同源重組，通過藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定，篩選出含有目的基因的重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-P1-3CD。將重組桿粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞sf9細(xì)胞系，獲得攜帶EV71病毒結(jié)構(gòu)基因P1和3CD蛋白酶基因的重組桿狀病毒rBV-P1-3CD，并通過蝕斑的方法對重組桿狀病毒的滴度進(jìn)行測定，為后續(xù)的表達(dá)實(shí)驗(yàn)提供足夠數(shù)量和活性的病毒。EV71類病毒顆粒的表達(dá)與鑒定：采用免疫熒光技術(shù)，使用特異性抗體檢測重組病毒感染的sf9細(xì)胞中是否表達(dá)EV71結(jié)構(gòu)蛋白，確定蛋白的表達(dá)位置和表達(dá)量。通過WesternBlot分析，進(jìn)一步驗(yàn)證表達(dá)產(chǎn)物的特異性，檢測目的蛋白的分子量和表達(dá)水平，判斷P1基因是否被3CD酶正確切割。利用電鏡觀察表達(dá)產(chǎn)物的形態(tài)學(xué)特征，確定是否形成了類病毒顆粒，并觀察其大小、形態(tài)和結(jié)構(gòu)，與天然病毒顆粒進(jìn)行比較。EV71類病毒顆粒的純化：對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行蔗糖密度梯度離心純化，去除雜質(zhì)和未組裝的蛋白，獲得高純度的EV71類病毒顆粒。對純化后的目的蛋白進(jìn)行電鏡和WesternBlot鑒定，驗(yàn)證純化效果，確保獲得的類病毒顆粒具有良好的質(zhì)量和純度，為后續(xù)的免疫實(shí)驗(yàn)提供可靠的抗原。免疫原性評價：將純化后的EV71類病毒顆粒免疫BALB/c小鼠，定期采集小鼠血清。采用ELISA方法檢測小鼠血清中抗EV71特異性IgG抗體的水平，評估體液免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和持續(xù)時間。通過微量中和試驗(yàn)測定血清對EV71病毒的中和效價，確定抗體的中和活性，判斷類病毒顆粒能否誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)作用。通過以上研究內(nèi)容，本研究預(yù)期能夠成功構(gòu)建攜帶EV71病毒結(jié)構(gòu)基因P1和3CD蛋白酶基因的重組桿狀病毒，并在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)和組裝形成EV71類病毒顆粒。這些類病毒顆粒經(jīng)過純化后，能夠誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)小鼠產(chǎn)生特異性抗EV71抗體，具有較好的免疫原性，為EV71新型疫苗的研發(fā)提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)支持。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料供體質(zhì)粒：攜帶EV71結(jié)構(gòu)蛋白基因P1與非結(jié)構(gòu)蛋白基因3CD的供體質(zhì)粒pFastBac-Dual-P1-3CD，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。該供體質(zhì)粒的構(gòu)建基于流行地區(qū)分離到的EV71毒株，通過基因克隆技術(shù)將P1和3CD基因插入到pFastBac-Dual載體中，確保了基因序列的完整性和正確性。大腸桿菌菌株：E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，購自Invitrogen公司。該菌株用于重組桿狀病毒質(zhì)粒的構(gòu)建，其含有桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid和輔助質(zhì)粒，能夠在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組，將供體質(zhì)粒上的目的基因整合到Bacmid中。桿狀病毒質(zhì)粒：桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid，來源于Invitrogen公司的Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。Bacmid是一種穿梭載體，既能在大腸桿菌中復(fù)制，又能在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)外源基因。昆蟲細(xì)胞系：昆蟲細(xì)胞sf9細(xì)胞系，購自Invitrogen公司。sf9細(xì)胞是草地貪夜蛾（Spodopterafrugiperda）卵巢細(xì)胞系，對桿狀病毒具有良好的感染性和轉(zhuǎn)染效率，常用于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中外源基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)動物：6-8周齡雌性BALB/c小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房，溫度控制在22-25℃，相對濕度為40%-60%，自由攝食和飲水，用于免疫原性評價實(shí)驗(yàn)。主要試劑：限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ，購自NEB公司；T4DNA連接酶，購自Promega公司；DNAMarker、ProteinMarker，購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，購自O(shè)mega公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin，購自Invitrogen公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒，購自Solarbio公司；BCA蛋白定量試劑盒，購自ThermoScientific公司；蔗糖，購自Sigma公司；EV71病毒株，由本實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)胞培養(yǎng)基Grace'sInsectMedium、胎牛血清（FBS），購自Gibco公司；青霉素-鏈霉素雙抗溶液，購自HyClone公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器：PCR儀（Bio-Rad公司）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）、CO?培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司）、倒置顯微鏡（Olympus公司）、酶標(biāo)儀（ThermoScientific公司）、透射電子顯微鏡（JEOL公司）。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1重組桿狀病毒的構(gòu)建取適量科室構(gòu)建保存的攜帶EV71結(jié)構(gòu)蛋白基因P1與非結(jié)構(gòu)蛋白基因3CD的供體質(zhì)粒pFastBac-Dual-P1-3CD，使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切反應(yīng)。反應(yīng)體系包含適量的供體質(zhì)粒、10×Buffer、BamHⅠ、EcoRⅠ以及ddH?O，總體積為20μL。將反應(yīng)體系置于37℃恒溫金屬浴中孵育3-4h，使酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，與DNAMarker對比，判斷酶切片段的大小和完整性，以確保基因序列的正確性。將酶切鑒定正確的供體質(zhì)粒pFastBac-Dual-P1-3CD轉(zhuǎn)化至E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中。取5μL供體質(zhì)粒加入到100μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻后，冰浴30min。然后將混合物置于42℃水浴中熱激90s，迅速放回冰浴中冷卻2-3min。向管中加入900μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)45-60min，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)抗性基因。復(fù)蘇后的菌液均勻涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）、慶大霉素（7μg/mL）、四環(huán)素（10μg/mL）、IPTG（0.1mM）和X-gal（40μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)16-20h，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。由于重組過程中，供體質(zhì)粒上的目的基因會插入到桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid的LacZ基因中，導(dǎo)致LacZ基因失活。因此，含有重組桿狀病毒質(zhì)粒的菌落不能分解X-gal，呈現(xiàn)白色；而未重組的菌落則會分解X-gal，呈現(xiàn)藍(lán)色。從白色菌落中挑取單菌落，接種于含有上述三種抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-P1-3CD，以提取的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系包含2×TaqPCRMasterMix、上下游引物（針對P1和3CD基因設(shè)計(jì)）、模板質(zhì)粒以及ddH?O，總體積為25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1-2min（根據(jù)目的基因片段大小調(diào)整），共30個循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，若能擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的P1和3CD基因條帶，則表明重組桿狀病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.2.2重組桿狀病毒的轉(zhuǎn)染與擴(kuò)增將處于對數(shù)生長期的昆蟲細(xì)胞sf9以1×10?個/孔的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的Grace'sInsectMedium培養(yǎng)基，置于27℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長至80%-90%融合度時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin的說明書進(jìn)行操作。在無菌離心管中，分別將1μg重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-P1-3CD和4μLCellfectin試劑用100μL無血清Grace'sInsectMedium培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻后，室溫靜置5min。然后將兩者混合，輕輕顛倒混勻，室溫孵育20-30min，使質(zhì)粒與脂質(zhì)體形成復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2次，每孔加入800μL無血清Grace'sInsectMedium培養(yǎng)基。將上述制備好的質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物逐滴加入到細(xì)胞孔中，輕輕晃動培養(yǎng)板，使復(fù)合物均勻分布。將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中，27℃孵育4-6h。孵育結(jié)束后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入2mL含10%胎牛血清的Grace'sInsectMedium培養(yǎng)基，繼續(xù)在27℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48-72h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)病變，如細(xì)胞變圓、腫脹、脫落等，表明重組桿狀病毒成功轉(zhuǎn)染并在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行了復(fù)制和增殖。收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞上清液，即為第一代重組桿狀病毒rBV-P1-3CD。將第一代病毒以1:100的比例接種到新的對數(shù)生長期sf9細(xì)胞中，按照上述培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行病毒的擴(kuò)增。重復(fù)擴(kuò)增2-3次，以獲得足夠滴度的重組桿狀病毒。采用蝕斑法測定重組桿狀病毒的滴度。將對數(shù)生長期的sf9細(xì)胞以1×10?個/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁。將重組桿狀病毒上清液進(jìn)行10倍系列稀釋，從10?1到10??。每個稀釋度取100μL加入到細(xì)胞孔中，每個稀釋度設(shè)置3個復(fù)孔，輕輕晃動培養(yǎng)板，使病毒液均勻分布。將培養(yǎng)板置于27℃孵育1-2h，期間每隔15-20min輕輕晃動一次，以促進(jìn)病毒與細(xì)胞的吸附。吸附結(jié)束后，吸出病毒液，每孔加入2mL含0.8%低熔點(diǎn)瓊脂糖的Grace'sInsectMedium培養(yǎng)基（預(yù)先加熱至40-45℃，并與等體積的2×Grace'sInsectMedium培養(yǎng)基混合均勻），輕輕晃動培養(yǎng)板，使瓊脂糖均勻覆蓋細(xì)胞。待瓊脂糖凝固后，將培養(yǎng)板放回27℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-5天。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1mL含中性紅的染色液（0.01%中性紅，用PBS配制），室溫染色2-3h。在倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)蝕斑，根據(jù)公式計(jì)算病毒滴度：病毒滴度（PFU/mL）=蝕斑數(shù)×稀釋倍數(shù)/接種體積。2.2.3EV71類病毒顆粒的表達(dá)與檢測將重組桿狀病毒rBV-P1-3CD以MOI（感染復(fù)數(shù)）為5的比例接種到對數(shù)生長期的sf9細(xì)胞中，培養(yǎng)48-72h后，進(jìn)行免疫熒光檢測。吸出細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞3次，每次5min。加入4%多聚甲醛固定液，室溫固定15-20min。固定結(jié)束后，棄去固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。加入0.2%TritonX-100通透液，室溫孵育10-15min，使細(xì)胞膜通透，便于抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與抗原結(jié)合。通透后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。加入5%BSA封閉液，室溫封閉1-2h，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，加入用封閉液稀釋的抗EV71結(jié)構(gòu)蛋白特異性一抗（1:100-1:500稀釋），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。加入用封閉液稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗（1:200-1:500稀釋），室溫避光孵育1-2h。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。最后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，若細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光，則表明重組病毒成功表達(dá)了EV71結(jié)構(gòu)蛋白。將感染重組桿狀病毒的sf9細(xì)胞培養(yǎng)48-72h后，收集細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min，期間不斷振蕩。然后將裂解液于4℃、12000rpm離心15min，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。按照試劑盒說明書操作，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白（BSA）和樣品蛋白分別加入到96孔板中，每孔加入適量的BCA工作液，輕輕混勻。37℃孵育30min，在酶標(biāo)儀上測定562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白濃度。取適量的蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行12%SDS電泳分離，電泳條件為80V恒壓電泳30min，然后120V恒壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。采用半干轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)膜條件為15V恒壓轉(zhuǎn)膜30-60min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉1-2h。封閉后，棄去封閉液，加入用封閉液稀釋的抗EV71結(jié)構(gòu)蛋白特異性一抗（1:1000-1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。加入用封閉液稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗（1:2000-1:5000稀釋），室溫孵育1-2h。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，加入DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色反應(yīng)。根據(jù)顯色結(jié)果，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，若出現(xiàn)與預(yù)期分子量相符的條帶，則表明表達(dá)產(chǎn)物為特異性的EV71結(jié)構(gòu)蛋白，且可判斷P1基因是否被3CD酶正確切割。將感染重組桿狀病毒的sf9細(xì)胞培養(yǎng)48-72h后，收集細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌2-3次。將細(xì)胞沉淀重懸于2.5%戊二醛固定液中，4℃固定2h以上。固定后的細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌3次，每次15min。然后用1%鋨酸固定液4℃固定1-2h。固定結(jié)束后，依次用30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液進(jìn)行梯度脫水，每個濃度脫水15-20min。將脫水后的細(xì)胞用純丙酮置換2-3次，每次15min。將細(xì)胞與環(huán)氧樹脂包埋劑按一定比例混合，室溫下滲透過夜。次日，將混合物倒入包埋模具中，放入60℃烘箱中聚合24-48h，使包埋劑完全固化。用超薄切片機(jī)將包埋塊切成70-90nm厚的超薄切片，將切片撈至銅網(wǎng)上。用2%醋酸鈾和檸檬酸鉛對銅網(wǎng)上的切片進(jìn)行染色，染色時間分別為15-20min和5-10min。染色結(jié)束后，用蒸餾水沖洗銅網(wǎng)，自然干燥。最后，在透射電子顯微鏡下觀察切片，若觀察到大小約為24-30nm的類球形顆粒，則表明成功表達(dá)了EV71類病毒顆粒，并可觀察其形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征。2.2.4EV71類病毒顆粒的純化將感染重組桿狀病毒的sf9細(xì)胞培養(yǎng)至合適時間后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，4℃、5000rpm離心15-20min，去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)。將上清液轉(zhuǎn)移至超速離心管中，加入適量的蔗糖溶液，使其在離心管底部形成連續(xù)的蔗糖密度梯度，蔗糖濃度范圍為20%-60%。將超速離心管放入超速離心機(jī)中，4℃、100000-150000×g離心2-3h。離心結(jié)束后，從離心管底部開始，用吸管小心收集不同密度層的溶液，每個密度層收集1-2mL。采用SDS和WesternBlot方法對收集的各密度層溶液進(jìn)行分析鑒定，確定含有EV71類病毒顆粒的密度層。將含有目的蛋白的溶液合并，用PBS緩沖液進(jìn)行透析，去除蔗糖和其他雜質(zhì)，透析過程中需多次更換PBS緩沖液。透析結(jié)束后，將溶液進(jìn)行濃縮，可采用超濾離心管等方法進(jìn)行濃縮，使目的蛋白濃度達(dá)到合適水平。最后，將純化后的EV71類病毒顆粒保存于-80℃冰箱中，備用。2.2.5免疫原性評價選取6-8周齡雌性BALB/c小鼠，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組5-10只。實(shí)驗(yàn)組小鼠每只皮下注射10-20μg純化后的EV71類病毒顆粒，對照組小鼠每只皮下注射等量的PBS緩沖液。免疫程序?yàn)?周、2周和4周各免疫一次。在每次免疫后的第7-10天，采用眼眶采血法采集小鼠血清，將血清于4℃、3000rpm離心10-15min，分離出血清，保存于-20℃冰箱中備用。采用ELISA方法檢測小鼠血清中抗EV71特異性IgG抗體的水平。用包被緩沖液將EV71病毒抗原稀釋至合適濃度（1-10μg/mL），每孔加入100μL，包被96孔酶標(biāo)板，4℃過夜。次日，棄去包被液，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，每次5min。加入200μL5%BSA封閉液，37℃封閉1-2h。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，每次5min。將小鼠血清用PBST緩沖液進(jìn)行倍比稀釋（從1:100開始），每孔加入100μL稀釋后的血清，37℃孵育1-2h。孵育結(jié)束后，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，每次5min。加入用PBST緩沖液稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗（1:2000-1:5000稀釋），每孔100μL，37℃孵育1-2h。孵育結(jié)束后，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，每次5min。加入TMB顯色液，每孔100μL，室溫避光顯色15-20min。當(dāng)顯色達(dá)到合適程度時，加入50μL2MH?SO?終止液終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上測定450nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算小鼠血清中抗EV71特異性IgG抗體的滴度。采用微量中和試驗(yàn)測定小鼠血清對EV71病毒的中和效價。將對數(shù)生長期的RD細(xì)胞以1×10?個/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長至80%-90%融合度時進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將小鼠血清進(jìn)行5倍系列稀釋（從1:5開始），每個稀釋度取50μL與等體積的100TCID??（半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）的EV71病毒液混合，37℃孵育1-2h，使抗體與病毒充分結(jié)合。將混合液加入到已接種RD細(xì)胞的96孔板中，每孔100μL，每個稀釋度設(shè)置3-5個復(fù)孔。同時設(shè)置病毒對照孔（只加病毒液）和細(xì)胞對照孔（只加培養(yǎng)基）。將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況（CPE）。以能完全抑制50%細(xì)胞出現(xiàn)病變的血清最高稀釋度為該血清的中和效價。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1重組桿狀病毒的鑒定將構(gòu)建的重組桿狀病毒rBV-P1-3CD進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖1所示。以重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-P1-3CD為模板，使用針對P1和3CD基因設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在1%瓊脂糖凝膠電泳上，可清晰觀察到與預(yù)期大小相符的條帶。其中，P1基因擴(kuò)增條帶大小約為2200bp，3CD基因擴(kuò)增條帶大小約為800bp。而以未重組的桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，未出現(xiàn)相應(yīng)條帶。這表明重組桿狀病毒rBV-P1-3CD中成功插入了特異性的P1和3CD基因，重組桿狀病毒構(gòu)建成功。為進(jìn)一步確定重組桿狀病毒是否能表達(dá)EV71結(jié)構(gòu)蛋白，對重組桿狀病毒感染的sf9細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光檢測。結(jié)果如圖2所示，在熒光顯微鏡下，感染重組桿狀病毒rBV-P1-3CD的sf9細(xì)胞呈現(xiàn)出明亮的綠色熒光，而未感染重組病毒的sf9細(xì)胞則無熒光信號。這表明重組桿狀病毒rBV-P1-3CD能夠在sf9細(xì)胞中特異性表達(dá)EV71結(jié)構(gòu)蛋白，且該蛋白能夠被抗EV71結(jié)構(gòu)蛋白特異性抗體所識別。3.2EV71類病毒顆粒的表達(dá)與形態(tài)學(xué)觀察將重組桿狀病毒rBV-P1-3CD感染sf9細(xì)胞，對感染后的細(xì)胞進(jìn)行SDS和WesternBlot分析，結(jié)果如圖3所示。在SDS凝膠上，可見一條分子量約為39KD的條帶，與預(yù)期的VP1分子量相符。在WesternBlot檢測中，使用抗EV71結(jié)構(gòu)蛋白特異性抗體進(jìn)行檢測，也在約39KD處出現(xiàn)特異性條帶，進(jìn)一步證明該條帶為VP1蛋白，表明P1基因可被表達(dá)的3CD酶正確切割，成功表達(dá)出VP1蛋白。對感染重組桿狀病毒rBV-P1-3CD的sf9細(xì)胞進(jìn)行電鏡觀察，結(jié)果如圖4所示。在電鏡下可觀察到大小約為24-30nm的類球形顆粒，這些顆粒的形態(tài)和大小與天然EV71病毒顆粒相似，表明成功表達(dá)了EV71類病毒顆粒。3.3免疫原性評價結(jié)果采用ELISA方法檢測實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中抗EV71特異性IgG抗體，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠在免疫后，血清中均檢測到抗EV71特異性IgG抗體，抗體效價為1:776。而對照組小鼠血清中未檢測到抗EV71特異性IgG抗體，表明實(shí)驗(yàn)組小鼠對EV71類病毒顆粒產(chǎn)生了特異性體液免疫應(yīng)答。通過微量中和試驗(yàn)測定小鼠血清對EV71病毒的中和效價，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清能中和EV71病毒，中和效價為1:588。這意味著實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中的抗體能夠有效地中和EV71病毒，抑制病毒對細(xì)胞的感染，進(jìn)一步證明了EV71類病毒顆粒能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生具有中和活性的抗體，具備良好的免疫原性。四、討論4.1EV71類病毒顆粒的表達(dá)分析本研究成功應(yīng)用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了EV71類病毒顆粒。Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有諸多優(yōu)勢，該系統(tǒng)能夠容納大片段外源基因進(jìn)行表達(dá)，為EV71病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因P1和非結(jié)構(gòu)蛋白基因3CD的共表達(dá)提供了可能。通過該系統(tǒng)，我們順利構(gòu)建了重組桿狀病毒rBV-P1-3CD，并實(shí)現(xiàn)了EV71類病毒顆粒在sf9細(xì)胞中的表達(dá)。而且，由于是在真核系統(tǒng)中表達(dá)，該系統(tǒng)能夠?qū)Ρ磉_(dá)的蛋白進(jìn)行正確的折疊和修飾，使得表達(dá)的EV71類病毒顆粒在結(jié)構(gòu)和構(gòu)象上更接近天然病毒顆粒，有利于保持其免疫原性。如在其他研究中，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的流感病毒類病毒顆粒，其表面抗原的構(gòu)象與天然病毒相似，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。然而，該表達(dá)系統(tǒng)也存在一些不足之處。在重組桿狀病毒的構(gòu)建過程中，雖然藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定能夠有效篩選出重組病毒，但操作過程相對繁瑣，需要耗費(fèi)一定的時間和精力。在病毒轉(zhuǎn)染和擴(kuò)增過程中，病毒的滴度和感染效率可能會受到多種因素的影響，如細(xì)胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染試劑的質(zhì)量和轉(zhuǎn)染條件等，這可能導(dǎo)致表達(dá)量的不穩(wěn)定。此外，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的成本相對較高，包括昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)、病毒的擴(kuò)增以及表達(dá)產(chǎn)物的純化等過程都需要消耗大量的試劑和資源，這在一定程度上限制了其大規(guī)模應(yīng)用。影響EV71類病毒顆粒表達(dá)效率和顆粒形成的因素是多方面的。從基因?qū)用鎭砜?，P1基因和3CD基因的序列完整性和正確性至關(guān)重要。若基因序列存在突變或缺失，可能會導(dǎo)致蛋白表達(dá)異?；驘o法表達(dá)，進(jìn)而影響類病毒顆粒的形成。本研究中對供體質(zhì)粒pFastBac-Dual-P1-3CD進(jìn)行雙酶切鑒定，確保了基因序列的準(zhǔn)確性，為后續(xù)的成功表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。3CD蛋白酶對P1蛋白的正確切割是類病毒顆粒組裝的關(guān)鍵步驟。如果3CD蛋白酶的活性受到抑制或切割位點(diǎn)發(fā)生改變，P1蛋白不能被正確切割成VP1、VP2、VP3和VP4等結(jié)構(gòu)蛋白，就無法組裝成完整的類病毒顆粒。宿主細(xì)胞的狀態(tài)和培養(yǎng)條件也會對表達(dá)效率產(chǎn)生顯著影響。sf9細(xì)胞的生長狀態(tài)、密度以及培養(yǎng)基的成分等都可能影響重組桿狀病毒的感染和蛋白表達(dá)。處于對數(shù)生長期的sf9細(xì)胞對病毒的感染更為敏感，能夠提高重組桿狀病毒的轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)水平。合適的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件，如溫度、pH值和血清濃度等，有助于維持細(xì)胞的正常生理功能，促進(jìn)蛋白的表達(dá)和類病毒顆粒的組裝。若培養(yǎng)條件不適宜，細(xì)胞生長受到抑制，可能會導(dǎo)致表達(dá)量降低或顆粒組裝異常。重組桿狀病毒的滴度和感染復(fù)數(shù)（MOI）也是影響表達(dá)效率的重要因素。高滴度的重組桿狀病毒能夠增加病毒與細(xì)胞的接觸機(jī)會，提高感染效率，從而促進(jìn)類病毒顆粒的表達(dá)。然而，過高的MOI可能會對細(xì)胞造成損傷，影響細(xì)胞的正常代謝和生長，反而不利于蛋白表達(dá)和顆粒形成。因此，需要通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化MOI，找到最佳的感染條件，以提高表達(dá)效率和顆粒產(chǎn)量。在其他利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)類病毒顆粒的研究中，也發(fā)現(xiàn)通過優(yōu)化MOI可以顯著提高表達(dá)量和顆粒的質(zhì)量。4.2免疫原性評價結(jié)果分析本研究中，通過ELISA檢測實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中抗EV71特異性IgG抗體，效價為1:776，表明EV71類病毒顆粒能夠刺激小鼠的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性的體液免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，分泌抗EV71特異性IgG抗體。這種特異性抗體的產(chǎn)生是機(jī)體對EV71類病毒顆粒識別和免疫反應(yīng)的重要體現(xiàn)，為機(jī)體提供了一定的免疫保護(hù)基礎(chǔ)。如在其他針對病毒類病毒顆粒疫苗的研究中，也發(fā)現(xiàn)類病毒顆粒能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性IgG抗體，且抗體效價與疫苗的免疫原性密切相關(guān)。通過微量中和試驗(yàn)測定小鼠血清對EV71病毒的中和效價為1:588，說明實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中的抗體具有中和EV71病毒的活性，能夠與病毒表面的抗原表位結(jié)合，阻止病毒感染宿主細(xì)胞，從而發(fā)揮免疫保護(hù)作用。中和抗體是機(jī)體抵御病毒感染的重要防線，其效價的高低直接反映了疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)能力的強(qiáng)弱。在相關(guān)研究中，中和抗體效價越高，疫苗對機(jī)體的保護(hù)效果越好，能夠有效降低病毒感染導(dǎo)致的疾病發(fā)生率和嚴(yán)重程度。這些結(jié)果表明，本研究中表達(dá)的EV71類病毒顆粒具有較好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答，為進(jìn)一步研發(fā)EV71疫苗提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，與其他已上市的EV71疫苗相比，本研究中類病毒顆粒誘導(dǎo)的抗體效價和中和效價可能存在一定的差距。已上市的EV71滅活疫苗在大規(guī)模臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出較高的免疫原性和保護(hù)效力，能夠有效預(yù)防EV71感染引起的手足口病。這可能是由于不同的疫苗制備方法和工藝，以及疫苗的佐劑等因素的影響。滅活疫苗通過化學(xué)或物理方法使病毒失去感染性，但保留了病毒的抗原性，在制備過程中可能更好地保留了病毒的天然結(jié)構(gòu)和抗原表位，從而誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。類病毒顆粒疫苗的免疫原性還可能受到多種因素的影響。類病毒顆粒的結(jié)構(gòu)完整性和純度對其免疫原性至關(guān)重要。如果類病毒顆粒在表達(dá)、純化過程中結(jié)構(gòu)遭到破壞，或者純度不高，含有雜質(zhì)，可能會影響其與免疫系統(tǒng)的相互作用，降低免疫原性。本研究中雖然對類病毒顆粒進(jìn)行了蔗糖密度梯度離心純化，但仍可能存在一些雜質(zhì)或未完全組裝的蛋白，這些因素可能對免疫原性產(chǎn)生一定的影響。免疫程序和劑量也會對免疫原性產(chǎn)生顯著影響。本研究采用0周、2周和4周各免疫一次的免疫程序，以及10-20μg的免疫劑量，可能不是最佳的免疫方案。不同的免疫程序和劑量可能會導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)對類病毒顆粒的識別和應(yīng)答方式不同，從而影響免疫原性。在后續(xù)研究中，可以進(jìn)一步優(yōu)化免疫程序和劑量，通過增加免疫次數(shù)、調(diào)整免疫間隔時間或改變免疫劑量等方式，提高類病毒顆粒的免疫原性。宿主的遺傳背景、年齡、性別和健康狀況等因素也可能影響類病毒顆粒的免疫原性。不同遺傳背景的小鼠對同一種疫苗的免疫應(yīng)答可能存在差異，年齡較小或較大的小鼠、雌性和雄性小鼠以及健康狀況不同的小鼠，其免疫系統(tǒng)的功能和對疫苗的反應(yīng)性也可能不同。在本研究中，選用6-8周齡雌性BALB/c小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，未考慮其他因素的影響。在未來的研究中，可以擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)動物的種類和范圍，綜合考慮多種因素對免疫原性的影響，以更全面地評估EV71類病毒顆粒的免疫效果。4.3研究的局限性與展望本研究在方法和樣本等方面存在一定的局限性。在表達(dá)系統(tǒng)方面，盡管Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)展現(xiàn)出諸多優(yōu)勢，但操作流程較為復(fù)雜，對實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求較高。而且，該系統(tǒng)的成本相對較高，這在一定程度上限制了其大規(guī)模應(yīng)用。若未來能開發(fā)出更簡便、高效且成本低廉的表達(dá)系統(tǒng)，將極大地推動EV71類病毒顆粒疫苗的研發(fā)進(jìn)程。在類病毒顆粒的純化方面，本研究采用的蔗糖密度梯度離心純化方法雖能有效去除雜質(zhì)和未組裝的蛋白，但該方法需要特殊的設(shè)備和大量的試劑，操作過程繁瑣，且可能會導(dǎo)致部分類病毒顆粒的損失。因此，后續(xù)研究可以探索更加高效、溫和的純化方法，以提高類病毒顆粒的純度和回收率。本研究在免疫原性評價實(shí)驗(yàn)中僅選用了6-8周齡雌性BALB/c小鼠，樣本類型和范圍相對單一。不同遺傳背景、年齡、性別和健康狀況的動物對疫苗的免疫應(yīng)答可能存在差異，僅使用單一類型的實(shí)驗(yàn)動物可能無法全面準(zhǔn)確地評估EV71類病毒顆粒的免疫原性。未來，在進(jìn)一步研究EV71類病毒顆粒的表達(dá)和免疫原性時，可從以下幾個方面展開：在表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化上，深入研究桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制，通過優(yōu)化病毒載體、宿主細(xì)胞以及培養(yǎng)條件等，提高EV71類病毒顆粒的表達(dá)效率和質(zhì)量。也可以探索其他新型表達(dá)系統(tǒng)，如植物表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等，比較不同表達(dá)系統(tǒng)對EV71類病毒顆粒表達(dá)和免疫原性的影響，尋找更適合的表達(dá)體系。在免疫原性研究中，擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)動物的種類和范圍，綜合考慮多種因素對免疫原性的影響。除了小鼠外，還可以選用大鼠、豚鼠、兔等動物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，甚至開展靈長類動物實(shí)驗(yàn)，以更全面地評估EV71類病毒顆粒在不同動物模型中的免疫效果。進(jìn)一步優(yōu)化免疫程序和劑量，通過增加免疫次數(shù)、調(diào)整免疫間隔時間或改變免疫劑量等方式，提高類病毒顆粒的免疫原性，確定最佳的免疫方案。開發(fā)相關(guān)疫苗時，將EV71類病毒顆粒與合適的佐劑聯(lián)合使用，增強(qiáng)其免疫原性。佐劑可以激活免疫系統(tǒng)，提高抗原的免疫應(yīng)答水平，從而增強(qiáng)疫苗的保護(hù)效果。還可以嘗試將EV71類病毒顆粒與其他手足口病病原體的抗原聯(lián)合，研發(fā)多價疫苗，以實(shí)現(xiàn)對多種腸道病毒的同時預(yù)防。相信通過不斷地深入研究和技術(shù)創(chuàng)新，能夠進(jìn)一步提高EV71類病毒顆粒的表達(dá)水平和免疫原性，為EV71新型疫苗的研發(fā)提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，為手足口病的預(yù)防和控制做出更大的貢獻(xiàn)。五、結(jié)論5.1研究成果總結(jié)本研究成功利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了EV71類病毒顆粒，并對其免疫原性進(jìn)行了初步評價。通過雙酶切鑒定、藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定等一系列分子生物學(xué)技術(shù)，成功構(gòu)建了攜帶EV71病毒結(jié)構(gòu)基因P1和3CD蛋白酶基因的重組桿狀病毒rBV-P1-3CD。將重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞sf9后，通過免疫熒光、WesternBlot及電鏡觀察等方法，證實(shí)了EV71類病毒顆粒在sf9細(xì)胞中的成功表達(dá)。在表達(dá)產(chǎn)物的鑒定方面，免疫熒光檢測顯示重組桿狀病毒能夠在sf9細(xì)胞中特異性表達(dá)EV71結(jié)構(gòu)蛋白；WesternBlot分析表明P1基因可被表達(dá)的3CD酶正確切割，成功表達(dá)出VP1蛋白；電鏡觀察則直觀地展示了大小約為24-30nm的類球形顆粒，其形態(tài)和大小與天然EV71病毒顆粒相似，確認(rèn)為EV71類病毒顆粒。對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行蔗糖密度梯度離心純化后，將純化的EV71類病毒顆粒免疫BALB/c小鼠，采用ELISA和微量中和試驗(yàn)對其免疫原性進(jìn)行評價。ELISA檢測結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中