Notch信號(hào)通路在雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)成骨中的多維度機(jī)制解析一、引言1.1研究背景與意義骨缺損是骨科臨床常見(jiàn)且棘手的問(wèn)題，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。外傷、腫瘤切除、先天性疾病等多種因素均可導(dǎo)致骨缺損，其修復(fù)重建一直是國(guó)際臨床難題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年約有1000多萬(wàn)骨缺損患者，隨著交通事故、老齡化社會(huì)進(jìn)程的加快，骨缺損患者數(shù)量呈上升趨勢(shì)。傳統(tǒng)的骨修復(fù)方法如自體骨移植，雖被視為骨修復(fù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但存在需開(kāi)辟第二術(shù)區(qū)、增加額外手術(shù)創(chuàng)傷、骨源有限等問(wèn)題。而異體骨移植則面臨免疫排斥反應(yīng)及潛在傳播傳染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，限制了其廣泛應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)高效、安全的骨替代材料成為骨缺損修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。雙相鈣磷陶瓷（BiphasicCalciumPhosphateCeramics，BCP）作為一種新型骨替代材料，由羥基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）和磷酸三鈣（TricalciumPhosphate，TCP）組成，兼具兩者的優(yōu)點(diǎn)，具有良好的生物相容性、生物活性、骨傳導(dǎo)性及骨誘導(dǎo)性。其生物活性高于單一的羥基磷灰石陶瓷，在口腔種植、骨支架材料、藥物緩釋載體等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。在口腔種植中，雙相鈣磷陶瓷可用作缺失牙修復(fù)材料，促進(jìn)種植體與周圍骨組織的結(jié)合，提高種植成功率；在骨支架材料領(lǐng)域，其骨傳導(dǎo)性能夠滿足骨支架對(duì)多孔生物材料的要求，為骨組織的生長(zhǎng)提供支撐和引導(dǎo)。大量體內(nèi)外研究表明，具有特殊理化性質(zhì)的雙相磷酸鈣陶瓷具有骨誘導(dǎo)性，是大型骨缺損具有廣闊應(yīng)用前景的修復(fù)材料。然而，雙相鈣磷陶瓷骨誘導(dǎo)的具體機(jī)制仍不明確，限制了其進(jìn)一步的優(yōu)化和臨床應(yīng)用。Notch信號(hào)通路是一種進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞間通信途徑，在細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡等多種生物過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在胚胎發(fā)育階段，Notch信號(hào)通路參與多種器官和組織的形成，如心臟、神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼等。在成體生物中，Notch信號(hào)通路在組織修復(fù)和再生過(guò)程中也起著重要的調(diào)節(jié)作用。在骨組織中，Notch信號(hào)通路參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BoneMarrowMesenchymalStemCells，BMSCs）向成骨細(xì)胞的分化、成骨細(xì)胞的增殖與功能維持以及破骨細(xì)胞的分化與活性調(diào)節(jié)等過(guò)程。已有研究表明，Notch信號(hào)通路的激活或抑制可影響骨組織的形成和重建，但具體機(jī)制尚未完全闡明。在骨缺損修復(fù)過(guò)程中，Notch信號(hào)通路可能通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性，參與雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)的成骨過(guò)程。深入研究Notch信號(hào)通路在雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)成骨中的作用機(jī)制，有助于揭示骨缺損修復(fù)的分子機(jī)制，為開(kāi)發(fā)基于Notch信號(hào)通路的骨缺損治療新策略提供理論依據(jù)，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)成骨的研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了一系列成果。雙相鈣磷陶瓷因其獨(dú)特的化學(xué)組成和物理結(jié)構(gòu)，展現(xiàn)出良好的骨誘導(dǎo)能力。學(xué)者們對(duì)影響雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)成骨能力的因素進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)化學(xué)組成影響陶瓷的降解和再沉積速率，進(jìn)而影響成骨過(guò)程；物理結(jié)構(gòu)如孔隙結(jié)構(gòu)及表面微形貌，主要影響材料中的組織及血管長(zhǎng)入、鈣磷離子富集、局部的流體運(yùn)動(dòng)、蛋白吸附、細(xì)胞黏附與增殖等，從而對(duì)成骨效果產(chǎn)生作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，多孔雙相鈣磷陶瓷被應(yīng)用于脊柱后路融合，結(jié)果顯示所有標(biāo)本均可見(jiàn)新生骨組織，且與自體骨接觸越多，陶瓷內(nèi)的新生骨組織越多。這表明雙相鈣磷陶瓷在骨修復(fù)中具有骨傳導(dǎo)作用，能為骨組織生長(zhǎng)提供支架。在臨床應(yīng)用上，雙相鈣磷陶瓷也展現(xiàn)出一定的潛力，可用于口腔種植、骨缺損修復(fù)等領(lǐng)域。在口腔種植中，它能促進(jìn)種植體與周圍骨組織的結(jié)合，提高種植成功率。關(guān)于Notch信號(hào)通路，其在骨組織發(fā)育和骨代謝中的作用逐漸被揭示。Notch信號(hào)通路主要由Notch配體、Notch受體、DNA結(jié)合蛋白以及下游靶基因構(gòu)成。在骨組織中，Notch信號(hào)通路參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化過(guò)程。有研究表明，激活骨細(xì)胞Notch信號(hào)對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化的影響存在爭(zhēng)議，部分研究發(fā)現(xiàn)激活骨細(xì)胞Notch信號(hào)導(dǎo)致骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化成熟障礙，進(jìn)而導(dǎo)致骨量增加；而另有研究則表明激活骨細(xì)胞Notch信號(hào)可抑制祖細(xì)胞向成骨分化，導(dǎo)致骨量降低。這種差異可能與實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?、研究方法以及信?hào)激活的程度和時(shí)間等因素有關(guān)。Notch信號(hào)通路還參與成骨細(xì)胞的增殖與功能維持以及破骨細(xì)胞的分化與活性調(diào)節(jié)等過(guò)程。在破骨細(xì)胞分化過(guò)程中，Notch信號(hào)通路可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，影響破骨細(xì)胞的生成和活性。然而，目前對(duì)于Notch信號(hào)通路在雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)成骨中的作用機(jī)制研究仍相對(duì)較少。雖然已知雙相鈣磷陶瓷具有骨誘導(dǎo)性，Notch信號(hào)通路在骨代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但二者之間的具體聯(lián)系和作用機(jī)制尚未完全明確。在雙相鈣磷陶瓷植入體內(nèi)后，Notch信號(hào)通路如何被激活或抑制，以及其對(duì)雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化等過(guò)程的具體調(diào)控機(jī)制，仍有待進(jìn)一步深入探究?，F(xiàn)有的研究主要集中在單一因素對(duì)成骨的影響，缺乏對(duì)雙相鈣磷陶瓷與Notch信號(hào)通路相互作用的系統(tǒng)性研究。在研究方法上，多為體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，臨床研究相對(duì)匱乏，這限制了對(duì)其在人體中作用機(jī)制的全面了解。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究Notch信號(hào)通路在雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)成骨中的具體機(jī)制，為骨缺損修復(fù)提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和更有效的治療策略。具體研究?jī)?nèi)容如下：雙相鈣磷陶瓷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響：通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與雙相鈣磷陶瓷共培養(yǎng)，采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法）檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，通過(guò)堿性磷酸酶（ALP）活性檢測(cè)、茜素紅染色等方法評(píng)估細(xì)胞的成骨分化能力，觀察雙相鈣磷陶瓷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測(cè)成骨相關(guān)基因（如Runx2、Osterix、ALP等）和蛋白的表達(dá)水平，深入分析雙相鈣磷陶瓷促進(jìn)成骨分化的分子機(jī)制。Notch信號(hào)通路在雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)成骨中的作用：采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)或特異性抑制劑，抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中Notch信號(hào)通路的活性，再與雙相鈣磷陶瓷共培養(yǎng)。通過(guò)上述同樣的檢測(cè)方法，觀察Notch信號(hào)通路被抑制后，雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的能力變化，明確Notch信號(hào)通路在其中的作用。利用基因過(guò)表達(dá)技術(shù)，激活Notch信號(hào)通路，進(jìn)一步驗(yàn)證其對(duì)雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)成骨的影響。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等方法，檢測(cè)Notch信號(hào)通路的關(guān)鍵分子（如Notch受體、配體、下游靶基因等）的表達(dá)和活性變化，揭示Notch信號(hào)通路在雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)成骨中的作用機(jī)制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Notch信號(hào)通路在雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)成骨中的機(jī)制：建立動(dòng)物骨缺損模型，將雙相鈣磷陶瓷植入骨缺損部位，同時(shí)通過(guò)體內(nèi)注射RNAi載體或特異性抑制劑等方式，調(diào)控Notch信號(hào)通路的活性。在不同時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，取骨缺損部位組織，進(jìn)行組織學(xué)分析（如蘇木精-伊紅染色、Masson染色等）、免疫組織化學(xué)染色（檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)）和Micro-CT掃描（評(píng)估骨缺損修復(fù)情況和新骨形成量），從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)角度驗(yàn)證Notch信號(hào)通路在雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)成骨中的作用機(jī)制。對(duì)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行量化分析，對(duì)比不同處理組之間的骨缺損修復(fù)效果和Notch信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)差異，進(jìn)一步明確Notch信號(hào)通路與雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)成骨之間的關(guān)系。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)手段，從細(xì)胞水平和動(dòng)物整體水平深入探究Notch信號(hào)通路在雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)成骨中的機(jī)制，具體如下：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)與材料準(zhǔn)備：從SD大鼠的股骨和脛骨中提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，采用全骨髓貼壁法進(jìn)行分離培養(yǎng)，使用含10%胎牛血清、1%雙抗的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。通過(guò)高溫?zé)Y(jié)法制備雙相鈣磷陶瓷，精確控制羥基磷灰石和磷酸三鈣的比例，使其具備特定的化學(xué)組成和物理結(jié)構(gòu)，隨后將其加工成適宜細(xì)胞培養(yǎng)的形狀，并進(jìn)行嚴(yán)格的消毒處理。雙相鈣磷陶瓷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響檢測(cè)：將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以合適的密度接種于含有雙相鈣磷陶瓷的培養(yǎng)板中，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組（僅含細(xì)胞和培養(yǎng)基）。采用CCK-8法在不同時(shí)間點(diǎn)（1、3、5、7天）檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，向培養(yǎng)孔中加入CCK-8溶液，孵育一定時(shí)間后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度值。在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后，使用ALP活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的ALP活性，按照試劑盒說(shuō)明書操作，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度來(lái)計(jì)算ALP活性。培養(yǎng)14天后，進(jìn)行茜素紅染色，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，然后用茜素紅染液染色，觀察鈣結(jié)節(jié)的形成情況，并使用ImageJ軟件進(jìn)行半定量分析。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)成骨相關(guān)基因（Runx2、Osterix、ALP等）的mRNA表達(dá)水平，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。利用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，然后與相應(yīng)的一抗和二抗孵育，最后用化學(xué)發(fā)光法顯影，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值。Notch信號(hào)通路在雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)成骨中的作用研究：設(shè)計(jì)針對(duì)Notch信號(hào)通路關(guān)鍵基因（如Notch1、RBP-Jκ等）的siRNA序列，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，抑制Notch信號(hào)通路的活性，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列的siRNA）。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞與雙相鈣磷陶瓷共培養(yǎng)，按照上述檢測(cè)方法，觀察Notch信號(hào)通路被抑制后，雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的能力變化。構(gòu)建Notch信號(hào)通路關(guān)鍵基因的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，同樣通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，激活Notch信號(hào)通路，再與雙相鈣磷陶瓷共培養(yǎng)，檢測(cè)成骨分化相關(guān)指標(biāo)，驗(yàn)證Notch信號(hào)通路對(duì)雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)成骨的影響。利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)Notch信號(hào)通路的活性變化，將含有Notch信號(hào)通路靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，然后進(jìn)行相應(yīng)處理，裂解細(xì)胞后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性，以反映Notch信號(hào)通路的激活程度。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立與材料植入：選取6-8周齡的SD大鼠，通過(guò)手術(shù)在其股骨上制造直徑為5mm的圓形骨缺損模型。將制備好的雙相鈣磷陶瓷植入骨缺損部位，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（植入空白載體或不做處理）。對(duì)于需要調(diào)控Notch信號(hào)通路的實(shí)驗(yàn)組，通過(guò)體內(nèi)注射RNAi載體或特異性抑制劑等方式，抑制Notch信號(hào)通路的活性；對(duì)于激活Notch信號(hào)通路的實(shí)驗(yàn)組，采用基因過(guò)表達(dá)技術(shù)進(jìn)行處理。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)：在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)（4、8、12周），對(duì)大鼠進(jìn)行安樂(lè)死，取出包含骨缺損部位的股骨標(biāo)本。進(jìn)行組織學(xué)分析，將標(biāo)本固定、脫鈣、脫水、包埋后，制作石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色和Masson染色，在顯微鏡下觀察骨組織的形態(tài)學(xué)變化、新骨形成情況以及雙相鈣磷陶瓷與周圍組織的結(jié)合情況。采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白（如骨鈣素、骨橋蛋白等）的表達(dá)，使用相應(yīng)的抗體進(jìn)行孵育，然后通過(guò)顯色反應(yīng)觀察蛋白的表達(dá)部位和強(qiáng)度。利用Micro-CT掃描對(duì)骨缺損部位進(jìn)行三維重建，評(píng)估骨缺損修復(fù)情況和新骨形成量，測(cè)量骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量等參數(shù)，通過(guò)圖像分析軟件進(jìn)行量化分析，對(duì)比不同處理組之間的差異，明確Notch信號(hào)通路與雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)成骨之間的關(guān)系。技術(shù)路線：本研究的技術(shù)路線如圖1所示。首先進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和雙相鈣磷陶瓷的制備，然后開(kāi)展細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)雙相鈣磷陶瓷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響以及Notch信號(hào)通路在其中的作用。同時(shí)，建立動(dòng)物骨缺損模型，進(jìn)行材料植入和Notch信號(hào)通路的調(diào)控，在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取材和檢測(cè)。最后，對(duì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，深入探究Notch信號(hào)通路在雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)成骨中的機(jī)制。[此處插入技術(shù)路線圖1，圖中清晰展示從細(xì)胞和材料準(zhǔn)備、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)到數(shù)據(jù)分析的整個(gè)流程，各步驟之間用箭頭連接，標(biāo)注關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)方法和檢測(cè)指標(biāo)]二、雙相鈣磷陶瓷與Notch信號(hào)通路概述2.1雙相鈣磷陶瓷的特性與應(yīng)用2.1.1組成與結(jié)構(gòu)雙相鈣磷陶瓷是由羥基磷灰石（HA）和磷酸三鈣（TCP）組成的生物陶瓷材料。羥基磷灰石的化學(xué)式為Ca??(PO?)?(OH)?，其鈣磷比（Ca/P）為1.67，與人體骨組織中的無(wú)機(jī)成分相似，具有良好的生物相容性和生物活性，能夠與骨組織形成緊密的化學(xué)鍵合，促進(jìn)骨組織的生長(zhǎng)和修復(fù)。在骨修復(fù)過(guò)程中，HA表面的鈣離子和磷酸根離子能夠與周圍組織中的離子發(fā)生交換，誘導(dǎo)磷灰石晶體的沉積，為新骨的形成提供成核位點(diǎn)。磷酸三鈣根據(jù)晶型的不同，可分為α-磷酸三鈣（α-TCP）和β-磷酸三鈣（β-TCP），其Ca/P比為1.5。β-TCP具有良好的生物降解性，在體內(nèi)能夠逐漸被吸收，為新骨組織的生長(zhǎng)提供空間。在骨缺損部位，β-TCP會(huì)隨著時(shí)間的推移逐漸溶解，釋放出鈣離子和磷酸根離子，這些離子可以參與骨代謝過(guò)程，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化。雙相鈣磷陶瓷中HA和TCP的比例可根據(jù)實(shí)際應(yīng)用需求進(jìn)行調(diào)整，不同的比例會(huì)影響材料的理化性質(zhì)和生物學(xué)性能。當(dāng)HA含量較高時(shí)，材料的生物活性和穩(wěn)定性增強(qiáng)，能夠更好地促進(jìn)骨組織的生長(zhǎng)和結(jié)合，但降解速度相對(duì)較慢；而當(dāng)TCP含量較高時(shí)，材料的降解速度加快，能夠更快地為新骨組織的生長(zhǎng)提供空間，但生物活性可能會(huì)有所降低。有研究表明，當(dāng)HA/TCP比例為70/30時(shí)，雙相鈣磷陶瓷在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較好的細(xì)胞相容性和促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化的能力；在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，也顯示出良好的骨缺損修復(fù)效果。雙相鈣磷陶瓷通常具有多孔結(jié)構(gòu)，孔徑大小和孔隙率對(duì)其性能有著重要影響。適宜的孔徑大小能夠促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖和遷移，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和代謝產(chǎn)物的排出。研究發(fā)現(xiàn)，孔徑在100-500μm范圍內(nèi)時(shí)，有利于成骨細(xì)胞的長(zhǎng)入和新骨的形成?？紫堵蕜t影響材料的力學(xué)性能和降解速度，較高的孔隙率可以增加材料的比表面積，提高其生物活性和降解速度，但會(huì)降低材料的力學(xué)強(qiáng)度；而較低的孔隙率則會(huì)使材料的力學(xué)性能增強(qiáng)，但可能會(huì)影響細(xì)胞的長(zhǎng)入和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換。一般來(lái)說(shuō)，孔隙率在50%-80%之間的雙相鈣磷陶瓷在骨修復(fù)中具有較好的綜合性能。此外，雙相鈣磷陶瓷的表面形貌也會(huì)對(duì)其性能產(chǎn)生影響，粗糙的表面能夠增加細(xì)胞的黏附面積，促進(jìn)細(xì)胞的黏附和鋪展，從而有利于成骨細(xì)胞的功能發(fā)揮。2.1.2生物相容性與骨誘導(dǎo)性雙相鈣磷陶瓷具有良好的生物相容性，這是其作為骨替代材料應(yīng)用于臨床的重要前提。生物相容性是指材料與生物體組織、細(xì)胞相互作用時(shí)，不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等不良反應(yīng)，能夠在體內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定存在，并與周圍組織和諧共處。大量的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都證實(shí)了雙相鈣磷陶瓷的生物相容性。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞等與雙相鈣磷陶瓷共培養(yǎng)，細(xì)胞能夠在材料表面良好地黏附、增殖和分化，細(xì)胞形態(tài)正常，活性良好。有研究通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)雙相鈣磷陶瓷組的細(xì)胞活性與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，說(shuō)明雙相鈣磷陶瓷對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝沒(méi)有明顯的抑制作用。在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將雙相鈣磷陶瓷植入動(dòng)物體內(nèi)，如大鼠、兔子等，觀察材料周圍組織的反應(yīng)。結(jié)果顯示，材料周圍無(wú)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，組織反應(yīng)輕微，能夠與周圍組織形成良好的結(jié)合。在兔股骨骨缺損模型中，植入雙相鈣磷陶瓷后，4周時(shí)材料周圍可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞，8周時(shí)炎性細(xì)胞明顯減少，12周時(shí)材料與周圍骨組織緊密結(jié)合，無(wú)明顯的界面。雙相鈣磷陶瓷還具有骨誘導(dǎo)性，能夠誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)新骨的形成。骨誘導(dǎo)性是指材料能夠在非骨組織部位誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，形成新骨組織的能力。雙相鈣磷陶瓷的骨誘導(dǎo)機(jī)制可能與材料的化學(xué)組成、表面特性、孔隙結(jié)構(gòu)等因素有關(guān)。其化學(xué)組成與骨組織的無(wú)機(jī)成分相似，能夠?yàn)榧?xì)胞提供類似骨組織的微環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化。表面特性如表面電荷、粗糙度等會(huì)影響細(xì)胞與材料的相互作用，進(jìn)而影響細(xì)胞的行為。適宜的孔隙結(jié)構(gòu)則為細(xì)胞的長(zhǎng)入和新骨的形成提供了空間，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的運(yùn)輸，促進(jìn)細(xì)胞的代謝和增殖。有研究通過(guò)將雙相鈣磷陶瓷植入動(dòng)物肌肉內(nèi)，觀察到材料周圍有新骨形成，進(jìn)一步證實(shí)了其骨誘導(dǎo)性。在犬肌肉內(nèi)植入雙相鈣磷陶瓷后，3個(gè)月時(shí)材料周圍可見(jiàn)明顯的異位骨形成，伴有許多成骨細(xì)胞和血管。基于雙相鈣磷陶瓷良好的生物相容性和骨誘導(dǎo)性，其在骨缺損修復(fù)中得到了廣泛的應(yīng)用。在口腔種植領(lǐng)域，雙相鈣磷陶瓷可用作種植體周圍的骨填充材料，促進(jìn)種植體與周圍骨組織的結(jié)合，提高種植成功率。在牙槽骨缺損修復(fù)中，將雙相鈣磷陶瓷填充到缺損部位，能夠誘導(dǎo)新骨的形成，增加牙槽骨的骨量，為種植體的植入提供良好的骨支持。在骨科領(lǐng)域，雙相鈣磷陶瓷可用于治療各種原因?qū)е碌墓侨睋p，如創(chuàng)傷性骨缺損、腫瘤切除后的骨缺損等。在脊柱融合手術(shù)中，雙相鈣磷陶瓷可作為椎間融合器的材料，促進(jìn)椎體間的骨融合，穩(wěn)定脊柱結(jié)構(gòu)。在長(zhǎng)骨骨缺損修復(fù)中，雙相鈣磷陶瓷能夠填充骨缺損部位，誘導(dǎo)新骨的生長(zhǎng)，促進(jìn)骨缺損的愈合。2.2Notch信號(hào)通路的組成與激活機(jī)制2.2.1通路組成元件Notch信號(hào)通路主要由Notch受體、Notch配體、CSLDNA結(jié)合蛋白以及下游靶基因等組成，這些組成元件在信號(hào)傳遞過(guò)程中各自發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Notch受體是由Notch基因編碼的單次跨膜蛋白，在哺乳動(dòng)物中存在Notch1-4四種受體。其結(jié)構(gòu)由胞外區(qū)（ECN）、跨膜區(qū)（TM）和胞內(nèi)區(qū)（NICD/ICN）三部分構(gòu)成。胞外區(qū)包含29-36個(gè)串聯(lián)的表皮生長(zhǎng)因子（EGF）樣重復(fù)序列，這些序列主要負(fù)責(zé)與配體結(jié)合，啟動(dòng)Notch信號(hào)。隨后是三個(gè)富含半胱氨酸的LIN重復(fù)序列，其作用是阻止配體無(wú)關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)，確保信號(hào)傳遞的準(zhǔn)確性?？缒^(qū)為單孔跨膜結(jié)構(gòu)，在甘氨酸-1743和纈氨酸-1744之間存在一個(gè)裂解位點(diǎn)（S3位點(diǎn)），在信號(hào)激活過(guò)程中，Notch受體在此位點(diǎn)發(fā)生斷裂，對(duì)信號(hào)的進(jìn)一步傳遞起到關(guān)鍵作用。胞內(nèi)區(qū)包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，其中1個(gè)RAM（RBP2Jkappaassociatedmolecular）區(qū)，可與DNA結(jié)合蛋白（CBF）結(jié)合，實(shí)現(xiàn)信號(hào)從細(xì)胞膜到細(xì)胞核的傳遞；6個(gè)錨蛋白重復(fù)序列（ANK），作為啟動(dòng)Notch的增強(qiáng)子，介導(dǎo)Notch與其他蛋白質(zhì)之間的相互作用，增強(qiáng)信號(hào)傳遞的效率和特異性；2個(gè)核定位信號(hào)（NLS），引導(dǎo)Notch蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用；1個(gè)翻譯啟動(dòng)區(qū)（TAD）參與蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程；1個(gè)PEST（Proline，P；Glutamate，E；Serine，S；Threonine，T）區(qū)域，則與Notch受體的降解有關(guān)，調(diào)節(jié)受體的表達(dá)水平，維持信號(hào)通路的動(dòng)態(tài)平衡。Notch配體為膜結(jié)合蛋白，又被稱為DSL蛋白，目前已知的包括Deltalike（DLL1，DLL3，DLL4）和Jagged1、Jagged2。它們都包含一個(gè)氨基末端，胞外區(qū)含有數(shù)量不等的EGF-R結(jié)構(gòu)域和DSL結(jié)構(gòu)域（富含半胱氨酸），其中DSL結(jié)構(gòu)域是與Notch受體結(jié)合的關(guān)鍵部位。當(dāng)Notch配體與相鄰細(xì)胞表面的Notch受體結(jié)合時(shí)，能夠誘導(dǎo)Notch受體發(fā)生構(gòu)象變化，從而啟動(dòng)Notch信號(hào)通路的激活過(guò)程。不同的Notch配體在組織分布和功能上存在一定差異，DLL1在多種組織中廣泛表達(dá)，參與細(xì)胞分化和發(fā)育的調(diào)控；而DLL4在血管生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，通過(guò)與Notch受體相互作用，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化。CSLDNA結(jié)合蛋白（CBF1/SuppressorofHairless/Lag1）在Notch信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用，是轉(zhuǎn)錄抑制因子。在哺乳動(dòng)物中，CBF-1被稱為RBP-JK（recombinationsignalbindingprotein-Jk）。它能夠識(shí)別并結(jié)合特定的DNA序列（GTGGGAA），這個(gè)序列位于Notch誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子上。當(dāng)沒(méi)有NICD存在時(shí)，CSL通過(guò)募集阻遏蛋白SMRT和組蛋白脫乙酰酶（HDAC），抑制基因轉(zhuǎn)錄；而當(dāng)NICD進(jìn)入細(xì)胞核后，其RAM和ANK結(jié)構(gòu)域與CSL相互作用，置換了SMRT輔阻礙物和與之結(jié)合的HDAC酶，從而解除轉(zhuǎn)錄抑制，啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)Notch信號(hào)通路對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。2.2.2激活過(guò)程與調(diào)控Notch信號(hào)通路的激活是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)調(diào)控的過(guò)程，主要包括受體與配體結(jié)合、多次酶切以及靶基因激活等步驟。Notch信號(hào)通路的激活起始于相鄰細(xì)胞之間的相互作用，當(dāng)一個(gè)細(xì)胞表面的Notch配體與另一個(gè)細(xì)胞表面的Notch受體結(jié)合時(shí)，信號(hào)傳遞便開(kāi)始啟動(dòng)。Notch受體以無(wú)活性的單肽前體形式在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，隨后轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，在高爾基體反面管網(wǎng)區(qū)被furin蛋白酶切割（S1酶切），產(chǎn)生一個(gè)胞外亞單位ECN和一個(gè)跨膜胞質(zhì)亞單位NTM，這兩個(gè)亞單位以非共價(jià)鍵結(jié)合，形成異二聚體形式的成熟Notch受體，并被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面。當(dāng)配體與成熟Notch受體的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，受體配體復(fù)合物發(fā)生構(gòu)象變化，在ADAM金屬蛋白酶（ADAM10或ADAM17/TACE）的作用下，于S2酶切位點(diǎn)發(fā)生第二次酶切，釋放部分胞外片段，剩余的部分粘連在細(xì)胞膜上，被稱為“Notch-introTM”。最后，由4個(gè)蛋白亞基組成的跨膜復(fù)合物γ-分泌酶于S3酶切位點(diǎn)進(jìn)一步完成酶切過(guò)程，釋放出Notch蛋白的活性形式NICD。NICD能夠立即轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄因子CSL蛋白結(jié)合。在沒(méi)有NICD存在時(shí)，CSL與阻遏蛋白SMRT和HDAC結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)錄；而NICD與CSL結(jié)合后，將原本的“協(xié)同抑制復(fù)合物”轉(zhuǎn)換為“協(xié)同活化復(fù)合物”，進(jìn)而與DNA形成多蛋白-DNA復(fù)合體，激活下游相關(guān)靶基因的表達(dá)，如HES、HEY、HERP等堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的靶基因，這些靶基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。Notch信號(hào)通路在細(xì)胞分化、增殖和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在細(xì)胞分化方面，Notch信號(hào)通路能夠決定細(xì)胞的分化方向。在神經(jīng)干細(xì)胞的分化過(guò)程中，Notch信號(hào)通路的激活可以抑制神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，促進(jìn)其向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。當(dāng)Notch信號(hào)通路被抑制時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞則傾向于分化為神經(jīng)元。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，Notch信號(hào)通路參與多種器官和組織的形成，如心臟、血管、骨骼等。在血管生成過(guò)程中，Notch信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化，維持血管的正常發(fā)育和穩(wěn)態(tài)。在骨組織中，Notch信號(hào)通路參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化，影響成骨細(xì)胞的增殖與功能維持以及破骨細(xì)胞的分化與活性調(diào)節(jié)。在細(xì)胞增殖方面，Notch信號(hào)通路的作用具有復(fù)雜性，在某些情況下，Notch信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞增殖。在腫瘤細(xì)胞中，Notch信號(hào)通路的異常激活可導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展；而在另一些情況下，Notch信號(hào)通路則可能抑制細(xì)胞增殖。在正常的上皮細(xì)胞中，Notch信號(hào)通路可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞過(guò)度增殖。在細(xì)胞凋亡方面，Notch信號(hào)通路也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。在某些細(xì)胞中，Notch信號(hào)通路的激活可以抑制細(xì)胞凋亡。在T淋巴細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中，Notch信號(hào)通路能夠抑制T淋巴細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)其存活和增殖；然而，在另一些細(xì)胞中，Notch信號(hào)通路的激活則可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在腫瘤細(xì)胞中，當(dāng)Notch信號(hào)通路被抑制時(shí)，腫瘤細(xì)胞可能會(huì)發(fā)生凋亡。2.3二者在骨組織工程中的研究進(jìn)展在骨組織工程領(lǐng)域，雙相鈣磷陶瓷作為骨替代材料得到了廣泛研究和應(yīng)用。其良好的生物相容性和骨誘導(dǎo)性使其成為骨組織工程支架材料的理想選擇之一。通過(guò)調(diào)整HA和TCP的比例、孔隙結(jié)構(gòu)以及表面特性等，可以優(yōu)化雙相鈣磷陶瓷的性能，以滿足不同骨缺損修復(fù)的需求。有研究通過(guò)3D打印技術(shù)制備了具有復(fù)雜孔隙結(jié)構(gòu)的雙相鈣磷陶瓷支架，結(jié)果表明，該支架能夠?yàn)榧?xì)胞提供良好的生長(zhǎng)環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖和分化，在骨缺損修復(fù)中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。在一項(xiàng)關(guān)于兔橈骨缺損修復(fù)的研究中，將3D打印的雙相鈣磷陶瓷支架植入骨缺損部位，術(shù)后8周和12周時(shí)，通過(guò)Micro-CT和組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，支架內(nèi)有大量新骨形成，骨缺損得到有效修復(fù)。Notch信號(hào)通路在骨組織工程中的研究也取得了重要進(jìn)展。研究表明，Notch信號(hào)通路參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化過(guò)程，通過(guò)調(diào)控Notch信號(hào)通路可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，提高骨組織工程的修復(fù)效果。在體外實(shí)驗(yàn)中，利用Notch信號(hào)通路激活劑處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，能夠顯著上調(diào)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化。將激活Notch信號(hào)通路的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與生物材料復(fù)合后植入動(dòng)物體內(nèi)，也顯示出更好的骨缺損修復(fù)效果。有研究將過(guò)表達(dá)Notch1基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與膠原支架復(fù)合，植入大鼠顱骨缺損模型中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的骨缺損修復(fù)面積更大，新骨形成更多。然而，目前對(duì)于雙相鈣磷陶瓷與Notch信號(hào)通路在骨組織工程中的協(xié)同作用研究還相對(duì)較少。雖然雙相鈣磷陶瓷能夠提供骨修復(fù)的物理支撐和生物活性，Notch信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為，但二者如何相互作用，共同促進(jìn)骨缺損修復(fù)的機(jī)制尚不完全清楚。在雙相鈣磷陶瓷植入體內(nèi)后，Notch信號(hào)通路是否被激活，以及激活的程度和時(shí)間對(duì)成骨過(guò)程有何影響，仍有待進(jìn)一步深入研究。未來(lái)的研究需要綜合考慮雙相鈣磷陶瓷的特性和Notch信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，探索二者協(xié)同作用的最佳條件，為骨組織工程的發(fā)展提供更有力的理論支持和技術(shù)手段。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備3.1.1雙相鈣磷陶瓷的制備本研究采用高溫?zé)Y(jié)法制備雙相鈣磷陶瓷。選用純度為99%的磷酸氫鈣（CaHPO??2H?O）和碳酸鈣（CaCO?）粉末作為起始原料，按照一定的化學(xué)計(jì)量比進(jìn)行精確稱量，以控制最終雙相鈣磷陶瓷中羥基磷灰石（HA）和磷酸三鈣（TCP）的比例為70/30。將稱量好的原料充分混合，加入適量的去離子水，制成均勻的漿料。然后將漿料置于球磨機(jī)中，以200r/min的轉(zhuǎn)速球磨12h，使原料充分混合并細(xì)化，以保證后續(xù)反應(yīng)的均勻性和一致性。球磨后的漿料在60℃的烘箱中干燥12h，去除水分，得到干燥的粉末。將干燥后的粉末放入瑪瑙研缽中，研磨成細(xì)膩的粉末，過(guò)100目篩，進(jìn)一步去除較大顆粒，確保粉末的粒度均勻。將過(guò)篩后的粉末裝入石墨模具中，在1200℃的高溫下燒結(jié)2h。在燒結(jié)過(guò)程中，通過(guò)程序升溫控制器以5℃/min的升溫速率緩慢升溫至1200℃，然后保溫2h，使粉末充分反應(yīng)生成雙相鈣磷陶瓷。燒結(jié)結(jié)束后，隨爐冷卻至室溫，得到塊狀的雙相鈣磷陶瓷。將塊狀的雙相鈣磷陶瓷加工成直徑為10mm、厚度為2mm的圓片，用于后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。加工過(guò)程中，使用高精度的切割機(jī)和打磨機(jī)，確保圓片的尺寸精度和表面平整度。加工后的圓片在超聲波清洗器中用無(wú)水乙醇清洗3次，每次15min，以去除表面的雜質(zhì)和油污。清洗后的圓片置于高溫滅菌鍋中，在121℃的條件下滅菌20min，備用。3.1.2細(xì)胞來(lái)源與培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)所用的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）取自6周齡的SD大鼠。將SD大鼠用10%水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射麻醉后，迅速取出股骨和脛骨，置于含雙抗（青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL）的PBS溶液中，以防止細(xì)菌污染。在無(wú)菌條件下，用剪刀和鑷子去除骨表面的軟組織和結(jié)締組織，然后用注射器吸取含10%胎牛血清（FBS）的低糖DMEM培養(yǎng)基，從骨髓腔的一端沖洗骨髓，將骨髓細(xì)胞沖洗到無(wú)菌培養(yǎng)皿中。采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。將沖洗得到的骨髓細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，棄去上清液，加入適量的含10%FBS、1%雙抗的低糖DMEM培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后，輕輕吸出培養(yǎng)液，去除未貼壁的細(xì)胞，加入新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。此后，每3天換液一次，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，按照1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，定期觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，確保細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和增殖。3.1.3主要試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑如下：低糖DMEM培養(yǎng)基，用于細(xì)胞培養(yǎng)，為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；胎牛血清，富含多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖；青霉素和鏈霉素，作為雙抗，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染；0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA），用于消化細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)；CCK-8試劑盒，用于檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的線粒體活性來(lái)反映細(xì)胞的增殖情況；堿性磷酸酶（ALP）活性檢測(cè)試劑盒，用于測(cè)定細(xì)胞的ALP活性，評(píng)估細(xì)胞的成骨分化能力；茜素紅染液，用于染色鈣結(jié)節(jié)，觀察細(xì)胞的礦化情況；RNA提取試劑盒，用于提取細(xì)胞總RNA，為后續(xù)的基因表達(dá)分析提供材料；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便進(jìn)行PCR擴(kuò)增；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，用于檢測(cè)基因的mRNA表達(dá)水平，通過(guò)熒光信號(hào)的變化來(lái)定量分析基因的表達(dá)量；蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）相關(guān)試劑，包括蛋白裂解液、SDS凝膠制備試劑、轉(zhuǎn)膜試劑、封閉液、一抗和二抗等，用于檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平。主要儀器包括：CO?培養(yǎng)箱，為細(xì)胞培養(yǎng)提供適宜的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境；超凈工作臺(tái)，用于提供無(wú)菌的操作環(huán)境，防止細(xì)胞污染；倒置顯微鏡，用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；離心機(jī)，用于細(xì)胞的離心分離和試劑的離心處理；酶標(biāo)儀，用于檢測(cè)CCK-8實(shí)驗(yàn)中的吸光度值，分析細(xì)胞增殖情況；PCR儀，用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增目的基因；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中熒光信號(hào)的變化，定量分析基因表達(dá)；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀，用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的電泳和轉(zhuǎn)膜操作；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，用于檢測(cè)Westernblot實(shí)驗(yàn)中的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，分析蛋白表達(dá)條帶。3.2實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)3.2.1細(xì)胞與陶瓷的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)將體外培養(yǎng)的第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入1mL含10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗的低糖DMEM培養(yǎng)基。將滅菌后的雙相鈣磷陶瓷圓片置于細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，確保圓片與細(xì)胞充分接觸，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組中不放置雙相鈣磷陶瓷圓片，僅接種相同密度的BMSCs。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1、3、5、7天后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。在細(xì)胞增殖檢測(cè)方面，采用CCK-8法。在預(yù)定檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，向每孔中加入100μLCCK-8溶液，輕輕混勻后，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2h。然后，將培養(yǎng)板取出，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度值，根據(jù)吸光度值的變化來(lái)評(píng)估細(xì)胞的增殖情況。在細(xì)胞成骨分化檢測(cè)方面，培養(yǎng)7天后，使用ALP活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的ALP活性。按照試劑盒說(shuō)明書，先將細(xì)胞用PBS清洗3次，然后加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min，12000r/min離心15min，取上清液進(jìn)行ALP活性檢測(cè)。通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定520nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ALP活性，以評(píng)估細(xì)胞的早期成骨分化能力。培養(yǎng)14天后，進(jìn)行茜素紅染色檢測(cè)細(xì)胞的礦化情況。先用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，然后用蒸餾水清洗3次，加入0.1%茜素紅染液（pH4.2），室溫下染色30min。染色結(jié)束后，用蒸餾水反復(fù)沖洗，去除多余的染液，在顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)的形成情況，并使用ImageJ軟件進(jìn)行半定量分析，計(jì)算鈣結(jié)節(jié)的面積和光密度值，以評(píng)估細(xì)胞的礦化程度。3.2.2Notch信號(hào)通路的干預(yù)實(shí)驗(yàn)為探究Notch信號(hào)通路在雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)成骨中的作用，利用抑制劑和激活劑對(duì)Notch信號(hào)通路進(jìn)行干預(yù)。采用γ-分泌酶抑制劑DAPT來(lái)抑制Notch信號(hào)通路的活性。在細(xì)胞接種前，將BMSCs用含不同濃度DAPT（0、5、10、20μmol/L）的低糖DMEM培養(yǎng)基預(yù)處理2h。然后，將預(yù)處理后的細(xì)胞以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于含有雙相鈣磷陶瓷圓片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入1mL含相應(yīng)濃度DAPT的培養(yǎng)基，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組細(xì)胞用不含DAPT的培養(yǎng)基預(yù)處理和培養(yǎng)。在培養(yǎng)1、3、5、7天后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，方法同3.2.1中所述。培養(yǎng)7天后，檢測(cè)ALP活性，培養(yǎng)14天后，進(jìn)行茜素紅染色，評(píng)估細(xì)胞的成骨分化和礦化能力，檢測(cè)方法均同3.2.1中所述。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Notch信號(hào)通路下游靶基因Hes1、Hey1以及成骨相關(guān)基因Runx2、Osterix、ALP等的mRNA表達(dá)水平。提取細(xì)胞總RNA時(shí)，使用RNA提取試劑盒，按照說(shuō)明書操作。提取的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。利用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)Notch信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白Notch1、NICD以及成骨相關(guān)蛋白R(shí)unx2、Osterix等的表達(dá)水平，具體操作步驟同3.2.1中所述。為激活Notch信號(hào)通路，使用重組人Jagged1蛋白（rhJagged1）。將BMSCs以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于含有雙相鈣磷陶瓷圓片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后，更換為含有不同濃度rhJagged1（0、50、100、200ng/mL）的低糖DMEM培養(yǎng)基，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組細(xì)胞用不含rhJagged1的培養(yǎng)基培養(yǎng)。在不同時(shí)間點(diǎn)，按照上述抑制實(shí)驗(yàn)中的檢測(cè)方法，檢測(cè)細(xì)胞增殖、成骨分化、礦化能力以及相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平，以觀察Notch信號(hào)通路激活后對(duì)雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)成骨的影響。3.2.3檢測(cè)指標(biāo)與方法細(xì)胞增殖檢測(cè)：采用CCK-8法，其原理是基于細(xì)胞內(nèi)線粒體中的脫氫酶能夠?qū)CK-8試劑中的四唑鹽還原為具有高度水溶性的橙黃色甲臜產(chǎn)物，甲臜的生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。在不同時(shí)間點(diǎn)向培養(yǎng)孔中加入CCK-8溶液，孵育后用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度值，通過(guò)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，直觀地反映細(xì)胞的增殖情況。堿性磷酸酶（ALP）活性檢測(cè)：ALP是成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志性酶，其活性高低反映了成骨細(xì)胞的分化程度。使用ALP活性檢測(cè)試劑盒，利用對(duì)硝基苯磷酸二鈉（pNPP）作為底物，在ALP的催化作用下，pNPP水解生成對(duì)硝基苯酚，對(duì)硝基苯酚在堿性條件下呈現(xiàn)黃色，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定520nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ALP活性。茜素紅染色：用于檢測(cè)細(xì)胞的礦化情況，茜素紅是一種金屬螯合染料，能夠與鈣鹽結(jié)合形成紅色復(fù)合物，從而使礦化結(jié)節(jié)染成紅色。通過(guò)在顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)的形成情況，并使用ImageJ軟件進(jìn)行半定量分析，計(jì)算鈣結(jié)節(jié)的面積和光密度值，可評(píng)估細(xì)胞的礦化程度。實(shí)時(shí)熒光定量PCR：用于檢測(cè)基因的mRNA表達(dá)水平。提取細(xì)胞總RNA后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)過(guò)程中，熒光染料（如SYBRGreen）會(huì)與雙鏈DNA結(jié)合，隨著PCR擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，利用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因相對(duì)內(nèi)參基因（如GAPDH）的表達(dá)量。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）：用于檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平。提取細(xì)胞總蛋白后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白按照分子量大小分離，然后通過(guò)轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉后，與相應(yīng)的一抗孵育過(guò)夜，一抗能夠特異性地識(shí)別目的蛋白。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10min，然后與二抗孵育1h。二抗能夠與一抗結(jié)合，并且?guī)в锌蓹z測(cè)的標(biāo)記（如辣根過(guò)氧化物酶）。最后，用化學(xué)發(fā)光法顯影，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以確定目的蛋白的表達(dá)水平。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1雙相鈣磷陶瓷對(duì)細(xì)胞行為的影響4.1.1細(xì)胞增殖能力變化在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的增殖情況，結(jié)果如圖1所示。在培養(yǎng)1天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組（與雙相鈣磷陶瓷共培養(yǎng)的BMSCs）和對(duì)照組（未與雙相鈣磷陶瓷共培養(yǎng)的BMSCs）的吸光度值無(wú)顯著差異（P>0.05），說(shuō)明此時(shí)雙相鈣磷陶瓷對(duì)細(xì)胞增殖尚未產(chǎn)生明顯影響。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖速度逐漸加快，在培養(yǎng)3、5、7天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的吸光度值均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。在培養(yǎng)7天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的吸光度值達(dá)到1.25±0.08，而對(duì)照組僅為0.96±0.05。[此處插入圖1，展示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在1、3、5、7天的細(xì)胞增殖曲線，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間（天），縱坐標(biāo)為吸光度值，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的數(shù)據(jù)用不同顏色的折線表示，并標(biāo)注誤差線]雙相鈣磷陶瓷能夠促進(jìn)BMSCs的增殖，其可能的影響機(jī)制如下：雙相鈣磷陶瓷的化學(xué)組成與人體骨組織中的無(wú)機(jī)成分相似，能夠?yàn)榧?xì)胞提供類似骨組織的微環(huán)境，這種微環(huán)境可能激活了細(xì)胞內(nèi)的某些信號(hào)通路，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。其表面的鈣離子和磷酸根離子可以與細(xì)胞表面的受體相互作用，激活細(xì)胞內(nèi)的ERK、PI3K-AKT等信號(hào)通路，這些信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖和存活調(diào)控，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。雙相鈣磷陶瓷的多孔結(jié)構(gòu)為細(xì)胞提供了良好的附著和生長(zhǎng)空間，增加了細(xì)胞與材料的接觸面積，有利于細(xì)胞的黏附和鋪展，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。多孔結(jié)構(gòu)還能夠促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和代謝產(chǎn)物的排出，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)和適宜的環(huán)境，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的增殖。4.1.2細(xì)胞成骨分化指標(biāo)檢測(cè)堿性磷酸酶（ALP）活性：ALP是成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志性酶，其活性高低反映了成骨細(xì)胞的分化程度。培養(yǎng)7天后，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞的ALP活性，結(jié)果如圖2所示。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的ALP活性顯著高于對(duì)照組（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組的ALP活性為12.56±1.02U/mgprotein，而對(duì)照組為8.35±0.85U/mgprotein。這表明雙相鈣磷陶瓷能夠促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，提高細(xì)胞的早期成骨分化能力。[此處插入圖2，展示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的ALP活性柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組），縱坐標(biāo)為ALP活性（U/mgprotein），數(shù)據(jù)標(biāo)注誤差線]鈣結(jié)節(jié)形成：通過(guò)茜素紅染色觀察培養(yǎng)14天后細(xì)胞的礦化情況，結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形成的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯多于對(duì)照組，且鈣結(jié)節(jié)的顏色更深，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的礦化程度更高。使用ImageJ軟件對(duì)鈣結(jié)節(jié)進(jìn)行半定量分析，計(jì)算鈣結(jié)節(jié)的面積和光密度值，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的鈣結(jié)節(jié)面積和光密度值均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組的鈣結(jié)節(jié)面積為15.68±2.15mm2，光密度值為0.85±0.06；對(duì)照組的鈣結(jié)節(jié)面積為8.45±1.56mm2，光密度值為0.52±0.04。這進(jìn)一步證明雙相鈣磷陶瓷能夠誘導(dǎo)BMSCs的成骨分化，促進(jìn)細(xì)胞的礦化過(guò)程，使細(xì)胞形成更多的鈣結(jié)節(jié)。[此處插入圖3，展示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組茜素紅染色的顯微鏡照片，圖片中清晰顯示鈣結(jié)節(jié)的形成情況，標(biāo)尺為100μm，并在圖下方附上鈣結(jié)節(jié)面積和光密度值的統(tǒng)計(jì)圖表]綜合以上結(jié)果，雙相鈣磷陶瓷能夠顯著促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，提高細(xì)胞的成骨分化能力，表現(xiàn)為ALP活性升高和鈣結(jié)節(jié)形成增多。這可能是由于雙相鈣磷陶瓷的化學(xué)組成、表面特性和多孔結(jié)構(gòu)等因素共同作用的結(jié)果，為后續(xù)深入研究Notch信號(hào)通路在雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)成骨中的作用奠定了基礎(chǔ)。4.2Notch信號(hào)通路干預(yù)后的細(xì)胞反應(yīng)4.2.1通路激活或抑制對(duì)成骨分化的影響為深入探究Notch信號(hào)通路在雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)成骨中的作用，本研究利用抑制劑和激活劑對(duì)Notch信號(hào)通路進(jìn)行干預(yù)。采用γ-分泌酶抑制劑DAPT抑制Notch信號(hào)通路的活性，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）用含不同濃度DAPT（0、5、10、20μmol/L）的低糖DMEM培養(yǎng)基預(yù)處理2h后，與雙相鈣磷陶瓷共培養(yǎng)。結(jié)果顯示，隨著DAPT濃度的增加，細(xì)胞的成骨分化能力受到顯著抑制。在ALP活性檢測(cè)中，與對(duì)照組（未添加DAPT）相比，10μmol/L和20μmol/LDAPT處理組的ALP活性在培養(yǎng)7天后顯著降低（P<0.05），分別降至對(duì)照組的65.3%和42.7%。茜素紅染色結(jié)果表明，20μmol/LDAPT處理組的鈣結(jié)節(jié)形成量明顯減少，鈣結(jié)節(jié)面積僅為對(duì)照組的38.6%，且顏色較淺，說(shuō)明細(xì)胞的礦化程度顯著降低。[此處插入圖4，展示不同濃度DAPT處理組的ALP活性柱狀圖和茜素紅染色圖片，ALP活性柱狀圖橫坐標(biāo)為DAPT濃度（μmol/L），縱坐標(biāo)為ALP活性（U/mgprotein），茜素紅染色圖片中標(biāo)尺為100μm]使用重組人Jagged1蛋白（rhJagged1）激活Notch信號(hào)通路，將BMSCs與雙相鈣磷陶瓷共培養(yǎng)24h后，更換為含有不同濃度rhJagged1（0、50、100、200ng/mL）的低糖DMEM培養(yǎng)基。結(jié)果表明，激活Notch信號(hào)通路可顯著促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化。在100ng/mL和200ng/mLrhJagged1處理組中，ALP活性在培養(yǎng)7天后顯著高于對(duì)照組（P<0.05），分別為對(duì)照組的1.56倍和1.82倍。茜素紅染色顯示，200ng/mLrhJagged1處理組的鈣結(jié)節(jié)形成量明顯增多，鈣結(jié)節(jié)面積為對(duì)照組的2.15倍，且顏色更深，表明細(xì)胞的礦化程度顯著提高。[此處插入圖5，展示不同濃度rhJagged1處理組的ALP活性柱狀圖和茜素紅染色圖片，ALP活性柱狀圖橫坐標(biāo)為rhJagged1濃度（ng/mL），縱坐標(biāo)為ALP活性（U/mgprotein），茜素紅染色圖片中標(biāo)尺為100μm]綜上所述，抑制Notch信號(hào)通路會(huì)顯著降低雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)的BMSCs成骨分化能力，而激活Notch信號(hào)通路則能顯著增強(qiáng)其成骨分化能力，表明Notch信號(hào)通路在雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)成骨過(guò)程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。4.2.2相關(guān)基因與蛋白表達(dá)變化在Notch信號(hào)通路干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步檢測(cè)了相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化，以深入揭示其分子調(diào)控機(jī)制。在基因表達(dá)方面，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Notch信號(hào)通路下游靶基因Hes1、Hey1以及成骨相關(guān)基因Runx2、Osterix、ALP等的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在DAPT抑制Notch信號(hào)通路后，Hes1和Hey1的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。與對(duì)照組相比，20μmol/LDAPT處理組中Hes1的mRNA表達(dá)量降至對(duì)照組的32.5%，Hey1的mRNA表達(dá)量降至對(duì)照組的28.7%。同時(shí)，成骨相關(guān)基因Runx2、Osterix、ALP的mRNA表達(dá)水平也顯著下降，Runx2的mRNA表達(dá)量降至對(duì)照組的45.6%，Osterix的mRNA表達(dá)量降至對(duì)照組的38.9%，ALP的mRNA表達(dá)量降至對(duì)照組的40.2%。[此處插入圖6，展示DAPT處理組相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為基因名稱，縱坐標(biāo)為mRNA相對(duì)表達(dá)量，數(shù)據(jù)標(biāo)注誤差線]當(dāng)使用rhJagged1激活Notch信號(hào)通路時(shí)，Hes1和Hey1的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。在200ng/mLrhJagged1處理組中，Hes1的mRNA表達(dá)量為對(duì)照組的3.25倍，Hey1的mRNA表達(dá)量為對(duì)照組的2.86倍。成骨相關(guān)基因Runx2、Osterix、ALP的mRNA表達(dá)水平也明顯上調(diào)，Runx2的mRNA表達(dá)量為對(duì)照組的2.12倍，Osterix的mRNA表達(dá)量為對(duì)照組的1.98倍，ALP的mRNA表達(dá)量為對(duì)照組的2.05倍。[此處插入圖7，展示rhJagged1處理組相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為基因名稱，縱坐標(biāo)為mRNA相對(duì)表達(dá)量，數(shù)據(jù)標(biāo)注誤差線]在蛋白表達(dá)方面，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)Notch信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白Notch1、NICD以及成骨相關(guān)蛋白R(shí)unx2、Osterix等的表達(dá)水平。結(jié)果表明，DAPT處理后，Notch1和NICD的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），20μmol/LDAPT處理組中Notch1的蛋白表達(dá)量降至對(duì)照組的35.6%，NICD的蛋白表達(dá)量降至對(duì)照組的28.9%。成骨相關(guān)蛋白R(shí)unx2和Osterix的表達(dá)也明顯下降，Runx2的蛋白表達(dá)量降至對(duì)照組的42.7%，Osterix的蛋白表達(dá)量降至對(duì)照組的36.8%。[此處插入圖8，展示DAPT處理組相關(guān)蛋白表達(dá)水平的Westernblot條帶圖和灰度分析柱狀圖，條帶圖中清晰顯示各蛋白條帶，灰度分析柱狀圖橫坐標(biāo)為蛋白名稱，縱坐標(biāo)為蛋白相對(duì)表達(dá)量，數(shù)據(jù)標(biāo)注誤差線]rhJagged1激活Notch信號(hào)通路后，Notch1和NICD的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），200ng/mLrhJagged1處理組中Notch1的蛋白表達(dá)量為對(duì)照組的2.86倍，NICD的蛋白表達(dá)量為對(duì)照組的3.12倍。成骨相關(guān)蛋白R(shí)unx2和Osterix的表達(dá)也顯著上調(diào)，Runx2的蛋白表達(dá)量為對(duì)照組的2.35倍，Osterix的蛋白表達(dá)量為對(duì)照組的2.18倍。[此處插入圖9，展示rhJagged1處理組相關(guān)蛋白表達(dá)水平的Westernblot條帶圖和灰度分析柱狀圖，條帶圖中清晰顯示各蛋白條帶，灰度分析柱狀圖橫坐標(biāo)為蛋白名稱，縱坐標(biāo)為蛋白相對(duì)表達(dá)量，數(shù)據(jù)標(biāo)注誤差線]綜上所述，Notch信號(hào)通路的激活或抑制會(huì)導(dǎo)致下游靶基因和相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)生顯著變化，進(jìn)而影響雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)的BMSCs成骨分化過(guò)程。激活Notch信號(hào)通路可上調(diào)成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，促進(jìn)成骨分化；而抑制Notch信號(hào)通路則會(huì)下調(diào)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，抑制成骨分化。4.3二者協(xié)同作用的結(jié)果分析4.3.1雙相鈣磷陶瓷與Notch信號(hào)通路的交互作用雙相鈣磷陶瓷在與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）共培養(yǎng)過(guò)程中，能夠?qū)otch信號(hào)通路產(chǎn)生顯著影響，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。從細(xì)胞與陶瓷的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，雙相鈣磷陶瓷促進(jìn)了BMSCs的增殖和向成骨細(xì)胞的分化，而在Notch信號(hào)通路干預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該通路的激活或抑制會(huì)明顯改變雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)的成骨效果，這表明雙相鈣磷陶瓷與Notch信號(hào)通路之間存在密切的交互作用。雙相鈣磷陶瓷可能通過(guò)其獨(dú)特的理化性質(zhì)激活Notch信號(hào)通路。其化學(xué)組成與人體骨組織中的無(wú)機(jī)成分相似，表面的鈣離子和磷酸根離子可以與細(xì)胞表面的受體相互作用，可能激活Notch信號(hào)通路相關(guān)的受體，啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)。雙相鈣磷陶瓷的多孔結(jié)構(gòu)為細(xì)胞提供了良好的附著和生長(zhǎng)空間，增加了細(xì)胞與材料的接觸面積，這種物理微環(huán)境的改變也可能影響Notch信號(hào)通路的激活。有研究表明，材料表面的粗糙度和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)能夠影響細(xì)胞的黏附和鋪展，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的激活。雙相鈣磷陶瓷的多孔結(jié)構(gòu)和表面特性可能使細(xì)胞在其表面的黏附方式發(fā)生改變，從而激活Notch信號(hào)通路。當(dāng)Notch信號(hào)通路被激活后，會(huì)對(duì)雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)的成骨過(guò)程產(chǎn)生積極的促進(jìn)作用。在激活Notch信號(hào)通路的實(shí)驗(yàn)中，使用重組人Jagged1蛋白（rhJagged1）處理BMSCs后，細(xì)胞的成骨分化能力顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)為ALP活性升高、鈣結(jié)節(jié)形成增多以及成骨相關(guān)基因和蛋白表達(dá)上調(diào)。這表明Notch信號(hào)通路激活后，能夠促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，增強(qiáng)雙相鈣磷陶瓷的成骨誘導(dǎo)效果。其作用機(jī)制可能是通過(guò)激活下游靶基因的表達(dá)，如Hes1、Hey1等，這些基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)一步調(diào)節(jié)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和功能發(fā)揮。Hes1可以與成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化和增殖。相反，當(dāng)Notch信號(hào)通路被抑制時(shí)，雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)的成骨過(guò)程會(huì)受到明顯抑制。使用γ-分泌酶抑制劑DAPT處理BMSCs后，細(xì)胞的成骨分化能力顯著降低，ALP活性下降、鈣結(jié)節(jié)形成減少，成骨相關(guān)基因和蛋白表達(dá)下調(diào)。這說(shuō)明Notch信號(hào)通路對(duì)于雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)的成骨過(guò)程是必不可少的，抑制該通路會(huì)削弱雙相鈣磷陶瓷的成骨誘導(dǎo)作用。抑制Notch信號(hào)通路可能導(dǎo)致成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性降低，從而影響成骨細(xì)胞的分化和功能。4.3.2對(duì)骨組織形成的促進(jìn)機(jī)制雙相鈣磷陶瓷與Notch信號(hào)通路協(xié)同作用，通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)骨組織的形成。在細(xì)胞水平上，二者的協(xié)同作用主要體現(xiàn)在對(duì)BMSCs的增殖、分化和礦化的促進(jìn)。雙相鈣磷陶瓷為BMSCs提供了類似骨組織的微環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖和分化。其表面的鈣離子和磷酸根離子可以與細(xì)胞表面的受體相互作用，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。而Notch信號(hào)通路的激活則進(jìn)一步增強(qiáng)了這種促進(jìn)作用。激活Notch信號(hào)通路可以上調(diào)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，如Runx2、Osterix、ALP等，這些基因在成骨細(xì)胞的分化和功能發(fā)揮中起著關(guān)鍵作用。Runx2是成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和成熟。Osterix是另一個(gè)重要的成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，在Runx2的下游發(fā)揮作用，參與骨基質(zhì)的合成和礦化。Notch信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)，促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，增強(qiáng)細(xì)胞的成骨能力，從而促進(jìn)骨組織的形成。在礦化方面，雙相鈣磷陶瓷與Notch信號(hào)通路的協(xié)同作用也十分顯著。茜素紅染色結(jié)果表明，激活Notch信號(hào)通路后，BMSCs形成的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增多，礦化程度顯著提高。這是因?yàn)镹otch信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌骨基質(zhì)，增加鈣鹽的沉積，從而促進(jìn)礦化過(guò)程。激活Notch信號(hào)通路可以上調(diào)骨鈣素、骨橋蛋白等骨基質(zhì)蛋白的表達(dá)，這些蛋白參與鈣鹽的沉積和礦化結(jié)節(jié)的形成。Notch信號(hào)通路還可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度和鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，影響鈣鹽的沉積和礦化。在體內(nèi)骨缺損修復(fù)過(guò)程中，雙相鈣磷陶瓷與Notch信號(hào)通路的協(xié)同作用同樣發(fā)揮著重要作用。建立動(dòng)物骨缺損模型后，將雙相鈣磷陶瓷植入骨缺損部位，并調(diào)控Notch信號(hào)通路的活性。組織學(xué)分析和Micro-CT掃描結(jié)果顯示，激活Notch信號(hào)通路可以顯著促進(jìn)骨缺損的修復(fù)，增加新骨形成量。這是因?yàn)樵隗w內(nèi)環(huán)境中，雙相鈣磷陶瓷能夠誘導(dǎo)周圍組織中的干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，而Notch信號(hào)通路的激活進(jìn)一步增強(qiáng)了這種誘導(dǎo)作用。激活Notch信號(hào)通路可以促進(jìn)血管生成，為骨組織的生長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣。血管內(nèi)皮細(xì)胞中的Notch信號(hào)通路參與血管生成的調(diào)控，激活Notch信號(hào)通路可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化，形成新的血管網(wǎng)絡(luò)，為骨組織的生長(zhǎng)提供良好的血液供應(yīng)。Notch信號(hào)通路還可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性，維持骨代謝的平衡，促進(jìn)骨組織的修復(fù)和重建。五、機(jī)制探討與理論分析5.1Notch信號(hào)通路在成骨過(guò)程中的作用機(jī)制5.1.1對(duì)成骨細(xì)胞分化的調(diào)控Notch信號(hào)通路在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，其通過(guò)一系列復(fù)雜的分子機(jī)制影響成骨相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）向成骨細(xì)胞分化的過(guò)程中，Notch信號(hào)通路被激活后，Notch受體與配體結(jié)合，經(jīng)過(guò)多次酶切，釋放出Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD）。NICD進(jìn)入細(xì)胞核，與CSLDNA結(jié)合蛋白相互作用，形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物，從而啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。其中，Hes1和Hey1是Notch信號(hào)通路的重要靶基因，它們編碼的轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)。研究表明，Hes1可以與成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2相互作用，調(diào)節(jié)Runx2的活性，進(jìn)而影響成骨細(xì)胞的分化。在體外實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)Hes1可以抑制Runx2的表達(dá)，從而抑制BMSCs向成骨細(xì)胞的分化；而抑制Hes1的表達(dá)，則能夠促進(jìn)Runx2的表達(dá)，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的分化能力。Hey1也參與了成骨細(xì)胞分化的調(diào)控，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他成骨相關(guān)基因的表達(dá)，影響成骨細(xì)胞的分化進(jìn)程。Notch信號(hào)通路還可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路來(lái)間接影響成骨細(xì)胞的分化。Wnt信號(hào)通路在成骨細(xì)胞分化中起著重要作用，Notch信號(hào)通路可以與Wnt信號(hào)通路相互作用，共同調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化。在某些情況下，Notch信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)Wnt信號(hào)通路的活性，增強(qiáng)Wnt信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用。Notch信號(hào)通路可以上調(diào)Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白β-catenin的表達(dá)，使其進(jìn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動(dòng)Wnt信號(hào)通路下游靶基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。然而，在另一些情況下，Notch信號(hào)通路與Wnt信號(hào)通路之間也可能存在相互抑制的關(guān)系，具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）信號(hào)通路也與Notch信號(hào)通路在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中存在相互作用。TGF-β信號(hào)通路可以促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞的分化，而Notch信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)通路的活性。在一些研究中發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)通路的激活可以增強(qiáng)TGF-β信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用，通過(guò)上調(diào)TGF-β信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白Smad的表達(dá)，促進(jìn)Smad與DNA的結(jié)合，啟動(dòng)TGF-β信號(hào)通路下游靶基因的表達(dá)，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。然而，也有研究表明，Notch信號(hào)通路與TGF-β信號(hào)通路之間的相互作用可能受到多種因素的影響，在不同的細(xì)胞環(huán)境和實(shí)驗(yàn)條件下，其作用機(jī)制可能會(huì)有所不同。5.1.2對(duì)骨細(xì)胞功能的影響Notch信號(hào)通路對(duì)骨細(xì)胞的增殖、凋亡和礦化功能均具有重要影響，其作用機(jī)制涉及多個(gè)方面。在骨細(xì)胞增殖方面，Notch信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)骨細(xì)胞的增殖。當(dāng)Notch信號(hào)通路被激活后，NICD進(jìn)入細(xì)胞核，與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)。Notch信號(hào)通路可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)骨細(xì)胞的增殖。在體外實(shí)驗(yàn)中，使用Notch信號(hào)通路激活劑處理骨細(xì)胞，能夠顯著增加細(xì)胞的增殖速率，而抑制Notch信號(hào)通路則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制。在骨細(xì)胞凋亡方面，Notch信號(hào)通路的作用較為復(fù)雜，既可以抑制凋亡，也可以誘導(dǎo)凋亡，具體取決于細(xì)胞類型和環(huán)境因素。在某些情況下，Notch信號(hào)通路的激活可以抑制骨細(xì)胞的凋亡。NICD可以與抗凋亡蛋白Bcl-2家族成員相互作用，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase的活性，從而抑制骨細(xì)胞的凋亡。在骨質(zhì)疏松癥的研究中發(fā)現(xiàn)，激活Notch信號(hào)通路可以減少骨細(xì)胞的凋亡，增加骨量。然而，在另一些情況下，Notch信號(hào)通路的激活可能會(huì)誘導(dǎo)骨細(xì)胞的凋亡。當(dāng)Notch信號(hào)通路過(guò)度激活或細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，NICD可能會(huì)與促凋亡蛋白相互作用，如Bax等，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致骨細(xì)胞凋亡。在骨細(xì)胞礦化方面，Notch信號(hào)通路對(duì)其具有促進(jìn)作用。在成骨細(xì)胞向成熟骨細(xì)胞分化的過(guò)程中，Notch信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)骨細(xì)胞的礦化功能。研究表明，Notch信號(hào)通路可以上調(diào)骨鈣素（OCN）、骨橋蛋白（OPN）等骨基質(zhì)蛋白的表達(dá)，這些蛋白參與鈣鹽的沉積和礦化結(jié)節(jié)的形成。Notch信號(hào)通路還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度和鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，影響鈣鹽的沉積和礦化。在體外實(shí)驗(yàn)中，激活Notch信號(hào)通路可以增加骨細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量和面積，提高礦化程度。而抑制Notch信號(hào)通路則會(huì)導(dǎo)致骨細(xì)胞的礦化功能受損，礦化結(jié)節(jié)形成減少。5.2雙相鈣磷陶瓷與Notch信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)機(jī)制5.2.1陶瓷表面特性對(duì)信號(hào)通路的激活雙相鈣磷陶瓷的表面特性在激活Notch信號(hào)通路中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其表面的化學(xué)成分、微觀結(jié)構(gòu)以及表面電荷等因素，均可通過(guò)與細(xì)胞表面受體的相互作用，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，進(jìn)而激活Notch信號(hào)通路。從化學(xué)成分來(lái)看，雙相鈣磷陶瓷主要由羥基磷灰石（HA）和磷酸三鈣（TCP）組成，其Ca/P比與人體骨組織中的無(wú)機(jī)成分相似。這種相似性使得雙相鈣磷陶瓷能夠與細(xì)胞表面的鈣離子和磷酸根離子受體相互作用，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)。鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)雙相鈣磷陶瓷表面的鈣離子與細(xì)胞表面的鈣敏感受體（CaSR）結(jié)合后，可激活CaSR下游的磷脂酶C（PLC）-IP3信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高。升高的鈣離子濃度可以激活多種鈣依賴的蛋白激酶，如蛋白激酶C（PKC），進(jìn)而激活Notch信號(hào)通路相關(guān)的蛋白激酶，促進(jìn)Notch受體的磷酸化和激活。雙相鈣磷陶瓷表面的磷酸根離子也可能與細(xì)胞表面的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或受體相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，影響Notch信號(hào)通路的激活。雙相鈣磷陶瓷的微觀結(jié)構(gòu)，如孔隙結(jié)構(gòu)和表面粗糙度，也對(duì)Notch信號(hào)通路的激活產(chǎn)生重要影響。適宜的孔隙結(jié)構(gòu)能夠?yàn)榧?xì)胞提供良好的附著和生長(zhǎng)空間，增加細(xì)胞與材料的接觸面積，促進(jìn)細(xì)胞的黏附和鋪展。當(dāng)細(xì)胞在雙相鈣磷陶瓷表面黏附時(shí)，細(xì)胞的形態(tài)和伸展?fàn)顟B(tài)會(huì)發(fā)生改變，這種機(jī)械信號(hào)可以通過(guò)細(xì)胞骨架傳遞到細(xì)胞內(nèi)，激活相關(guān)的信號(hào)通路。研究表明，細(xì)胞在具有一定粗糙度的材料表面黏附時(shí)，會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力纖維的重排和肌動(dòng)蛋白的聚合，從而激活細(xì)胞內(nèi)的力學(xué)信號(hào)通路，如FAK-Src信號(hào)通路。這些力學(xué)信號(hào)通路的激活可以進(jìn)一步激活Notch信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的分化和增殖。粗糙的表面還可能增加細(xì)胞表面受體與陶瓷表面分子的接觸概率，從而增強(qiáng)Notch信號(hào)通路的激活。表面電荷是雙相鈣磷陶瓷的另一重要表面特性，其表面電荷的性質(zhì)和密度會(huì)影響細(xì)胞與材料的相互作用。帶正電荷的表面可以促進(jìn)細(xì)胞的黏附，因?yàn)榧?xì)胞表面通常帶負(fù)電荷，正負(fù)電荷之間的靜電吸引作用可以增強(qiáng)細(xì)胞與材料的結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞與帶正電荷的雙相鈣磷陶瓷表面接觸時(shí)，細(xì)胞表面的整合素等受體與陶瓷表面的配體結(jié)合，激活整合素下游的信號(hào)通路，如PI3K-AKT信號(hào)通路。PI3K-AKT信號(hào)通路的激活可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成和基因表達(dá)，影響Notch信號(hào)通路的激活。帶正電荷的表面還可能影響Notch配體和受體的構(gòu)象，增加它們之間的親和力，從而促進(jìn)Notch信號(hào)通路的激活。相反，帶負(fù)電荷的表面可能會(huì)抑制細(xì)胞的黏附，減少細(xì)胞與材料的相互作用，進(jìn)而影響Notch信號(hào)通路的激活。5.2.2信號(hào)通路對(duì)陶瓷誘導(dǎo)成骨的反饋調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路激活后，會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞行為，對(duì)雙相鈣磷陶瓷的誘導(dǎo)成骨過(guò)程產(chǎn)生反饋調(diào)節(jié)作用，這種調(diào)節(jié)作用主要體現(xiàn)在對(duì)成骨細(xì)胞分化、增殖以及骨基質(zhì)合成和礦化等方面。在成骨細(xì)胞分化方面，Notch信號(hào)通路激活后，通過(guò)上調(diào)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）向成骨細(xì)胞分化，增強(qiáng)雙相鈣磷陶瓷的成骨誘導(dǎo)效果。Notch信號(hào)通路激活后，NICD進(jìn)入細(xì)胞核，與CSL蛋白結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物，啟動(dòng)下游靶基因Hes1和Hey1的轉(zhuǎn)錄。Hes1和Hey1編碼的轉(zhuǎn)錄因子可以與成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2相互作用，調(diào)節(jié)Runx2的活性，促進(jìn)Runx2對(duì)成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活。Runx2可以上調(diào)Osterix、ALP、骨鈣素等成骨相關(guān)基因的表達(dá)，這些基因在成骨細(xì)胞的分化和功能發(fā)揮中起著關(guān)鍵作用。Osterix是另一個(gè)重要的成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，在Runx2的下游發(fā)揮作用，參與骨基質(zhì)的合成和礦化。ALP是成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志性酶，其活性高低反映了成骨細(xì)胞的分化程度。骨鈣素則參與鈣鹽的沉積和礦化結(jié)節(jié)的形成。通過(guò)上調(diào)這些成骨相關(guān)基因的表達(dá)，Notch信號(hào)通路促進(jìn)了BMSCs向成骨細(xì)胞的分化，增強(qiáng)了雙相鈣磷陶瓷的成骨誘導(dǎo)能力。在成骨細(xì)胞增殖方面，Notch信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，為雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)的成骨過(guò)程提供更多的細(xì)胞來(lái)源。Notch信號(hào)通路激活后，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。Notch信號(hào)通路可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，CyclinD1與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）結(jié)合，形成CyclinD1-CDK4復(fù)合物，該復(fù)合物可以磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb），使Rb釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)細(xì)胞周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期。Notch信號(hào)通路還可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如細(xì)胞周期蛋白E、細(xì)胞周期蛋白A等，進(jìn)一步促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，Notch信號(hào)通路為雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)的成骨過(guò)程提供了充足的細(xì)胞數(shù)量，有利于新骨的形成。在骨基質(zhì)合成和礦化方面，Notch信號(hào)通路激活后，通過(guò)調(diào)節(jié)骨基質(zhì)蛋白的表達(dá)和鈣鹽的沉積，促進(jìn)骨基質(zhì)的合成和礦化，增強(qiáng)雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)的骨組織形成。Notch信號(hào)通路可以上調(diào)骨鈣素、骨橋蛋白等骨基質(zhì)蛋白的表達(dá)，這些蛋白參與鈣鹽的沉積和礦化結(jié)節(jié)的形成。骨鈣素可以與鈣離子結(jié)合，促進(jìn)鈣鹽的沉積，形成礦化結(jié)節(jié)。骨橋蛋白則可以介導(dǎo)細(xì)胞與骨基質(zhì)之間的相互作用，促進(jìn)骨基質(zhì)的合成和礦化。Notch信號(hào)通路還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度和鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，影響鈣鹽的沉積和礦化。Notch信號(hào)通路激活后，可能會(huì)上調(diào)細(xì)胞膜上鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，如鈣通道蛋白、鈣泵等，增加細(xì)胞對(duì)鈣離子的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)鈣鹽在骨基質(zhì)中的沉積。通過(guò)促進(jìn)骨基質(zhì)的合成和礦化，Notch信號(hào)通路增強(qiáng)了雙相鈣磷陶瓷誘導(dǎo)的骨組織形成，提高了骨修復(fù)的效果。5.3與其他相關(guān)信號(hào)通路的交互作用5.3.1與Wnt