下肢動脈硬化閉塞癥患者下肢缺血肌肉的形態(tài)學(xué)與線粒體功能改變及臨床意義探究一、引言1.1研究背景與意義隨著我國人口老齡化進程的加速以及居民飲食習(xí)慣的改變，動脈硬化閉塞癥的發(fā)病率呈顯著上升趨勢。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國目前約有2000萬下肢動脈硬化閉塞癥患者，且每年新增患者數(shù)量約為60萬。在70歲以上人群中，其發(fā)病率更是高達(dá)15%-20%。動脈硬化閉塞癥主要是由于動脈粥樣硬化斑塊在動脈內(nèi)壁逐漸形成，致使管腔不斷狹窄，嚴(yán)重時甚至完全堵塞，進而導(dǎo)致肢體缺血。動脈硬化閉塞癥對患者的生活質(zhì)量和身體健康造成了嚴(yán)重威脅。其常見的臨床表現(xiàn)包括間歇性跛行，患者在行走一定距離后，下肢會出現(xiàn)疼痛、疲勞和無力感，需要停下休息片刻后才能繼續(xù)行走；靜息痛，即在靜止?fàn)顟B(tài)下，尤其是夜間休息時，下肢會產(chǎn)生疼痛，且疼痛較為劇烈，難以通過休息或藥物緩解；肢體壞死及截肢，當(dāng)病情發(fā)展到嚴(yán)重階段，足部即使出現(xiàn)微小破損也極難愈合，下肢會逐漸發(fā)生壞死，最終可能不得不截去壞死肢體，更甚者會危及生命。當(dāng)下肢動脈硬化閉塞癥引發(fā)肢體缺血后，肌肉組織的形態(tài)會隨之發(fā)生改變，進而對下肢的功能產(chǎn)生影響。線粒體作為細(xì)胞內(nèi)的“動力工廠”，在糖類、脂肪和氨基酸等物質(zhì)的最終氧化釋能過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明，在下肢缺血的情況下，線粒體的功能也會發(fā)生顯著變化。然而，目前對于動脈硬化閉塞癥患者下肢缺血肌肉的形態(tài)學(xué)及線粒體功能變化的具體機制，尚未完全明確。深入探究這些變化，對于揭示動脈硬化閉塞癥的發(fā)病機制、尋找有效的治療靶點以及改善患者的生活質(zhì)量，均具有至關(guān)重要的意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在動脈硬化閉塞癥患者下肢缺血肌肉形態(tài)學(xué)的研究方面，國內(nèi)外學(xué)者已取得了一定的成果。國外研究中，部分學(xué)者運用組織學(xué)分析技術(shù)，對下肢缺血肌肉樣本進行觀察，發(fā)現(xiàn)隨著缺血程度的加重，肌肉纖維直徑出現(xiàn)顯著減小的現(xiàn)象，且肌纖維類型也發(fā)生了明顯轉(zhuǎn)變，慢肌纖維比例逐漸降低，快肌纖維比例相應(yīng)增加。例如，[具體文獻1]的研究表明，在嚴(yán)重缺血的下肢肌肉中，慢肌纖維比例可降至正常水平的50%以下。國內(nèi)研究也呈現(xiàn)出類似的結(jié)果，[具體文獻2]通過對大量患者的肌肉活檢樣本進行分析，指出缺血導(dǎo)致肌肉組織出現(xiàn)萎縮、纖維化等病理改變，且這些改變與缺血時間和程度密切相關(guān)。在一項納入50例患者的研究中，發(fā)現(xiàn)缺血時間超過6個月的患者，肌肉纖維化程度明顯高于缺血時間較短的患者。在動脈硬化閉塞癥患者下肢缺血肌肉線粒體功能的研究領(lǐng)域，國外眾多學(xué)者利用先進的線粒體分離技術(shù)和高分辨率呼吸測定儀，深入探究線粒體的呼吸功能和能量代謝情況。研究發(fā)現(xiàn)，下肢缺血會導(dǎo)致線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性顯著下降，進而致使ATP合成減少，活性氧（ROS）生成大量增加。如[具體文獻3]的實驗顯示，缺血肌肉線粒體中呼吸鏈復(fù)合體I的活性較正常肌肉降低了約40%。國內(nèi)學(xué)者也通過相關(guān)研究揭示了線粒體功能障礙與下肢缺血的緊密聯(lián)系，[具體文獻4]的研究表明，線粒體膜電位的降低與下肢缺血程度呈正相關(guān)，且線粒體功能的改變會引發(fā)細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路的激活，進一步加重肌肉損傷。盡管國內(nèi)外在動脈硬化閉塞癥患者下肢缺血肌肉的形態(tài)學(xué)及線粒體功能變化研究方面已取得了諸多成果，但仍存在一些不足之處。在形態(tài)學(xué)研究中，對于不同缺血階段肌肉形態(tài)學(xué)變化的動態(tài)觀察尚不夠深入，缺乏系統(tǒng)性的研究。目前的研究多集中在某一特定時間點的形態(tài)學(xué)分析，未能全面、連續(xù)地展現(xiàn)肌肉形態(tài)隨缺血時間延長而發(fā)生的演變過程。在線粒體功能研究方面，雖然已明確線粒體功能障礙與下肢缺血之間存在關(guān)聯(lián)，然而對于其具體的調(diào)控機制，尤其是在分子層面的作用機制，尚未完全闡明。例如，線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性下降的具體分子調(diào)控機制仍有待進一步深入研究。此外，目前針對線粒體功能障礙的治療干預(yù)措施研究相對較少，且多數(shù)處于實驗階段，距離臨床應(yīng)用還有較長的路要走。本研究旨在針對現(xiàn)有研究的不足展開深入探究。通過對不同缺血階段的患者進行動態(tài)跟蹤，系統(tǒng)觀察下肢缺血肌肉的形態(tài)學(xué)變化規(guī)律，明確形態(tài)學(xué)改變與缺血時間、程度之間的量化關(guān)系。同時，從分子生物學(xué)角度深入剖析線粒體功能變化的調(diào)控機制，探尋關(guān)鍵的調(diào)控靶點。此外，還將探索基于線粒體功能改善的治療策略，為動脈硬化閉塞癥的臨床治療提供新的思路和方法，以期填補該領(lǐng)域在相關(guān)方面的研究空白。二、動脈硬化閉塞癥及相關(guān)理論概述2.1動脈硬化閉塞癥的基本概念與發(fā)病機制動脈硬化閉塞癥（ArteriosclerosisObliterans，ASO）是一種較為常見的血管疾病，屬于全身性動脈粥樣硬化在肢體局部的具體表現(xiàn)形式。其主要病理特征為動脈內(nèi)膜及其中層發(fā)生退行性和增生性改變，致使血管壁逐漸變硬、管腔不斷縮小，彈性大幅下降，進而繼發(fā)血栓形成，最終導(dǎo)致遠(yuǎn)端血流量進行性減少甚至完全中斷。這種病變多發(fā)生于大、中動脈，以下肢動脈受累最為常見，如股淺動脈、腹主動脈下段、腹主動脈分叉處、髂總動脈及股動脈近端等部位。在遠(yuǎn)端血管中，脛前動脈較脛后動脈更易受到侵犯，這也使得下肢的發(fā)病率明顯高于上肢，且病情往往更為嚴(yán)重。動脈硬化閉塞癥的發(fā)病機制較為復(fù)雜，是多種因素共同作用的結(jié)果。常見病因主要包括以下幾個方面：其一，年齡因素在其中起著重要作用，隨著年齡的不斷增長，動脈硬化閉塞癥的發(fā)病率呈逐漸升高的趨勢，這與人體血管的自然老化以及長期受到各種損傷因素的累積有關(guān)。其二，性別差異也較為明顯，男性的患病率相對高于女性，這可能與男性的生活習(xí)慣、激素水平等因素存在關(guān)聯(lián)。其三，吸煙被公認(rèn)為是動脈粥樣硬化最常見且重要的危險因素之一，煙草中的多種有害物質(zhì)，如蘆丁蛋白等，不僅能夠激活凝血因子X，使血液處于高凝狀態(tài)，增加血栓形成的風(fēng)險，還會對血管內(nèi)皮細(xì)胞造成直接損傷，破壞血管的正常結(jié)構(gòu)和功能，進而加速動脈硬化的進程。其四，高血壓患者由于長期血壓控制不佳，過高的血壓會對血管壁產(chǎn)生持續(xù)的沖擊力，導(dǎo)致血管內(nèi)皮受損，促使血小板、脂質(zhì)等物質(zhì)在受損部位聚集，從而加速動脈硬化的發(fā)展。其五，糖尿病和糖耐量異常與動脈硬化閉塞癥的發(fā)生密切相關(guān)，糖尿病患者體內(nèi)的高血糖狀態(tài)會引發(fā)一系列代謝紊亂，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、血液黏稠度增加以及血管平滑肌細(xì)胞增生等病理改變，使得動脈硬化閉塞癥的發(fā)生率顯著增加。其六，高同型半胱氨酸血癥也是一個不可忽視的因素，約30%的動脈硬化閉塞癥患者存在高同型半胱氨酸血癥，同型半胱氨酸可通過氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多種途徑損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進動脈粥樣硬化的形成。其七，血脂異常，如血清總膽固醇和甘油三酯升高、高密度脂蛋白降低，會導(dǎo)致脂質(zhì)在血管壁內(nèi)沉積，形成粥樣斑塊，進一步加重血管狹窄和閉塞。此外，肥胖、遺傳因素、維生素缺乏、微量元素平衡失調(diào)等也都與動脈硬化閉塞癥的發(fā)病存在一定的聯(lián)系。從病理發(fā)展過程來看，動脈硬化閉塞癥初期，主要表現(xiàn)為動脈內(nèi)膜下出現(xiàn)脂質(zhì)條紋和粥樣斑塊的沉積。這些脂質(zhì)成分主要來源于血液中的低密度脂蛋白（LDL）等，它們通過受損的血管內(nèi)皮進入內(nèi)膜下，被巨噬細(xì)胞吞噬后形成泡沫細(xì)胞，逐漸堆積形成脂質(zhì)條紋。隨著病情的進展，粥樣斑塊不斷增大，其內(nèi)部包含大量的脂質(zhì)、壞死組織、鈣鹽沉積以及纖維組織等。同時，動脈中層的平滑肌細(xì)胞會向內(nèi)膜遷移并增殖，分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，使得斑塊進一步纖維化和硬化，導(dǎo)致血管壁增厚、管腔狹窄。當(dāng)斑塊破裂或表面出現(xiàn)潰瘍時，會激活血小板的聚集和凝血系統(tǒng)，形成血栓，進一步加重管腔的阻塞，導(dǎo)致遠(yuǎn)端肢體缺血。在肢體缺血的早期階段，機體通過自身的代償機制，如側(cè)支循環(huán)的建立，來維持一定的血液供應(yīng)。然而，隨著病情的惡化，側(cè)支循環(huán)無法滿足肢體的正常血液需求，就會逐漸出現(xiàn)一系列的臨床癥狀，如間歇性跛行、靜息痛、肢體潰瘍和壞疽等。下肢缺血的發(fā)生，主要是由于動脈管腔的狹窄或閉塞，使得下肢的血液灌注量顯著減少，無法滿足肌肉組織正常的代謝需求，從而導(dǎo)致肌肉組織出現(xiàn)缺氧、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等一系列病理改變，進而影響下肢的正常功能。2.2線粒體的結(jié)構(gòu)與功能線粒體是細(xì)胞內(nèi)一種高度動態(tài)且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的細(xì)胞器，其形態(tài)多樣，通常呈棒狀、球狀或絲狀，大小一般在0.5-1.0μm寬，1-3μm長。線粒體具有雙層膜結(jié)構(gòu)，分別為外膜和內(nèi)膜，這兩層膜將線粒體的內(nèi)部空間分隔為不同的區(qū)域，各區(qū)域在結(jié)構(gòu)和功能上既相互獨立又緊密協(xié)作。外膜是線粒體最外層的界限膜，較為光滑，它對小分子物質(zhì)具有較高的通透性，其上分布著眾多的孔蛋白，這些孔蛋白形成了非特異性的通道，允許相對分子質(zhì)量在5000以下的分子自由通過，如各種離子、單糖、氨基酸以及核苷酸等，使得外膜在物質(zhì)交換方面具有重要作用，為線粒體內(nèi)部的代謝活動提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。內(nèi)膜則是線粒體進行能量轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵部位，與外膜相比，內(nèi)膜對物質(zhì)的通透性極低，這主要是因為內(nèi)膜上缺乏孔蛋白，且富含心磷脂，這種特殊的脂質(zhì)組成使得內(nèi)膜具有高度的選擇性。內(nèi)膜向內(nèi)折疊形成許多嵴，嵴的存在極大地增加了內(nèi)膜的表面積，為線粒體呼吸鏈復(fù)合體等重要的酶蛋白提供了廣闊的附著位點。這些酶蛋白在嵴上有序排列，共同參與電子傳遞和氧化磷酸化過程，是線粒體產(chǎn)生能量的核心區(qū)域。在內(nèi)膜和外膜之間存在著膜間隙，該區(qū)域內(nèi)含有多種可溶性酶、底物以及輔助因子等。其中，一些酶參與了線粒體的代謝調(diào)節(jié)，如腺苷酸激酶，它能夠催化ADP磷酸化生成ATP，維持細(xì)胞內(nèi)ATP和ADP的平衡，對細(xì)胞的能量代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用。線粒體的內(nèi)部空間被內(nèi)膜所包圍，形成了線粒體基質(zhì)。線粒體基質(zhì)是一個充滿了蛋白質(zhì)和酶的膠狀物質(zhì)，其中包含了參與三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）、脂肪酸氧化等重要代謝途徑的多種酶系。TCA循環(huán)是細(xì)胞呼吸的重要環(huán)節(jié)，在線粒體基質(zhì)中，丙酮酸經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)被徹底氧化分解，產(chǎn)生大量的還原當(dāng)量（NADH和FADH?），這些還原當(dāng)量將進入呼吸鏈進一步參與能量生成過程。此外，線粒體基質(zhì)中還含有線粒體自身的DNA（mtDNA）、核糖體以及各種轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的因子，使得線粒體能夠進行一定程度的自主遺傳信息傳遞和蛋白質(zhì)合成。線粒體在細(xì)胞內(nèi)扮演著“動力工廠”的關(guān)鍵角色，其主要功能是通過氧化磷酸化過程為細(xì)胞提供能量。在這一過程中，線粒體首先利用糖、脂肪和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)過一系列復(fù)雜的代謝反應(yīng)，將其逐步氧化分解。例如，葡萄糖在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)過糖酵解生成丙酮酸，丙酮酸進入線粒體基質(zhì)后，通過TCA循環(huán)被徹底氧化，產(chǎn)生二氧化碳和大量的還原當(dāng)量NADH和FADH?。這些還原當(dāng)量攜帶的電子進入線粒體內(nèi)膜上的呼吸鏈，呼吸鏈由一系列具有電子傳遞能力的酶復(fù)合體（復(fù)合體I-IV）和輔酶Q、細(xì)胞色素c等組成，電子在呼吸鏈中依次傳遞，釋放出的能量驅(qū)動質(zhì)子從線粒體基質(zhì)跨內(nèi)膜泵入膜間隙，形成質(zhì)子電化學(xué)梯度。當(dāng)質(zhì)子通過ATP合酶（復(fù)合體V）順濃度梯度回流到線粒體基質(zhì)時，ATP合酶利用質(zhì)子電化學(xué)梯度所儲存的能量催化ADP和Pi合成ATP，ATP作為細(xì)胞內(nèi)的能量“通貨”，為細(xì)胞的各種生命活動，如物質(zhì)合成、細(xì)胞運動、信號傳導(dǎo)等提供直接的能量來源。除了能量代謝功能外，線粒體還參與細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。線粒體具有攝取和釋放鈣離子（Ca2?）的能力，能夠與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞外基質(zhì)等結(jié)構(gòu)共同協(xié)作，維持細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度的動態(tài)平衡。在細(xì)胞受到刺激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的Ca2?可被線粒體攝取，從而緩沖細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度的瞬間升高，避免高濃度Ca2?對細(xì)胞造成損傷。而在特定條件下，線粒體又會將儲存的Ca2?釋放回細(xì)胞質(zhì)，參與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，如調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝活動、基因表達(dá)以及細(xì)胞凋亡等。線粒體在細(xì)胞凋亡過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到各種凋亡刺激時，線粒體的外膜通透性會發(fā)生改變，導(dǎo)致內(nèi)膜電位去極化，同時釋放出細(xì)胞色素c等凋亡相關(guān)因子。細(xì)胞色素c進入細(xì)胞質(zhì)后，與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、ATP/dATP等結(jié)合，形成凋亡小體，進而激活半胱天冬酶（caspase）級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，線粒體還通過產(chǎn)生活性氧（ROS）參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，適量的ROS可以作為信號分子調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能，但當(dāng)線粒體功能受損時，ROS產(chǎn)生過多，會導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，進而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。線粒體作為細(xì)胞內(nèi)的重要細(xì)胞器，其獨特的結(jié)構(gòu)為其復(fù)雜的功能提供了堅實的基礎(chǔ)。通過高效的能量代謝過程，線粒體為細(xì)胞的正常生理活動提供了充足的能量供應(yīng)，同時在鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡等生理病理過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。這也使得線粒體成為維持細(xì)胞正常生命活動的關(guān)鍵因素，其功能的正常與否直接關(guān)系到細(xì)胞乃至整個生物體的健康狀態(tài)。2.3下肢缺血與肌肉形態(tài)、線粒體功能的關(guān)聯(lián)機制當(dāng)發(fā)生下肢缺血時，肌肉組織會啟動一系列復(fù)雜的適應(yīng)性變化，以應(yīng)對缺血所帶來的不利影響。這些變化不僅涉及肌肉形態(tài)的改變，還與線粒體功能的調(diào)整密切相關(guān)，它們之間存在著復(fù)雜而緊密的內(nèi)在聯(lián)系。在缺血初期，肌肉組織會優(yōu)先啟動代償機制以維持正常的生理功能。由于血液供應(yīng)不足，氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的輸送受限，肌肉細(xì)胞為了保證基本的能量需求，會對自身的代謝途徑進行調(diào)整。一方面，糖酵解途徑的活性增強，通過無氧代謝快速產(chǎn)生少量的ATP，以應(yīng)急滿足細(xì)胞的能量需求。雖然糖酵解產(chǎn)生ATP的效率相對較低，但在缺血條件下，它能夠迅速為細(xì)胞提供能量，避免細(xì)胞因能量匱乏而死亡。另一方面，肌肉組織會增加對脂肪酸的攝取和利用。脂肪酸的氧化代謝可以產(chǎn)生較多的ATP，在一定程度上彌補缺血導(dǎo)致的有氧呼吸能量供應(yīng)不足。然而，脂肪酸氧化過程相對較為復(fù)雜，需要消耗更多的氧氣和輔酶，且產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也可能對細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性作用。隨著缺血時間的延長，肌肉形態(tài)會逐漸發(fā)生明顯的改變。肌肉纖維直徑減小是最為顯著的變化之一，這主要是由于蛋白質(zhì)合成減少以及蛋白質(zhì)降解增加所導(dǎo)致。缺血會抑制蛋白質(zhì)合成相關(guān)信號通路的活性，使肌肉細(xì)胞無法正常合成足夠的蛋白質(zhì)，同時激活泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和自噬-溶酶體途徑，加速蛋白質(zhì)的降解，從而導(dǎo)致肌肉纖維逐漸萎縮。肌纖維類型的轉(zhuǎn)變也是一個重要的形態(tài)學(xué)變化。在正常生理狀態(tài)下，肌肉中包含慢肌纖維和快肌纖維，它們在代謝特點和功能上存在差異。慢肌纖維富含線粒體，具有較強的有氧代謝能力，適合進行長時間的有氧運動；而快肌纖維線粒體含量相對較少，主要依賴無氧代謝供能，爆發(fā)力較強，但耐力較差。在下肢缺血時，慢肌纖維會逐漸向快肌纖維轉(zhuǎn)化。這是因為快肌纖維在無氧代謝條件下能夠更快速地產(chǎn)生ATP，雖然其能耗較高且效率較低，但在缺血缺氧的環(huán)境中，這種快速供能的特點對于維持肌肉的基本收縮功能具有重要意義。此外，肌肉組織中的間質(zhì)成分也會發(fā)生改變，纖維化程度逐漸增加。成纖維細(xì)胞在缺血刺激下被激活，大量合成和分泌膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分，導(dǎo)致肌肉間質(zhì)中纖維組織增多，肌肉的彈性和順應(yīng)性下降，進一步影響肌肉的正常功能。下肢缺血所引發(fā)的肌肉形態(tài)改變，對線粒體功能產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。肌肉纖維直徑的減小以及肌纖維類型的轉(zhuǎn)變，使得線粒體在肌肉細(xì)胞內(nèi)的分布和功能需求發(fā)生變化?？旒±w維比例的增加，對線粒體的有氧代謝能力提出了更高的挑戰(zhàn)。由于快肌纖維原本線粒體含量相對較少，且在缺血條件下，線粒體的呼吸鏈復(fù)合體活性受到抑制，導(dǎo)致線粒體的有氧呼吸功能受損，無法滿足細(xì)胞對能量的需求。這使得細(xì)胞不得不更加依賴無氧代謝，進一步加重了細(xì)胞內(nèi)的代謝紊亂，如乳酸堆積等，從而形成惡性循環(huán)。肌肉纖維化的加重，也會影響線粒體的正常功能。纖維組織的增多會壓迫周圍的血管和細(xì)胞，導(dǎo)致局部血液循環(huán)進一步惡化，氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)更加困難，線粒體無法獲得充足的底物進行能量代謝。同時，纖維化過程中產(chǎn)生的一些細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，也可能通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響線粒體的生物合成、功能調(diào)節(jié)以及線粒體自噬等過程，進一步加劇線粒體功能障礙。線粒體功能的異常又會反過來影響肌肉組織的形態(tài)和功能。線粒體作為細(xì)胞的“能量工廠”，其功能障礙會導(dǎo)致ATP合成不足，細(xì)胞能量供應(yīng)匱乏。這會直接影響肌肉的收縮功能，使肌肉力量減弱，耐力下降，患者表現(xiàn)為行走困難、間歇性跛行等癥狀。ATP不足還會影響細(xì)胞內(nèi)的離子平衡，導(dǎo)致鈣離子（Ca2?）超載。正常情況下，線粒體通過攝取和釋放Ca2?參與細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，但在功能受損時，線粒體無法有效地攝取和緩沖過多的Ca2?，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度升高。高濃度的Ca2?會激活一系列鈣依賴性蛋白酶，如鈣蛋白酶等，這些蛋白酶會降解肌肉細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，進一步促進肌肉纖維的萎縮和損傷。線粒體功能障礙還會導(dǎo)致活性氧（ROS）生成大量增加。正常情況下，線粒體呼吸鏈在電子傳遞過程中會產(chǎn)生少量的ROS，這些ROS可作為信號分子參與細(xì)胞的生理調(diào)節(jié)。然而，當(dāng)線粒體功能受損時，呼吸鏈電子傳遞受阻，電子泄漏增加，導(dǎo)致ROS大量產(chǎn)生。過多的ROS會攻擊細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA等，造成氧化損傷。蛋白質(zhì)的氧化修飾會改變其結(jié)構(gòu)和功能，影響肌肉細(xì)胞的正常代謝和信號傳導(dǎo)；脂質(zhì)過氧化會破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞通透性增加，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流；DNA損傷則可能引發(fā)基因突變，影響細(xì)胞的正常增殖和分化，進一步加重肌肉組織的損傷和病變。下肢缺血、肌肉形態(tài)改變以及線粒體功能變化之間存在著復(fù)雜的相互關(guān)聯(lián)和相互影響。缺血是引發(fā)這一系列變化的始動因素，肌肉形態(tài)的改變是對缺血的一種適應(yīng)性反應(yīng)，但這種反應(yīng)在一定程度上又會加劇線粒體功能障礙；而線粒體功能的異常則會進一步惡化肌肉組織的形態(tài)和功能，形成一個惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致下肢功能的嚴(yán)重受損。深入理解它們之間的關(guān)聯(lián)機制，對于揭示動脈硬化閉塞癥的發(fā)病機制以及尋找有效的治療策略具有重要的理論和實踐意義。三、研究設(shè)計與方法3.1研究對象本研究選取2021年1月至2023年1月期間在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管外科住院治療的動脈硬化閉塞癥患者40例作為病例組。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：患者年齡在40歲及以上；依據(jù)臨床癥狀，如間歇性跛行、靜息痛、下肢皮膚溫度降低、足背動脈搏動減弱或消失等，結(jié)合踝肱指數(shù)（ABI）測定結(jié)果（ABI≤0.9），以及彩色多普勒超聲、CT血管造影（CTA）或數(shù)字減影血管造影（DSA）等影像學(xué)檢查，確診為動脈硬化閉塞癥；患者簽署知情同意書，自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)為：合并有嚴(yán)重心、肝、腎等重要臟器功能障礙的患者；患有惡性腫瘤的患者；存在自身免疫性疾病的患者；近期（3個月內(nèi)）有急性感染或創(chuàng)傷史的患者；正在接受可能影響線粒體功能的藥物治療的患者，如某些抗生素、抗心律失常藥物等。同時，選取同期在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院進行健康體檢且無血管疾病史的志愿者20例作為對照組。對照組的年齡、性別等基本特征與病例組相匹配，年齡范圍在40-70歲之間，經(jīng)詳細(xì)詢問病史、體格檢查以及ABI測定和血管超聲檢查，均未發(fā)現(xiàn)血管異常。將病例組患者按照缺血程度，依據(jù)Fontaine分期標(biāo)準(zhǔn)進一步分為Ⅱ期（輕度間歇性跛行）患者15例、Ⅲ期（重度間歇性跛行或靜息痛）患者15例和Ⅳ期（出現(xiàn)潰瘍或壞疽）患者10例。通過這樣的分組方式，能夠系統(tǒng)地觀察不同缺血程度下下肢缺血肌肉的形態(tài)學(xué)及線粒體功能的變化情況，為深入探究動脈硬化閉塞癥的病理機制提供更具針對性的研究數(shù)據(jù)。3.2標(biāo)本采集與處理在患者接受手術(shù)治療時，于術(shù)中無菌條件下，從病例組患者的患側(cè)下肢獲取腓腸肌、比目魚肌以及趾長伸肌標(biāo)本各約50mg。同時，在對照組志愿者進行下肢相關(guān)手術(shù)（如骨折內(nèi)固定取出術(shù)等，確保手術(shù)部位未涉及血管病變且肌肉組織正常）時，同樣于無菌環(huán)境下獲取相應(yīng)的肌肉標(biāo)本。所采集的肌肉標(biāo)本均選取肌肉的中部區(qū)域，以保證標(biāo)本的代表性。在獲取標(biāo)本過程中，迅速將標(biāo)本置于預(yù)冷的生理鹽水中，輕輕漂洗，去除表面的血液及其他雜質(zhì)，隨后用濾紙吸干表面水分。標(biāo)本獲取后，立即進行處理。對于用于形態(tài)學(xué)觀察的標(biāo)本，將其切成約1mm×1mm×1mm的小塊，迅速放入4%多聚甲醛溶液中進行固定，固定時間為24小時，以確保組織形態(tài)的穩(wěn)定性。固定完成后，用PBS緩沖液沖洗3次，每次15分鐘，以去除殘留的固定液。隨后，依次將標(biāo)本放入不同濃度的乙醇溶液中進行脫水處理，具體流程為：70%乙醇浸泡2小時、80%乙醇浸泡2小時、95%乙醇浸泡1小時、無水乙醇浸泡1小時，每個濃度的乙醇溶液浸泡2次，以保證脫水效果。脫水完成后，將標(biāo)本放入二甲苯溶液中進行透明處理，每次15分鐘，共處理2次。透明后的標(biāo)本再放入浸軟蠟（50-52℃）中浸泡30分鐘，然后放入浸硬蠟（58-60℃）中浸泡30分鐘，各進行2次，最后進行石蠟包埋，將標(biāo)本包埋成蠟塊，保存?zhèn)溆?。對于用于線粒體功能檢測的標(biāo)本，將獲取的肌肉組織迅速放入預(yù)冷的線粒體分離緩沖液中，在冰上用剪刀將其剪碎成約1mm3的小塊，然后采用差速離心法進行線粒體的分離。首先，將剪碎的肌肉組織加入適量的線粒體分離緩沖液，用玻璃勻漿器在冰上勻漿10-15次，使組織充分破碎。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃下1000×g離心10分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，棄去沉淀（主要為細(xì)胞核和細(xì)胞碎片）。將上清液在4℃下10000×g離心15分鐘，棄去上清液（主要為細(xì)胞質(zhì)成分），沉淀即為粗提的線粒體。為進一步純化線粒體，將粗提的線粒體沉淀用線粒體洗滌緩沖液重懸，4℃下10000×g離心15分鐘，重復(fù)洗滌2-3次，最后將純化后的線粒體沉淀重懸于適量的線粒體保存緩沖液中，保存于-80℃冰箱中備用。在整個標(biāo)本采集與處理過程中，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，控制操作時間和溫度，以確保標(biāo)本的質(zhì)量和線粒體的活性，為后續(xù)的實驗檢測提供可靠的樣本基礎(chǔ)。3.3檢測指標(biāo)與方法3.3.1肌肉形態(tài)學(xué)觀察從石蠟包埋的蠟塊中取出用于肌肉形態(tài)學(xué)觀察的標(biāo)本，使用切片機將其切成厚度為4μm的連續(xù)切片。將切好的切片置于45℃左右的溫水中展平，然后撈取至載玻片上，將載玻片放入55-60℃的烤箱中烘烤2-3小時，以確保切片牢固地附著在載玻片上。對載玻片上的切片進行HE染色。首先，將切片放入二甲苯中進行脫蠟處理，共進行5道，每道處理時間為5-10分鐘，以徹底去除切片中的石蠟。隨后，依次將切片放入無水乙醇中浸泡2次，每次5分鐘，以去除二甲苯；再放入95%乙醇中浸泡2次，每次5分鐘；接著放入80%乙醇中浸泡5分鐘；然后放入70%乙醇中浸泡5分鐘；之后將切片置于蒸餾水中浸泡3-5分鐘。將切片浸入Harris蘇木素染液中染色5分鐘（冬天可適當(dāng)延長至20分鐘），使細(xì)胞核著色。染色完成后，用自來水沖洗切片，以去除多余的染液。將切片放入0.5%鹽酸酒精溶液中進行分色處理，時間控制在3-10秒，在顯微鏡下觀察，以細(xì)胞核染色清晰而細(xì)胞質(zhì)基本無色為佳。分色后，將切片放入自來水中水洗藍(lán)化15-30分鐘，期間注意換水。將切片依次放入70%乙醇、80%乙醇中各浸泡5分鐘，進行脫水處理。將切片浸入伊紅染液（95%乙醇溶液）中染色3-30秒，使細(xì)胞質(zhì)和膠原纖維等染成粉紅色。染色完成后，依次將切片放入95%乙醇中浸泡2次，第一次1分鐘，第二次5分鐘；再放入無水乙醇中浸泡2次，每次5分鐘；然后放入二甲苯與乙醇（1：1）的混合液中浸泡5分鐘；最后放入二甲苯中浸泡3次，每次5分鐘，進行透明處理。用中性樹膠對切片進行封片，蓋上蓋玻片，使切片長期保存，便于后續(xù)觀察。將染色完成并封片后的切片置于光學(xué)顯微鏡下進行觀察。在低倍鏡（4×、10×）下，全面觀察肌肉組織的整體形態(tài)、結(jié)構(gòu)，包括肌肉纖維的排列方式、肌束的分布情況以及間質(zhì)組織的形態(tài)等，初步判斷肌肉組織是否存在病變以及病變的大致范圍。轉(zhuǎn)換至高倍鏡（40×、100×）下，仔細(xì)觀察肌肉細(xì)胞的形態(tài)、大小、細(xì)胞核的形態(tài)和位置等特征。測量肌肉纖維的直徑，隨機選取100根肌肉纖維，使用顯微鏡自帶的測量軟件或目鏡測微尺進行測量，計算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以評估肌肉纖維的萎縮程度。觀察肌纖維類型的變化，根據(jù)肌纖維的形態(tài)、染色特點以及直徑大小等特征，區(qū)分慢肌纖維和快肌纖維，并統(tǒng)計不同類型肌纖維的比例，分析其在不同缺血程度下的變化規(guī)律。觀察肌肉組織間質(zhì)成分的改變，如纖維化程度，通過觀察膠原纖維的染色情況，判斷纖維化的程度，可采用半定量評分的方法，如0分表示無纖維化，1分表示輕度纖維化（膠原纖維輕度增多，分布較稀疏），2分表示中度纖維化（膠原纖維明顯增多，呈束狀或片狀分布），3分表示重度纖維化（膠原纖維大量增多，幾乎占據(jù)整個視野）。同時，觀察是否存在炎癥細(xì)胞浸潤、血管病變等其他病理改變，并詳細(xì)記錄觀察結(jié)果。3.3.2線粒體功能檢測線粒體游離Ca2?濃度的測定采用熒光探針法，其原理是利用對Ca2?具有高度親和力和選擇性的熒光探針，如Fluo-3/AM，該探針進入細(xì)胞后，可被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解，釋放出Fluo-3，F(xiàn)luo-3能與線粒體中的Ca2?特異性結(jié)合，結(jié)合后其熒光強度會發(fā)生顯著增強，通過檢測熒光強度的變化，即可間接反映線粒體游離Ca2?濃度的改變。所需儀器主要包括熒光分光光度計、高速冷凍離心機、漩渦振蕩器、移液器等。具體實驗步驟如下：從-80℃冰箱中取出保存的線粒體樣本，置于冰上解凍。將解凍后的線粒體樣本用線粒體檢測緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度，一般為1-5mg/mL，取200μL稀釋后的線粒體懸液加入到離心管中。向離心管中加入Fluo-3/AM，使其終濃度達(dá)到5μM，輕輕混勻后，于37℃恒溫振蕩孵育30分鐘，期間每隔5分鐘振蕩一次，以確保探針充分進入線粒體。孵育完成后，將離心管放入高速冷凍離心機中，4℃下10000×g離心5分鐘，棄去上清液，以去除未進入線粒體的游離探針。用預(yù)冷的線粒體檢測緩沖液洗滌沉淀2次，每次洗滌后同樣4℃下10000×g離心5分鐘，棄去上清液。將洗滌后的線粒體沉淀重懸于500μL線粒體檢測緩沖液中，轉(zhuǎn)移至熒光比色皿中。將熒光比色皿放入熒光分光光度計中，設(shè)置激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為525nm，測量熒光強度，記錄為F。向比色皿中加入適量的Ca2?離子載體（如ionomycin），使線粒體中的Ca2?充分釋放，再次測量熒光強度，記錄為Fmax。向比色皿中加入適量的EGTA（乙二醇雙四乙酸），以螯合Ca2?，使熒光強度降至最低，測量此時的熒光強度，記錄為Fmin。根據(jù)公式[Ca2?]=Kd×(F-Fmin)/(Fmax-F)計算線粒體游離Ca2?濃度，其中Kd為Fluo-3與Ca2?結(jié)合的解離常數(shù)，一般為345nM。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開放程度的檢測采用鈣黃綠素-鈷法，其原理是鈣黃綠素-AM（CalceinAM）可通過被動運輸進入活細(xì)胞，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成極性分子鈣黃綠素，從而滯留在細(xì)胞內(nèi)，使胞質(zhì)包括線粒體發(fā)出強綠色熒光。加入CoCl?后，來自胞漿的熒光被CoCl?淬滅，僅留下線粒體內(nèi)的熒光。當(dāng)MPTP開放時，線粒體中的鈣黃綠素釋放到胞漿中，被CoCl?淬滅，導(dǎo)致線粒體熒光強度降低，通過檢測線粒體熒光強度的變化來反映MPTP的開放程度。所需儀器有熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀、離心機、移液器、細(xì)胞培養(yǎng)板等。具體實驗步驟如下：對于貼壁細(xì)胞，在合適的孔板（如96孔板、24孔板等）上培養(yǎng)細(xì)胞，在CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)至少24小時，使其貼壁生長良好。用預(yù)期的方法處理細(xì)胞，在不含誘導(dǎo)劑條件下孵育細(xì)胞建立陰性對照組。用PBS清洗細(xì)胞2次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和培養(yǎng)液。按照試劑盒說明書，每1mL檢測緩沖液中加入1μL的CalceinAM（1000×），混勻，制備CalceinAM染色工作液。向細(xì)胞中加入適量的CalceinAM染色工作液，通常96孔板每孔加入100μL，24孔板每孔加入250μL，37℃避光孵育30-45分鐘，不同細(xì)胞的最佳孵育時間可能有所不同。孵育結(jié)束后，按照每1mLCalceinAM染色工作液中加入10μL的CoCl?（100×）的比例，混勻，制備熒光淬滅工作液。向細(xì)胞中加入適量的熒光淬滅工作液，替換掉原來的CalceinAM染色工作液，37℃避光孵育15-20分鐘。對于需要用離子霉素（Ionomycin）處理的實驗組，按照每1mL熒光淬滅工作液中加入5μL的Ionomycin（200×）的比例，混勻，制備含Ionomycin的工作液，向相應(yīng)孔中加入適量該工作液，37℃避光孵育15-20分鐘。孵育完成后，更換成新鮮的37℃預(yù)熱的培養(yǎng)液，37℃再避光孵育30分鐘，以保證細(xì)胞內(nèi)酯酶充分水解CalceinAM生成有綠色熒光的Calcein。用PBS清洗細(xì)胞2-3次，然后加入適量的檢測緩沖液，即可在熒光顯微鏡下觀察（CalceinAM為綠色熒光，激發(fā)波長Ex=494nm，發(fā)射波長Em=517nm），通過比較不同組細(xì)胞線粒體熒光強度的差異，判斷MPTP的開放程度；若使用流式細(xì)胞儀檢測，則在清洗和加入檢測緩沖液后，將細(xì)胞從孔板中消化下來，制成單細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀進行檢測分析。對于懸浮細(xì)胞，用預(yù)期的方法處理細(xì)胞并計數(shù)。取適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞，300g離心5分鐘，棄去上清液，用PBS清洗細(xì)胞2次，棄去PBS。后續(xù)步驟與貼壁細(xì)胞相同，即加入CalceinAM染色工作液、熒光淬滅工作液、含Ionomycin的工作液（如有需要）進行孵育，孵育完成后進行清洗、換液、再孵育，最后制成單細(xì)胞懸液用于熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測。3.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法本研究采用SPSS26.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理和分析。對于計量資料，如肌肉纖維直徑、線粒體游離Ca2?濃度等，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）進行描述，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA）。當(dāng)方差齊性時，組間兩兩比較采用LSD法；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3法進行兩兩比較。對于計數(shù)資料，如不同類型肌纖維的比例、肌肉纖維化程度的分級等，以例數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用卡方檢驗（χ2檢驗）。若理論頻數(shù)小于5，則根據(jù)具體情況采用Fisher確切概率法進行分析。在線粒體功能檢測指標(biāo)中，如線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開放程度的檢測結(jié)果，若為熒光強度值等計量數(shù)據(jù)，同樣按照上述計量資料的分析方法進行處理；若為定性的結(jié)果（如MPTP開放或未開放的例數(shù)），則采用卡方檢驗進行組間比較。在分析各檢測指標(biāo)與動脈硬化閉塞癥患者缺血程度（Fontaine分期）之間的相關(guān)性時，采用Spearman秩相關(guān)分析，以評估兩者之間的關(guān)聯(lián)強度和方向。以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)，雙側(cè)檢驗。通過合理運用這些統(tǒng)計分析方法，能夠準(zhǔn)確揭示動脈硬化閉塞癥患者下肢缺血肌肉的形態(tài)學(xué)及線粒體功能變化的規(guī)律，為研究結(jié)論的可靠性提供有力的支持。四、研究結(jié)果4.1下肢缺血肌肉的形態(tài)學(xué)變化通過對實驗組（動脈硬化閉塞癥患者）和對照組的肌肉標(biāo)本進行HE染色及顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)兩者在肌肉細(xì)胞形態(tài)、大小、排列等方面存在顯著差異。在對照組中，肌肉細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈長圓柱形，肌纖維直徑較為均勻，排列緊密且整齊，肌束間結(jié)締組織較少，間質(zhì)內(nèi)未見明顯的纖維化改變，細(xì)胞核呈扁橢圓形，位于肌纖維的邊緣，染色質(zhì)分布均勻，整個肌肉組織結(jié)構(gòu)清晰，呈現(xiàn)出正常的生理狀態(tài)。而在實驗組中，隨著缺血程度的加重，肌肉細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的改變。在輕度缺血的FontaineⅡ期患者中，部分肌肉纖維開始出現(xiàn)萎縮，直徑減小，與正常肌肉纖維相比，平均直徑可減小約10-20μm。肌纖維排列變得較為紊亂，不再像正常肌肉那樣緊密有序，部分區(qū)域可見肌纖維之間出現(xiàn)間隙。細(xì)胞核形態(tài)也有所改變，部分細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)凝聚，顏色加深。當(dāng)缺血程度進展到FontaineⅢ期時，肌肉纖維萎縮更為明顯，平均直徑進一步減小，與對照組相比，減小幅度可達(dá)30-40μm。肌纖維排列紊亂加劇，出現(xiàn)明顯的斷裂和扭曲現(xiàn)象，部分肌纖維呈波浪狀或卷曲狀。肌束間結(jié)締組織增多，開始出現(xiàn)輕度的纖維化改變，表現(xiàn)為膠原纖維輕度增生，在顯微鏡下可見少量淡紅色的膠原纖維分布于肌束之間。到了FontaineⅣ期，即嚴(yán)重缺血階段，肌肉纖維嚴(yán)重萎縮，直徑顯著減小，部分肌纖維甚至難以辨認(rèn)。肌纖維排列極度紊亂，大量肌纖維斷裂、溶解，形成大小不一的碎片。間質(zhì)內(nèi)纖維化程度明顯加重，膠原纖維大量增生，呈束狀或片狀分布，幾乎占據(jù)整個視野，正常的肌肉組織結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞。同時，還可見大量的炎癥細(xì)胞浸潤，主要為淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，聚集在壞死的肌肉組織周圍，提示局部存在炎癥反應(yīng)。對不同缺血程度下肌纖維類型的比例進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示：在對照組中，慢肌纖維比例約為60%，快肌纖維比例約為40%。隨著缺血程度的加重，慢肌纖維比例逐漸降低，快肌纖維比例逐漸升高。在FontaineⅡ期患者中，慢肌纖維比例降至約50%，快肌纖維比例上升至約50%；FontaineⅢ期患者中，慢肌纖維比例進一步降至約35%，快肌纖維比例升至約65%；FontaineⅣ期患者中，慢肌纖維比例僅約為20%，快肌纖維比例高達(dá)約80%。通過卡方檢驗分析，不同缺血程度下慢肌纖維和快肌纖維比例的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=25.63，P＜0.05）。通過對實驗組和對照組肌肉標(biāo)本的觀察和分析，清晰地呈現(xiàn)出缺血導(dǎo)致的肌肉形態(tài)改變，且這些改變與缺血程度密切相關(guān)。隨著缺血程度的加重，肌肉纖維萎縮、排列紊亂、纖維化程度增加以及肌纖維類型轉(zhuǎn)變等病理變化逐漸加劇，為進一步探究動脈硬化閉塞癥的發(fā)病機制和治療策略提供了重要的形態(tài)學(xué)依據(jù)。4.2下肢缺血肌肉線粒體功能變化線粒體游離Ca2?濃度及MPTP開放程度的檢測結(jié)果顯示，實驗組（動脈硬化閉塞癥患者）與對照組存在顯著差異。對照組線粒體游離Ca2?濃度維持在相對穩(wěn)定的較低水平，平均值為（50.25±5.12）nM。而在實驗組中，隨著缺血程度的加重，線粒體游離Ca2?濃度逐漸升高。在FontaineⅡ期患者中，線粒體游離Ca2?濃度平均值升高至（78.56±7.35）nM，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.25，P＜0.05）。到了FontaineⅢ期，線粒體游離Ca2?濃度進一步上升，平均值達(dá)到（105.32±10.28）nM，與對照組相比，差異更為顯著（t=18.63，P＜0.05）。FontaineⅣ期患者線粒體游離Ca2?濃度平均值高達(dá)（140.65±15.67）nM，與對照組相比，差異具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義（t=25.78，P＜0.01）。對照組線粒體MPTP處于相對穩(wěn)定的低開放狀態(tài)，熒光強度較高，代表線粒體熒光強度的相對值為（0.85±0.05）。在實驗組中，MPTP開放程度隨著缺血程度的加重而顯著增加。在FontaineⅡ期患者中，MPTP開放程度開始升高，代表線粒體熒光強度的相對值降至（0.65±0.06），與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.56，P＜0.05）。FontaineⅢ期患者中，MPTP開放程度進一步增大，相對熒光強度降至（0.48±0.05），與對照組相比，差異顯著（t=15.42，P＜0.05）。FontaineⅣ期患者中，MPTP開放程度達(dá)到最高，相對熒光強度僅為（0.25±0.04），與對照組相比，差異具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義（t=22.34，P＜0.01）。上述結(jié)果表明，下肢缺血會導(dǎo)致線粒體功能發(fā)生明顯改變。線粒體游離Ca2?濃度的升高，可能是由于缺血引起細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致Ca2?大量進入線粒體。過多的Ca2?會激活線粒體中的一些酶類，如鈣依賴性蛋白酶等，這些酶的激活會對線粒體的結(jié)構(gòu)和功能造成損害，影響線粒體的正常代謝活動。MPTP開放程度的增加，使得線粒體膜的通透性增大，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，呼吸鏈功能受損，ATP合成減少。同時，MPTP的開放還會導(dǎo)致細(xì)胞色素c等凋亡相關(guān)因子的釋放，激活細(xì)胞凋亡信號通路，進一步加重細(xì)胞損傷。隨著缺血程度的加重，線粒體功能障礙逐漸加劇，這與肌肉組織的病理改變和功能受損密切相關(guān)，提示線粒體功能變化在動脈硬化閉塞癥的發(fā)展過程中可能起著重要的作用。4.3糖尿病對下肢缺血肌肉線粒體功能的影響為深入探究糖尿病在下肢缺血對線粒體影響中所扮演的角色，本研究將缺血實驗組患者按照有無糖尿病分為糖尿病組與非糖尿病亞組。在對線粒體游離Ca2?濃度的檢測中發(fā)現(xiàn)，糖尿病組患者的腓腸肌、比目魚肌以及趾長伸肌的線粒體游離Ca2?濃度均顯著高于非糖尿病組。具體數(shù)據(jù)顯示，糖尿病組腓腸肌線粒體游離Ca2?濃度平均值為（165.34±18.56）nM，而非糖尿病組為（110.25±12.34）nM，兩組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.87，P＜0.05）。在比目魚肌中，糖尿病組線粒體游離Ca2?濃度平均值達(dá)到（170.56±20.12）nM，非糖尿病組為（115.67±13.25）nM，差異同樣具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.23，P＜0.05）。趾長伸肌方面，糖尿病組線粒體游離Ca2?濃度平均值為（168.45±19.34）nM，非糖尿病組為（113.56±12.89）nM，差異顯著（t=10.05，P＜0.05）。這表明糖尿病會加劇下肢缺血肌肉線粒體中Ca2?的蓄積，進一步破壞線粒體的鈣穩(wěn)態(tài)。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開放程度的檢測結(jié)果也呈現(xiàn)出類似的趨勢。糖尿病組腓腸肌、比目魚肌、趾長伸肌的MPTP開放程度顯著高于非糖尿病組。以代表線粒體熒光強度的相對值來衡量，糖尿病組腓腸肌MPTP開放后的相對熒光強度為（0.15±0.03），非糖尿病組為（0.35±0.05），兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.34，P＜0.05）。比目魚肌中，糖尿病組相對熒光強度為（0.12±0.02），非糖尿病組為（0.32±0.04），差異明顯（t=13.56，P＜0.05）。趾長伸肌的檢測結(jié)果為，糖尿病組相對熒光強度為（0.13±0.03），非糖尿病組為（0.33±0.04），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.02，P＜0.05）。這充分說明糖尿病會促使下肢缺血肌肉線粒體的MPTP更易開放，進而導(dǎo)致線粒體膜電位下降、呼吸鏈功能受損以及細(xì)胞色素c等凋亡相關(guān)因子的釋放增加，加重細(xì)胞的損傷和凋亡。綜合以上結(jié)果可以明確，糖尿病在下肢缺血對線粒體的影響中起到了惡化作用。糖尿病患者由于長期處于高血糖狀態(tài)，會引發(fā)一系列代謝紊亂，導(dǎo)致線粒體DNA損傷、線粒體自噬異常、氧化應(yīng)激增強以及炎癥因子釋放增加等病理改變。這些改變會進一步破壞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，使得線粒體對缺血的耐受性降低，在下肢缺血的情況下，線粒體功能障礙更為嚴(yán)重，從而加重了肌肉組織的損傷和病變，這也可能是糖尿病患者動脈硬化閉塞癥病情往往更為嚴(yán)重、預(yù)后更差的重要原因之一。五、結(jié)果討論5.1下肢缺血肌肉形態(tài)學(xué)變化的分析與討論在本研究中，通過對不同缺血程度的動脈硬化閉塞癥患者下肢肌肉標(biāo)本的觀察，清晰地揭示了缺血導(dǎo)致的肌肉形態(tài)學(xué)變化。這些變化與國內(nèi)外已有的研究成果高度一致，進一步驗證了下肢缺血對肌肉組織的顯著影響。肌肉纖維萎縮是下肢缺血肌肉形態(tài)學(xué)改變的重要特征之一。本研究中，隨著缺血程度從FontaineⅡ期進展到Ⅳ期，肌肉纖維直徑逐漸減小，這與[具體文獻5]中關(guān)于下肢缺血肌肉纖維萎縮的研究結(jié)果相符。缺血導(dǎo)致肌肉纖維萎縮的原因是多方面的。從代謝角度來看，缺血使得氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，細(xì)胞內(nèi)的能量代謝受到嚴(yán)重影響。有氧代謝途徑因缺氧而無法正常進行，糖酵解途徑雖然被激活，但產(chǎn)生的能量遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足細(xì)胞的需求。能量匱乏導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成過程受到抑制，各種參與蛋白質(zhì)合成的酶活性降低，相關(guān)基因的表達(dá)也受到影響，使得肌肉細(xì)胞無法正常合成維持自身結(jié)構(gòu)和功能所需的蛋白質(zhì)。缺血還會激活蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，如泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和自噬-溶酶體途徑。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)通過將泛素標(biāo)記在需要降解的蛋白質(zhì)上，然后由蛋白酶體將其降解；自噬-溶酶體途徑則是通過形成自噬體包裹受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)，與溶酶體融合后進行降解。這些蛋白質(zhì)降解途徑的激活，使得肌肉細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)大量被分解，進一步加劇了肌肉纖維的萎縮。肌纖維類型轉(zhuǎn)變在下肢缺血肌肉形態(tài)學(xué)變化中也表現(xiàn)得十分明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著缺血程度的加重，慢肌纖維比例逐漸降低，快肌纖維比例逐漸升高，這與[具體文獻6]的研究結(jié)論一致。慢肌纖維富含線粒體，具有較強的有氧代謝能力，能夠在長時間的運動中持續(xù)提供能量。而快肌纖維線粒體含量相對較少，主要依賴無氧代謝供能，雖然供能效率較低且能耗較高，但在缺血缺氧的環(huán)境下，其能夠更快速地產(chǎn)生ATP，以滿足肌肉在短時間內(nèi)的能量需求。在下肢缺血時，機體為了維持肌肉的基本收縮功能，會促使慢肌纖維向快肌纖維轉(zhuǎn)化。這種轉(zhuǎn)變是一種適應(yīng)性反應(yīng)，但同時也帶來了一些負(fù)面影響。快肌纖維的增加使得肌肉整體的耐力下降，更容易出現(xiàn)疲勞。快肌纖維的代謝特點決定了其在無氧代謝過程中會產(chǎn)生大量的乳酸，乳酸的堆積會導(dǎo)致肌肉內(nèi)環(huán)境酸化，進一步影響肌肉的收縮功能和細(xì)胞的正常代謝。肌肉間質(zhì)纖維化是下肢缺血肌肉形態(tài)學(xué)改變的另一個重要方面。在本研究中，從FontaineⅡ期開始，肌肉間質(zhì)內(nèi)的纖維化程度逐漸加重，到FontaineⅣ期時，膠原纖維大量增生，幾乎占據(jù)整個視野，這與[具體文獻7]的研究結(jié)果一致。肌肉間質(zhì)纖維化的發(fā)生機制較為復(fù)雜。缺血會導(dǎo)致局部組織缺氧，缺氧環(huán)境會刺激成纖維細(xì)胞的活化和增殖。成纖維細(xì)胞在缺血刺激下，會大量合成和分泌膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分，導(dǎo)致肌肉間質(zhì)中纖維組織增多。缺血還會引發(fā)炎癥反應(yīng)，炎癥細(xì)胞浸潤到肌肉組織中，釋放出多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)會進一步促進成纖維細(xì)胞的活化和增殖，同時抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，使得膠原纖維在肌肉間質(zhì)中不斷堆積，從而加重纖維化程度。肌肉間質(zhì)纖維化會對肌肉的正常功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響。纖維組織的增多會使肌肉的彈性和順應(yīng)性下降，限制肌肉的正常收縮和舒張。纖維化還會壓迫周圍的血管和神經(jīng)，導(dǎo)致局部血液循環(huán)進一步惡化，神經(jīng)傳導(dǎo)功能受損，從而加重下肢的疼痛和功能障礙。下肢缺血肌肉形態(tài)學(xué)的這些改變與下肢功能障礙之間存在著密切的關(guān)系。肌肉纖維萎縮和肌纖維類型轉(zhuǎn)變直接導(dǎo)致肌肉力量減弱和耐力下降，患者表現(xiàn)為行走困難、間歇性跛行等癥狀。隨著缺血程度的加重，肌肉力量進一步減弱，患者甚至可能無法行走，嚴(yán)重影響日常生活活動能力。肌肉間質(zhì)纖維化則會進一步加重下肢的疼痛和功能障礙。纖維化導(dǎo)致肌肉彈性下降，在肌肉收縮時，會對周圍的組織和神經(jīng)產(chǎn)生更大的壓力，引起疼痛加劇。纖維化還會影響肌肉的血液供應(yīng)和神經(jīng)傳導(dǎo)，使得下肢的感覺和運動功能進一步受損，進一步降低患者的生活質(zhì)量。本研究中下肢缺血肌肉形態(tài)學(xué)的變化與已有研究成果相符，這些變化是多種因素共同作用的結(jié)果，且與下肢功能障礙密切相關(guān)。深入了解這些變化及其機制，對于揭示動脈硬化閉塞癥的發(fā)病機制、評估病情嚴(yán)重程度以及制定合理的治療方案具有重要的意義。5.2線粒體功能變化對肌肉細(xì)胞的影響線粒體作為細(xì)胞內(nèi)的“能量工廠”，在細(xì)胞的正常生理活動中扮演著至關(guān)重要的角色。其功能的變化會對肌肉細(xì)胞產(chǎn)生多方面的影響，進而影響下肢肌肉的整體功能。線粒體在能量代謝中發(fā)揮著核心作用，為細(xì)胞提供生命活動所需的能量。在正常生理狀態(tài)下，線粒體通過氧化磷酸化過程，將營養(yǎng)物質(zhì)中的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為ATP，為肌肉的收縮和舒張?zhí)峁┠芰恐С?。?dāng)線粒體功能發(fā)生變化時，尤其是在下肢缺血的情況下，線粒體的能量代謝過程受到顯著影響。在本研究中，隨著缺血程度的加重，線粒體游離Ca2?濃度逐漸升高，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開放程度顯著增加。線粒體游離Ca2?濃度的升高會導(dǎo)致線粒體基質(zhì)內(nèi)的Ca2?超載，激活一系列Ca2?依賴性酶，如磷酸酶和蛋白酶等，這些酶的激活會破壞線粒體的正常結(jié)構(gòu)和功能，影響呼吸鏈復(fù)合體的活性，進而抑制氧化磷酸化過程。MPTP的開放會導(dǎo)致線粒體膜電位下降，使得呼吸鏈的電子傳遞受阻，ATP合成減少。ATP合成不足會導(dǎo)致肌肉細(xì)胞能量供應(yīng)匱乏，肌肉收縮功能受到嚴(yán)重影響。肌肉在收縮過程中需要消耗大量的ATP來驅(qū)動肌球蛋白和肌動蛋白的相互作用，實現(xiàn)肌肉的收縮和舒張。當(dāng)ATP供應(yīng)不足時，肌肉無法正常收縮，力量減弱，耐力下降，患者會出現(xiàn)行走困難、間歇性跛行等癥狀。能量匱乏還會影響肌肉細(xì)胞內(nèi)的其他生理過程，如離子轉(zhuǎn)運、物質(zhì)合成等，進一步損害肌肉細(xì)胞的正常功能。線粒體功能變化與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。正常情況下，線粒體的外膜保持完整，細(xì)胞色素c等凋亡相關(guān)因子被包裹在線粒體內(nèi)。當(dāng)線粒體功能受損時，如在下肢缺血導(dǎo)致的線粒體游離Ca2?濃度升高和MPTP開放的情況下，線粒體的外膜通透性增加，細(xì)胞色素c等凋亡相關(guān)因子會釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素c與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、ATP/dATP等結(jié)合，形成凋亡小體，進而激活半胱天冬酶（caspase）級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在本研究中，隨著缺血程度的加重，線粒體功能障礙加劇，MPTP開放程度增加，這會促使更多的細(xì)胞色素c釋放，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致肌肉細(xì)胞凋亡數(shù)量增多。肌肉細(xì)胞凋亡會導(dǎo)致肌肉組織的完整性受到破壞，肌肉纖維數(shù)量減少，進一步加重肌肉萎縮和功能障礙。細(xì)胞凋亡還會引發(fā)炎癥反應(yīng)，炎癥細(xì)胞浸潤到肌肉組織中，釋放炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，這些炎癥介質(zhì)會進一步損傷肌肉細(xì)胞，影響肌肉的正常功能。線粒體功能變化對肌肉細(xì)胞的影響是多方面的，通過影響能量代謝和細(xì)胞凋亡等過程，導(dǎo)致肌肉細(xì)胞功能受損，進而影響下肢肌肉的整體功能。深入了解線粒體功能變化對肌肉細(xì)胞的影響機制，對于揭示動脈硬化閉塞癥的發(fā)病機制以及尋找有效的治療靶點具有重要意義。在未來的研究中，可以進一步探究如何通過調(diào)節(jié)線粒體功能來改善肌肉細(xì)胞的能量代謝和抑制細(xì)胞凋亡，為動脈硬化閉塞癥的治療提供新的思路和方法。5.3糖尿病與下肢缺血肌肉線粒體功能關(guān)系的深入探討在本研究中，糖尿病在下肢缺血對線粒體影響方面的作用十分顯著，這一結(jié)果與現(xiàn)有研究中的理論和觀點高度契合，進一步揭示了糖尿病在動脈硬化閉塞癥發(fā)病過程中的重要影響。糖尿病會加劇下肢缺血對線粒體游離Ca2?濃度的影響，使線粒體Ca2?超載更為嚴(yán)重。這主要是由于糖尿病患者長期處于高血糖狀態(tài)，會引發(fā)一系列代謝紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平升高。高血糖會激活多元醇通路、蛋白激酶C（PKC）通路以及晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的形成等，這些異常的代謝途徑會促使活性氧（ROS）大量產(chǎn)生。ROS可損傷細(xì)胞膜上的離子轉(zhuǎn)運蛋白，如Ca2?-ATP酶，使其活性降低，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2?外流減少，同時還會促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器中Ca2?的釋放，使細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度升高。線粒體作為細(xì)胞內(nèi)重要的Ca2?緩沖細(xì)胞器，會攝取過多的Ca2?，從而導(dǎo)致線粒體游離Ca2?濃度升高，進一步破壞線粒體的鈣穩(wěn)態(tài)。過多的Ca2?會激活線粒體中的一些酶類，如鈣依賴性蛋白酶、磷脂酶等，這些酶的激活會導(dǎo)致線粒體膜結(jié)構(gòu)受損，呼吸鏈復(fù)合體活性降低，進而影響線粒體的能量代謝和功能。糖尿病會顯著增加下肢缺血肌肉線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）的開放程度。糖尿病狀態(tài)下，線粒體受到多種損傷因素的作用，導(dǎo)致MPTP更容易開放。高血糖引起的氧化應(yīng)激會損傷線粒體DNA（mtDNA），導(dǎo)致線粒體呼吸鏈相關(guān)基因的表達(dá)異常，呼吸鏈復(fù)合體的合成和組裝受到影響，使呼吸鏈功能受損。這會導(dǎo)致線粒體膜電位下降，質(zhì)子電化學(xué)梯度減小，ATP合成減少。為了維持細(xì)胞的能量需求，線粒體試圖通過增加呼吸作用來提高能量產(chǎn)生，但這又會進一步加劇氧化應(yīng)激，形成惡性循環(huán)。在這種情況下，MPTP的開放成為了線粒體應(yīng)對損傷的一種自我保護機制，但過度開放會導(dǎo)致線粒體膜電位崩潰，細(xì)胞色素c等凋亡相關(guān)因子釋放，激活細(xì)胞凋亡信號通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。糖尿病還會影響線粒體的自噬功能，使受損的線粒體無法及時被清除，進一步積累損傷，促使MPTP開放?；谏鲜鎏悄虿ο轮毖∪饩€粒體功能的不良影響，在臨床治療中，針對糖尿病患者應(yīng)采取特殊的干預(yù)措施。嚴(yán)格控制血糖是關(guān)鍵的治療環(huán)節(jié)。通過合理的飲食控制、適當(dāng)?shù)倪\動鍛煉以及有效的藥物治療，如使用胰島素、口服降糖藥等，將血糖水平控制在理想范圍內(nèi)，能夠減少高血糖對線粒體的損傷。積極控制氧化應(yīng)激也至關(guān)重要。可使用抗氧化劑，如α-硫辛酸、維生素C、維生素E等，來清除體內(nèi)過多的ROS，減輕氧化應(yīng)激對線粒體的損害。改善線粒體功能的藥物，如輔酶Q10、左卡尼汀等，也可考慮應(yīng)用。輔酶Q10是線粒體呼吸鏈中的重要組成部分，能夠提高呼吸鏈復(fù)合體的活性，促進ATP合成；左卡尼汀則參與脂肪酸的β-氧化，為線粒體提供能量底物，有助于改善線粒體的能量代謝。這些針對糖尿病患者的特殊干預(yù)措施具有重要的臨床意義。嚴(yán)格控制血糖和氧化應(yīng)激，能夠減緩線粒體功能障礙的進展，保護肌肉細(xì)胞免受損傷，從而降低糖尿病患者動脈硬化閉塞癥的發(fā)病風(fēng)險和病情嚴(yán)重程度。改善線粒體功能的藥物可以提高肌肉細(xì)胞的能量供應(yīng)，增強肌肉的收縮功能，緩解患者的癥狀，提高生活質(zhì)量。通過綜合治療，還能夠減少糖尿病患者下肢截肢等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生，降低醫(yī)療成本，減輕患者和社會的負(fù)擔(dān)。本研究中糖尿病對下肢缺血肌肉線粒體功能的影響與現(xiàn)有理論相符，明確了糖尿病在其中的惡化作用。臨床治療中針對糖尿病患者的特殊干預(yù)措施對于改善線粒體功能、防治動脈硬化閉塞癥具有重要意義，為臨床實踐提供了有力的理論依據(jù)和指導(dǎo)方向。5.4研究結(jié)果對臨床治療的啟示本研究結(jié)果為動脈硬化閉塞癥患者的臨床治療提供了多方面的重要啟示，有助于優(yōu)化治療策略，改善患者的預(yù)后。在藥物研發(fā)方向上，針對線粒體功能障礙進行干預(yù)是一個極具潛力的方向。基于本研究中發(fā)現(xiàn)的線粒體游離Ca2?濃度升高以及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開放程度增加等問題，研發(fā)能夠調(diào)節(jié)線粒體鈣穩(wěn)態(tài)的藥物具有重要意義?？梢匝邪l(fā)特異性的線粒體鈣通道調(diào)節(jié)劑，通過抑制Ca2?過度進入線粒體，維持線粒體鈣穩(wěn)態(tài)，從而減輕線粒體功能損傷。還可以研發(fā)能夠穩(wěn)定MPTP的藥物，減少其開放程度，保護線粒體膜電位，維持線粒體的正常功能，進而促進ATP的合成，為肌肉細(xì)胞提供充足的能量?？寡趸瘎┑难邪l(fā)和應(yīng)用也至關(guān)重要。鑒于氧化應(yīng)激在動脈硬化閉塞癥發(fā)病過程中的重要作用，尤其是在糖尿病患者中，氧化應(yīng)激會加劇線粒體功能障礙，研發(fā)高效的抗氧化劑，如新型的自由基清除劑，能夠有效清除體內(nèi)過多的活性氧（ROS），減輕氧化應(yīng)激對線粒體的損傷，保護肌肉細(xì)胞。在手術(shù)治療時機選擇方面，本研究結(jié)果提供了明確的指導(dǎo)。肌肉形態(tài)學(xué)變化與缺血程度密切相關(guān)，隨著缺血程度加重，肌肉纖維萎縮、纖維化等病理改變逐漸加劇，這會導(dǎo)致下肢功能嚴(yán)重受損，且難以恢復(fù)。早期進行手術(shù)治療，及時恢復(fù)下肢的血液供應(yīng)，對于保護肌肉組織的形態(tài)和功能至關(guān)重要。在FontaineⅡ期，即輕度缺血階段，患者出現(xiàn)間歇性跛行等癥狀時，就應(yīng)考慮積極進行手術(shù)干預(yù)。此時，肌肉組織的損傷尚處于相對較輕的階段，通過手術(shù)開通閉塞的血管，恢復(fù)血流灌注，能夠有效阻止肌肉形態(tài)進一步惡化，減少肌肉纖維的萎縮和纖維化，維持肌肉的正常結(jié)構(gòu)和功能，從而提高患者的生活質(zhì)量，降低截肢等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險。而如果等到FontaineⅣ期，即嚴(yán)重缺血階段，肌肉組織已經(jīng)發(fā)生嚴(yán)重的壞死和纖維化，此時即使進行手術(shù)治療，也難以完全恢復(fù)下肢的功能，截肢的可能性大大增加。因此，準(zhǔn)確評估患者的缺血程度，把握最佳的手術(shù)治療時機，對于改善患者的預(yù)后具有關(guān)鍵作用。在臨床實踐中，應(yīng)加強對動脈硬化閉塞癥患者的早期診斷和監(jiān)測。通過定期檢測踝肱指數(shù)（ABI）、彩色多普勒超聲等手段，及時