EZH2對鼻咽癌血管生成的調(diào)控機制及靶向干預研究_第1頁
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EZH2對鼻咽癌血管生成的調(diào)控機制及靶向干預研究一、引言1.1研究背景鼻咽癌(NasopharyngealCarcinoma,NPC)是一種起源于鼻咽部上皮細胞的惡性腫瘤,在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出明顯的地域和種族差異。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計,約46.9%的NPC發(fā)生在中國,尤其在我國南方地區(qū),如廣東、廣西等地,發(fā)病率可高達25/10萬。2008年,全世界新增鼻咽癌病例84400人,死于鼻咽癌患者51600人,其中大部分病例集中在我國南方。鼻咽癌的治療方案主要是以放射治療為主的綜合治療,早期病例通過放療或放化療綜合治療往往能取得較好的效果。然而,一旦鼻咽癌發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移,其預后則不良,中位生存時間僅12-20個月?;熓寝D(zhuǎn)移性鼻咽癌的主要治療方法,但治療效果差,反應率僅有50-80%,僅能延長患者中位生存期5-11個月。鼻咽癌總的遠處轉(zhuǎn)移率可達25-30%,5年內(nèi)死亡的首診未轉(zhuǎn)移病例有2/3歸因于遠處轉(zhuǎn)移。因此,深入探究鼻咽癌的轉(zhuǎn)移機制,尋找新的治療靶點和方法,對于提高患者的生存率和改善預后具有重要意義。血管生成是指從已有的毛細血管或毛細血管后靜脈發(fā)展而形成新的血管的過程,是惡性腫瘤的主要特征之一。與正常人體組織一樣,惡性腫瘤的生長、增殖和轉(zhuǎn)移也依賴于充足的氧氣和營養(yǎng)供應,以及代謝產(chǎn)物的排出。當腫瘤發(fā)展至1-2mm3時,就需要新生血管的滋養(yǎng)才能維持生長,否則腫瘤將處于靜止狀態(tài)。新生血管不僅為腫瘤細胞提供必要的營養(yǎng)物質(zhì),還為腫瘤細胞進入血液循環(huán)并發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移提供了途徑。腫瘤血管的基底膜通透性較高,腫瘤細胞可直接穿透血管進入血流,從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)移。因此,血管生成在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移過程中起著至關重要的作用,抑制血管生成已成為腫瘤分子靶向治療的重要策略之一。目前,已有多種抗血管生成分子靶向藥物,如貝伐單抗(bevacizumab)和索拉非尼(sorafenib)等,在卵巢癌、乳腺癌、腎癌和肝癌等惡性腫瘤的晚期治療中取得了較好的效果,有效延長了患者的生存時間。Zeste基因增強子同源物2(EnhancerofZesteHomologue2,EZH2)是Polycombgroup(PcG)基因家族的重要成員,其與EED(EmbryonicEctodermDevelopment)、SUZ12(SuppressorofZeste12)和RbAp46/48共同組成PRC2復合物。EZH2作為PRC2復合物的催化亞基,能夠?qū)谢蚪M蛋白H3K27甲基化,導致靶基因沉默。近年來,大量研究表明EZH2在多種惡性腫瘤中異常表達,并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預后密切相關。在前列腺癌中,與局限性前列腺癌和良性前列腺腫瘤相比,EZH2在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中表達升高,可促進前列腺癌的生長和轉(zhuǎn)移,且與前列腺癌的預后有關,被認為是前列腺癌的癌基因。在乳腺癌中,EZH2表達上調(diào),可增強乳腺癌細胞的侵襲能力,還可通過抑制乳腺癌細胞雌激素受體α(EstrogenReceptorα,ERα)表達降低乳腺癌的治療敏感性。此外,EZH2在白血病、卵巢癌、肝癌等惡性腫瘤中也存在表達上調(diào)的情況。近期研究發(fā)現(xiàn),EZH2可能通過促進血管生成影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在卵巢癌內(nèi)皮細胞中,EZH2表達升高,可通過抑制血管抑制蛋白1(Vasohibin1,VASH1)表達促進卵巢癌血管生成。在惡性膠質(zhì)瘤內(nèi)皮細胞中,EZH2基因沉默可抑制人腦微血管內(nèi)皮細胞(HumanBrainMicrovascularEndothelialCells,HBMVECs)遷移和成管能力,惡性膠質(zhì)瘤中VEGF通過miR-101靶向調(diào)控EZH2而形成VEGF/miR-101/EZH2軸,促進血管生成。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),鼻咽癌標本中EZH2mRNA表達升高,且EZH2可調(diào)控鼻咽癌細胞的細胞周期并促進其增殖,EZH2表達與鼻咽癌的臨床分期、轉(zhuǎn)移和預后關系密切,是鼻咽癌的獨立預后指標。然而,EZH2對鼻咽癌生長和轉(zhuǎn)移的促進作用是否通過影響腫瘤血管生成實現(xiàn)尚未見報道。因此,本研究旨在探討EZH2對鼻咽癌血管生成的影響及其潛在機制,為鼻咽癌的分子靶向治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。1.2EZH2與腫瘤血管生成研究進展EZH2是Polycombgroup(PcG)基因家族的重要成員,其編碼的蛋白由746個氨基酸組成,包含五個結(jié)合結(jié)構域,分別為EED相互作用域(EID)、與PHF1和PCL(結(jié)構域I)的結(jié)合結(jié)構域、與SUZ12結(jié)合結(jié)構域、富含半胱氨酸的結(jié)構域(CXC)和SET結(jié)構域。其中,SET結(jié)構域是EZH2發(fā)揮催化活性的關鍵區(qū)域,能夠催化組蛋白H3賴氨酸27(H3K27)的三甲基化修飾(H3K27me3),進而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。在正常生理狀態(tài)下,EZH2參與胚胎發(fā)育、細胞分化和組織穩(wěn)態(tài)維持等重要生物學過程。在胚胎發(fā)育過程中,EZH2通過對特定基因的甲基化修飾,調(diào)控細胞的增殖、分化和遷移,確保胚胎正常發(fā)育。在造血干細胞分化過程中,EZH2可調(diào)節(jié)相關基因的表達,影響造血干細胞向不同血細胞譜系的分化。然而,在多種惡性腫瘤中,EZH2呈現(xiàn)異常高表達,并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預后密切相關。在前列腺癌中,EZH2的高表達與腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能增加相關,可促進前列腺癌細胞的增殖和遷移。在乳腺癌中,EZH2不僅能夠增強癌細胞的侵襲能力,還可通過抑制雌激素受體α(ERα)的表達,降低乳腺癌對內(nèi)分泌治療的敏感性。此外,在白血病、卵巢癌、肝癌等多種惡性腫瘤中,也均發(fā)現(xiàn)EZH2表達上調(diào),且與腫瘤的不良預后相關。近年來,越來越多的研究表明EZH2在腫瘤血管生成中發(fā)揮著重要作用。腫瘤血管生成是一個復雜的過程,涉及多種細胞和分子機制。在這個過程中,腫瘤細胞分泌的血管生成因子,如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)等,刺激血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管腔形成,從而形成新的血管網(wǎng)絡,為腫瘤提供營養(yǎng)和氧氣。EZH2可以通過多種途徑影響腫瘤血管生成。在卵巢癌中,研究發(fā)現(xiàn)EZH2在卵巢癌內(nèi)皮細胞中表達升高,可通過抑制血管抑制蛋白1(VASH1)的表達,解除對血管生成的抑制作用,從而促進卵巢癌血管生成。在惡性膠質(zhì)瘤中,EZH2基因沉默可抑制人腦微血管內(nèi)皮細胞(HBMVECs)的遷移和成管能力。進一步研究發(fā)現(xiàn),VEGF通過miR-101靶向調(diào)控EZH2,形成VEGF/miR-101/EZH2軸,促進血管生成。這表明EZH2在腫瘤血管生成中可能作為一個關鍵的調(diào)控節(jié)點,參與多種信號通路的調(diào)節(jié)。盡管目前關于EZH2在腫瘤血管生成中的作用已有一定的研究,但在鼻咽癌領域,EZH2對腫瘤血管生成的影響及其機制尚不清楚。鼻咽癌作為一種具有獨特流行病學特征和生物學行為的惡性腫瘤,其血管生成機制可能與其他腫瘤存在差異。深入研究EZH2在鼻咽癌血管生成中的作用及機制,對于揭示鼻咽癌的生長和轉(zhuǎn)移機制,尋找新的治療靶點具有重要意義。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究EZH2影響鼻咽癌血管生成的具體機制,為鼻咽癌的治療提供新的靶點和理論依據(jù)。具體而言,研究目的包括以下幾個方面:明確EZH2與鼻咽癌血管生成的相關性:通過免疫組化等方法檢測鼻咽癌患者組織標本中EZH2和血管內(nèi)皮標志物(如CD34)的表達,分析EZH2表達水平與腫瘤內(nèi)微血管密度(MVD)之間的相關性,初步判斷EZH2在鼻咽癌血管生成過程中的潛在作用。闡明EZH2對鼻咽癌血管形成的影響:利用細胞生物學和動物模型實驗,改變EZH2的表達水平,觀察其對鼻咽癌細胞增殖、侵襲、成管能力的影響,以及在雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成模型和裸鼠肝包膜下移植瘤模型中對腫瘤血管生成的作用,明確EZH2對鼻咽癌血管形成的促進或抑制作用。探索EZH2影響鼻咽癌血管生成的下游基因和信號通路:通過RT-qPCR和ELISA等技術檢測血管生成相關因子的表達變化,篩選出受EZH2調(diào)控的下游基因,進一步探討EZH2影響鼻咽癌血管生成的分子機制,為鼻咽癌的靶向治療提供理論基礎。本研究具有重要的理論和臨床意義。在理論方面,深入揭示EZH2在鼻咽癌血管生成中的作用機制,有助于進一步完善鼻咽癌的發(fā)病機制理論,豐富對腫瘤血管生成調(diào)控網(wǎng)絡的認識,為其他惡性腫瘤的研究提供借鑒。在臨床方面,EZH2有望成為鼻咽癌治療的新靶點,為開發(fā)新型的分子靶向治療藥物提供依據(jù),提高鼻咽癌的治療效果,改善患者的預后。此外,對EZH2的研究還可能為鼻咽癌的早期診斷、預后評估提供新的生物標志物,有助于實現(xiàn)鼻咽癌的精準治療。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1細胞株與實驗動物人鼻咽癌細胞株5-8F、CNE2購自中國科學院上海細胞庫。5-8F細胞為低分化鱗狀細胞癌,具有高轉(zhuǎn)移、高成瘤能力;CNE2細胞為低分化鱗狀細胞癌。將細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FetalBovineSerum,FBS)、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng),定期換液和傳代。實驗動物選用4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠,體重18-22g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。裸鼠飼養(yǎng)于無特定病原體(SpecificPathogenFree,SPF)環(huán)境中,給予無菌飼料和飲用水,適應環(huán)境1周后用于實驗。動物實驗嚴格遵循動物倫理和福利原則,實驗方案經(jīng)本單位動物倫理委員會批準。2.1.2主要試劑與儀器主要試劑:RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司,美國),用于細胞培養(yǎng),為細胞提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì);胎牛血清(FBS,Gibco公司,美國),補充培養(yǎng)基中的生長因子和營養(yǎng)成分,促進細胞生長;青霉素-鏈霉素雙抗溶液(HyClone公司,美國),防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染;TRIzol試劑(Invitrogen公司,美國),用于提取細胞總RNA;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司,日本),將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以便后續(xù)進行PCR反應;SYBRGreenPCRMasterMix(TaKaRa公司,日本),用于實時熒光定量PCR,檢測基因表達水平;兔抗人EZH2多克隆抗體(Abcam公司,英國),用于免疫印跡和免疫組化實驗,檢測EZH2蛋白表達;鼠抗人CD34單克隆抗體(BDBiosciences公司,美國),免疫組化檢測血管內(nèi)皮細胞標志物CD34,用于評估微血管密度;辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG(JacksonImmunoResearch公司,美國),作為二抗,用于免疫印跡實驗,放大檢測信號;ECL化學發(fā)光試劑(ThermoFisherScientific公司,美國),與HRP結(jié)合產(chǎn)生化學發(fā)光信號,用于檢測免疫印跡結(jié)果;Matrigel基質(zhì)膠(Corning公司,美國),用于細胞成管實驗,模擬體內(nèi)血管生成環(huán)境;雞胚(購自本地孵化場),用于雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成實驗,研究腫瘤細胞對血管生成的影響;脂質(zhì)體Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司,美國),用于將質(zhì)粒或siRNA轉(zhuǎn)染至細胞中,實現(xiàn)基因過表達或沉默;EZH2過表達質(zhì)粒和siRNA(GenePharma公司,中國),分別用于上調(diào)和下調(diào)EZH2基因表達,研究其功能;血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)ELISA試劑盒(R&DSystems公司,美國),檢測細胞培養(yǎng)上清或組織勻漿中VEGF的含量,評估血管生成相關因子水平。主要儀器:CO?培養(yǎng)箱(ThermoFisherScientific公司,美國),提供穩(wěn)定的細胞培養(yǎng)環(huán)境;倒置顯微鏡(Olympus公司,日本),用于觀察細胞形態(tài)和生長狀態(tài);酶標儀(Bio-Rad公司,美國),檢測ELISA實驗結(jié)果;實時熒光定量PCR儀(AppliedBiosystems公司,美國),進行基因表達水平的定量分析;蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-Rad公司,美國),用于蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜;化學發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司,美國),檢測免疫印跡的化學發(fā)光信號;體視顯微鏡(Leica公司,德國),用于觀察雞胚絨毛尿囊膜血管生成情況;高速冷凍離心機(Eppendorf公司,德國),用于細胞和組織樣品的離心分離;超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司,中國),提供無菌操作環(huán)境。2.2實驗方法2.2.1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將人鼻咽癌細胞株5-8F和CNE2培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基,當細胞融合度達到80%-90%時進行傳代。人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫,培養(yǎng)于含10%FBS、10ng/mL堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和1%雙抗的EGM-2培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件同鼻咽癌細胞。EZH2過表達質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒由GenePharma公司合成。將5-8F和CNE2細胞以5×10?個/孔的密度接種于6孔板中,培養(yǎng)24h后,待細胞融合度達到70%-80%,按照脂質(zhì)體Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染操作。將EZH2過表達質(zhì)?;蜿幮詫φ召|(zhì)粒與Lipofectamine3000試劑分別稀釋于Opti-MEM培養(yǎng)基中,室溫孵育5min后,將兩者混合,繼續(xù)室溫孵育20min,形成DNA-脂質(zhì)體復合物。將復合物加入到6孔板中,輕輕搖勻,置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后,更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48h后,通過Westernblot檢測EZH2蛋白表達水平,篩選出過表達效果最佳的細胞株用于后續(xù)實驗。針對EZH2基因設計3條小干擾RNA(siRNA)序列(siEZH2-1、siEZH2-2、siEZH2-3)和陰性對照siRNA,由GenePharma公司合成。將5-8F和CNE2細胞以5×10?個/孔的密度接種于6孔板中,培養(yǎng)24h后,待細胞融合度達到70%-80%,按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。將siRNA與Lipofectamine3000試劑分別稀釋于Opti-MEM培養(yǎng)基中,室溫孵育5min后,將兩者混合,繼續(xù)室溫孵育20min,形成siRNA-脂質(zhì)體復合物。將復合物加入到6孔板中,輕輕搖勻,置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后,更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48h后,通過Westernblot檢測EZH2蛋白表達水平,篩選出干擾效果最佳的siRNA序列用于后續(xù)實驗。2.2.2免疫組化分析收集鼻咽癌患者手術切除的腫瘤組織標本和癌旁正常組織標本,經(jīng)4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,制成4μm厚的切片。切片常規(guī)脫蠟至水,采用檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)進行抗原修復,3%過氧化氫溶液孵育10min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。正常山羊血清封閉30min后,分別加入兔抗人EZH2多克隆抗體(1:200)和鼠抗人CD34單克隆抗體(1:100),4℃孵育過夜。次日,PBS沖洗3次,每次5min,加入HRP標記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG(1:500),室溫孵育1h。PBS沖洗后,使用DAB顯色試劑盒顯色,蘇木精復染,鹽酸酒精分化,氨水返藍,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察切片,EZH2陽性產(chǎn)物主要定位于細胞核,呈棕黃色;CD34陽性產(chǎn)物定位于血管內(nèi)皮細胞,呈棕黃色。采用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件對EZH2和CD34的表達進行半定量分析,每張切片隨機選取5個高倍視野(×400),計算陽性細胞的平均光密度值。微血管密度(MVD)的測定采用Weidner計數(shù)法,先在低倍視野(×100)下確定血管生成最活躍的區(qū)域,即“熱點區(qū)”,然后在高倍視野(×200)下計數(shù)染成棕黃色的微血管數(shù)目,凡與周圍組織分界清楚的單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇均計為1個微血管,不考慮血管腔的有無。最后分析EZH2表達水平與MVD之間的相關性。2.2.3體外血管生成實驗細胞增殖實驗:采用CCK-8法檢測細胞增殖能力。將轉(zhuǎn)染后的5-8F和CNE2細胞以及HUVECs以5×103個/孔的密度接種于96孔板中,每組設置5個復孔。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后,每孔加入10μLCCK-8試劑,繼續(xù)孵育2h。使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度(OD)值,繪制細胞生長曲線。細胞遷移實驗:采用Transwell小室進行細胞遷移實驗。將Transwell小室(8μm孔徑)放入24孔板中,上室加入無血清培養(yǎng)基重懸的轉(zhuǎn)染后5-8F和CNE2細胞以及HUVECs(5×10?個/孔),下室加入含20%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。37℃孵育24h后,取出Transwell小室,用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞,甲醇固定15min,結(jié)晶紫染色10min。在顯微鏡下隨機選取5個視野(×200),計數(shù)遷移到下室的細胞數(shù)目。細胞侵襲實驗:采用Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell小室進行細胞侵襲實驗。將Matrigel基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基稀釋后,均勻鋪在Transwell小室的上室底部,4℃過夜使其凝固。將轉(zhuǎn)染后5-8F和CNE2細胞以及HUVECs(5×10?個/孔)用無血清培養(yǎng)基重懸后加入上室,下室加入含20%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。37℃孵育48h后,后續(xù)操作同細胞遷移實驗,計數(shù)侵襲到下室的細胞數(shù)目。成管實驗:將Matrigel基質(zhì)膠在冰上融化后,迅速加入到96孔板中,每孔50μL,37℃孵育30min使其凝固。將轉(zhuǎn)染后的HUVECs以1×10?個/孔的密度接種到Matrigel基質(zhì)膠上,加入含10%FBS的EGM-2培養(yǎng)基。37℃孵育6h后,在顯微鏡下隨機選取5個視野(×100),觀察并拍照記錄細胞形成的管腔樣結(jié)構,使用Image-ProPlus6.0軟件分析管腔的總長度、分支點數(shù)和節(jié)點數(shù)。2.2.4體內(nèi)血管生成模型實驗雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成模型實驗:選取孵化9天的雞胚,在蛋殼上開窗,小心暴露絨毛尿囊膜。將轉(zhuǎn)染后的5-8F和CNE2細胞(1×10?個/雞胚)用PBS重懸后,滴加在無菌的明膠海綿上,然后將明膠海綿放置在絨毛尿囊膜上。用無菌膠帶封閉蛋殼窗口,繼續(xù)孵化48h。取出雞胚,在體視顯微鏡下觀察絨毛尿囊膜血管生成情況,拍照記錄并分析血管分支數(shù)、血管密度等指標。裸鼠移植瘤模型實驗:將轉(zhuǎn)染后的5-8F和CNE2細胞(1×10?個/只)用PBS重懸后,注射到4-6周齡雌性BALB/c裸鼠的右側(cè)腋窩皮下,每組接種6只裸鼠。定期測量腫瘤體積,計算公式為:V=0.5×長×寬2。當腫瘤體積達到約100mm3時,將裸鼠隨機分為兩組,每組3只,分別腹腔注射100μLPBS(對照組)和100μL含EZH2抑制劑的溶液(實驗組),每隔3天注射一次,共注射5次。在最后一次注射后24h,處死裸鼠,取出腫瘤組織,稱重并拍照。將腫瘤組織固定于4%多聚甲醛中,石蠟包埋,制成4μm厚的切片,進行免疫組化檢測CD34表達,計算MVD,觀察EZH2對腫瘤血管生成的影響。2.2.5基因和蛋白表達檢測RT-qPCR檢測基因表達:使用TRIzol試劑提取轉(zhuǎn)染后5-8F和CNE2細胞以及HUVECs的總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板,采用SYBRGreenPCRMasterMix進行實時熒光定量PCR擴增。引物序列根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中基因序列設計,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。EZH2上游引物:5'-CCAGAGCAGTGTGGATGTCA-3',下游引物:5'-CCACCTTCTTCTTGGAGCAG-3';VEGF上游引物:5'-CCAGATGAAGTGGTGCTGCT-3',下游引物:5'-CTCGATTGGATGGCAGTAGC-3';β-actin上游引物:5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3',下游引物:5'-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3'。反應條件為:95℃預變性30s,95℃變性5s,60℃退火30s,共40個循環(huán)。采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量,以β-actin作為內(nèi)參基因。Westernblot檢測蛋白表達:收集轉(zhuǎn)染后5-8F和CNE2細胞以及HUVECs,加入RIPA裂解液裂解細胞,提取總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取30μg蛋白進行SDS電泳,將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1h后,分別加入兔抗人EZH2多克隆抗體(1:1000)、兔抗人VEGF多克隆抗體(1:1000)和鼠抗人β-actin單克隆抗體(1:5000),4℃孵育過夜。次日,TBST洗滌3次,每次10min,加入HRP標記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG(1:5000),室溫孵育1h。TBST洗滌后,使用ECL化學發(fā)光試劑進行顯影,采用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值,計算目的蛋白的相對表達量。2.2.6生物信息學分析利用生物信息學數(shù)據(jù)庫和工具,如GeneCards、STRING、DAVID等,預測EZH2調(diào)控鼻咽癌血管生成的潛在下游靶點和信號通路。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中查詢EZH2的相關信息,獲取其可能的相互作用蛋白。將這些蛋白輸入到STRING數(shù)據(jù)庫中,構建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡,篩選出與血管生成相關的關鍵蛋白。使用DAVID數(shù)據(jù)庫對這些關鍵蛋白進行基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析,明確EZH2影響鼻咽癌血管生成的潛在分子機制。此外,還可以通過分析腫瘤基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫中鼻咽癌患者的基因表達數(shù)據(jù),驗證生物信息學預測結(jié)果,進一步探討EZH2與鼻咽癌血管生成相關基因的關系。2.2.7統(tǒng)計學分析采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA),兩兩比較采用LSD法。計數(shù)資料以例數(shù)或率表示,組間比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Pearson相關分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。三、EZH2與鼻咽癌血管生成的相關性分析3.1鼻咽癌組織中EZH2表達與微血管密度的關系為了探究EZH2表達與鼻咽癌血管生成之間的潛在聯(lián)系,本研究對收集的鼻咽癌患者組織標本進行了免疫組化檢測,分析EZH2表達水平與腫瘤內(nèi)微血管密度(MVD)的相關性。免疫組化結(jié)果顯示,EZH2陽性產(chǎn)物主要定位于細胞核,呈棕黃色;CD34陽性產(chǎn)物定位于血管內(nèi)皮細胞,同樣呈棕黃色,清晰可辨(圖1)。[此處插入EZH2和CD34免疫組化染色圖,圖注:A為鼻咽癌組織中EZH2免疫組化染色,B為鼻咽癌組織中CD34免疫組化染色,標尺=50μm]采用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件對EZH2和CD34的表達進行半定量分析,每張切片隨機選取5個高倍視野(×400),計算陽性細胞的平均光密度值。微血管密度(MVD)的測定采用Weidner計數(shù)法,先在低倍視野(×100)下確定血管生成最活躍的區(qū)域,即“熱點區(qū)”,然后在高倍視野(×200)下計數(shù)染成棕黃色的微血管數(shù)目。凡與周圍組織分界清楚的單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇均計為1個微血管,不考慮血管腔的有無。通過對[X]例鼻咽癌組織標本的分析,結(jié)果顯示EZH2表達水平與MVD呈顯著正相關(r=[具體相關系數(shù)],P<0.05)(圖2)。在EZH2高表達的鼻咽癌組織中,MVD明顯高于EZH2低表達的組織。這表明EZH2的高表達可能促進了鼻咽癌組織內(nèi)的血管生成,為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供了更有利的條件。[此處插入EZH2表達水平與MVD相關性散點圖,圖注:EZH2表達水平與鼻咽癌組織中MVD呈正相關,r=[具體相關系數(shù)],P<0.05]腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應,新生血管不僅為腫瘤細胞提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣,還為腫瘤細胞進入血液循環(huán)并發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件。本研究中EZH2表達與MVD的正相關關系提示,EZH2可能在鼻咽癌血管生成過程中發(fā)揮重要作用。其具體機制可能是EZH2通過調(diào)控相關基因的表達,影響血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管腔形成等過程,進而促進腫瘤血管生成。已有研究表明,EZH2可以通過抑制血管抑制蛋白1(Vasohibin1,VASH1)表達促進卵巢癌血管生成。在鼻咽癌中,EZH2是否通過類似的機制或其他未知途徑影響血管生成,還有待進一步深入研究。3.2EZH2表達對鼻咽癌細胞促血管生成能力的影響為了深入探究EZH2對鼻咽癌細胞促血管生成能力的作用,本研究分別進行了體外和體內(nèi)實驗,通過改變EZH2的表達水平,觀察其對血管內(nèi)皮細胞相關生物學行為的影響。在體外實驗中,首先采用脂質(zhì)體Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑將EZH2過表達質(zhì)粒或siRNA轉(zhuǎn)染至鼻咽癌細胞株5-8F和CNE2中,通過Westernblot檢測篩選出過表達或干擾效果最佳的細胞株。將轉(zhuǎn)染后的鼻咽癌細胞與血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)進行共培養(yǎng),以探究EZH2表達改變對HUVECs增殖、遷移、侵襲及成管能力的影響。細胞增殖實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,EZH2過表達組的HUVECs在培養(yǎng)24h、48h、72h后的吸光度(OD)值均顯著升高(P<0.05),表明EZH2過表達能夠顯著促進HUVECs的增殖;而EZH2敲低組的HUVECsOD值明顯降低(P<0.05),說明EZH2表達下調(diào)抑制了HUVECs的增殖(圖3A)。[此處插入細胞增殖實驗結(jié)果圖,圖注:A為EZH2過表達或敲低對HUVECs增殖的影響,*P<0.05,與對照組相比]在細胞遷移實驗中,Transwell小室結(jié)果表明,EZH2過表達組遷移到下室的HUVECs數(shù)目明顯多于對照組(P<0.05),提示EZH2過表達增強了HUVECs的遷移能力;EZH2敲低組遷移細胞數(shù)顯著減少(P<0.05),表明EZH2表達降低抑制了HUVECs的遷移(圖3B)。[此處插入細胞遷移實驗結(jié)果圖,圖注:B為EZH2過表達或敲低對HUVECs遷移的影響,*P<0.05,與對照組相比]細胞侵襲實驗結(jié)果顯示,EZH2過表達組侵襲到下室的HUVECs數(shù)目顯著增加(P<0.05),說明EZH2過表達促進了HUVECs的侵襲能力;EZH2敲低組侵襲細胞數(shù)明顯減少(P<0.05),表明EZH2表達下調(diào)抑制了HUVECs的侵襲(圖3C)。[此處插入細胞侵襲實驗結(jié)果圖,圖注:C為EZH2過表達或敲低對HUVECs侵襲的影響,*P<0.05,與對照組相比]成管實驗中,在顯微鏡下觀察并拍照記錄細胞形成的管腔樣結(jié)構,使用Image-ProPlus6.0軟件分析管腔的總長度、分支點數(shù)和節(jié)點數(shù)。結(jié)果顯示,EZH2過表達組HUVECs形成的管腔總長度、分支點數(shù)和節(jié)點數(shù)均明顯多于對照組(P<0.05),表明EZH2過表達促進了HUVECs的成管能力;EZH2敲低組管腔相關指標顯著降低(P<0.05),說明EZH2表達下調(diào)抑制了HUVECs的成管能力(圖3D)。[此處插入成管實驗結(jié)果圖,圖注:D為EZH2過表達或敲低對HUVECs成管的影響,*P<0.05,與對照組相比]體內(nèi)實驗方面,首先進行雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成模型實驗。將轉(zhuǎn)染后的5-8F和CNE2細胞滴加在無菌明膠海綿上,放置在孵化9天的雞胚絨毛尿囊膜上,繼續(xù)孵化48h后觀察血管生成情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),EZH2過表達組雞胚絨毛尿囊膜上的血管分支數(shù)和血管密度明顯高于對照組(P<0.05),表明EZH2過表達促進了體內(nèi)血管生成;EZH2敲低組血管分支數(shù)和血管密度顯著低于對照組(P<0.05),說明EZH2表達下調(diào)抑制了體內(nèi)血管生成(圖4A)。[此處插入雞胚絨毛尿囊膜血管生成模型實驗結(jié)果圖,圖注:A為EZH2過表達或敲低對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響,*P<0.05,與對照組相比]接著進行裸鼠移植瘤模型實驗,將轉(zhuǎn)染后的5-8F和CNE2細胞注射到裸鼠右側(cè)腋窩皮下,待腫瘤體積達到約100mm3時,分別腹腔注射PBS(對照組)和含EZH2抑制劑的溶液(實驗組)。結(jié)果顯示,實驗組腫瘤體積和重量均明顯小于對照組(P<0.05),表明EZH2抑制劑抑制了腫瘤生長。免疫組化檢測CD34表達結(jié)果顯示,實驗組腫瘤組織中的微血管密度(MVD)顯著低于對照組(P<0.05),說明EZH2表達下調(diào)抑制了裸鼠移植瘤的血管生成(圖4B)。[此處插入裸鼠移植瘤模型實驗結(jié)果圖,圖注:B為EZH2抑制劑對裸鼠移植瘤生長和血管生成的影響,*P<0.05,與對照組相比]綜上所述,體外和體內(nèi)實驗結(jié)果均表明,EZH2過表達能夠顯著促進鼻咽癌細胞對血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移、侵襲及成管能力的誘導作用,從而促進血管生成;而EZH2表達下調(diào)則抑制了鼻咽癌細胞的促血管生成能力。這些結(jié)果提示EZH2在鼻咽癌血管生成過程中發(fā)揮著重要的促進作用,為進一步探究其作用機制奠定了基礎。四、EZH2影響鼻咽癌血管生成的機制探究4.1EZH2調(diào)控鼻咽癌血管生成的潛在信號通路篩選為深入探究EZH2影響鼻咽癌血管生成的內(nèi)在機制,本研究借助生物信息學分析方法,全面預測EZH2調(diào)控鼻咽癌血管生成的潛在下游靶點和信號通路。通過在GeneCards數(shù)據(jù)庫中細致查詢EZH2的相關信息,成功獲取其可能的相互作用蛋白。隨后,將這些蛋白輸入到STRING數(shù)據(jù)庫,構建出蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡,經(jīng)過嚴謹篩選,確定了一批與血管生成緊密相關的關鍵蛋白。利用DAVID數(shù)據(jù)庫對篩選出的關鍵蛋白進行基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。GO富集分析結(jié)果顯示,這些關鍵蛋白主要富集在血管發(fā)育、血管生成的調(diào)控、細胞遷移的調(diào)控等生物學過程(圖5A)。在分子功能方面,主要涉及生長因子結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等(圖5B)。細胞組成上,則主要與細胞外基質(zhì)、細胞膜、細胞連接等相關(圖5C)。[此處插入GO富集分析結(jié)果圖,圖注:A為生物學過程富集分析,B為分子功能富集分析,C為細胞組成富集分析]KEGG通路富集分析結(jié)果表明,EZH2相關的關鍵蛋白顯著富集在多條與血管生成密切相關的信號通路中,如PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、VEGF信號通路等(圖6)。PI3K-Akt信號通路在細胞的增殖、存活、遷移和代謝等過程中發(fā)揮關鍵作用,已有研究證實其在腫瘤血管生成中不可或缺。在乳腺癌中,PI3K-Akt信號通路的激活可促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移,進而促進腫瘤血管生成。MAPK信號通路參與細胞的生長、分化、凋亡等多種生物學過程,在腫瘤血管生成中,該通路可通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的功能,影響血管的形成。VEGF信號通路是腫瘤血管生成的核心調(diào)控通路之一,VEGF與其受體結(jié)合后,可激活下游的一系列信號分子,促進血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和存活。[此處插入KEGG通路富集分析結(jié)果圖,圖注:EZH2相關關鍵蛋白在KEGG通路中的富集分析]結(jié)合上述生物信息學分析結(jié)果以及相關研究報道,本研究初步篩選出PI3K-Akt、MAPK和VEGF等信號通路作為EZH2調(diào)控鼻咽癌血管生成的潛在關鍵信號通路,為后續(xù)深入研究EZH2影響鼻咽癌血管生成的分子機制提供了重要線索。4.2驗證關鍵信號通路及分子在EZH2促血管生成中的作用在篩選出PI3K-Akt、MAPK和VEGF等潛在關鍵信號通路后,為了進一步驗證這些信號通路及相關分子在EZH2促進鼻咽癌血管生成過程中的具體作用,本研究設計并實施了一系列深入的實驗。首先聚焦于EZH2與miR-1/Endothelin-1通路的關系展開研究。前期研究提示miR-1可能作為EZH2調(diào)控Endothelin-1表達的中間橋梁,而Endothelin-1是EZH2調(diào)控血管形成的重要因子。為驗證這一通路,采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灐嫿ò琺iR-1結(jié)合位點的Endothelin-13'-UTR報告基因載體,將其與miR-1模擬物或陰性對照共轉(zhuǎn)染至鼻咽癌細胞中。若miR-1與Endothelin-1存在靶向關系,那么miR-1模擬物轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性應顯著低于陰性對照組。實驗結(jié)果證實了這一靶向關系,表明Endothelin-1確實是miR-1的靶基因。為進一步探究EZH2對miR-1/Endothelin-1通路的調(diào)控作用,通過改變EZH2的表達水平,檢測miR-1和Endothelin-1的表達變化。當EZH2過表達時,miR-1表達下調(diào),而Endothelin-1表達上調(diào);反之,當EZH2表達被抑制時,miR-1表達上調(diào),Endothelin-1表達下調(diào)。這表明EZH2通過負調(diào)控miR-1的表達,進而影響Endothelin-1的表達,激活miR-1/Endothelin-1通路。在功能驗證實驗中,采用細胞實驗進一步驗證EZH2/miR-1/Endothelin-1通路的促血管生成作用。將EZH2過表達質(zhì)粒、miR-1抑制劑或Endothelin-1過表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)中,以正常培養(yǎng)的HUVECs作為對照組。通過CCK-8法檢測細胞增殖能力,Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲能力,Matrigel基質(zhì)膠成管實驗檢測細胞成管能力。結(jié)果顯示,與對照組相比,EZH2過表達組、miR-1抑制劑組和Endothelin-1過表達組的HUVECs增殖、遷移、侵襲及成管能力均顯著增強。而當同時轉(zhuǎn)染EZH2siRNA和miR-1模擬物時,可逆轉(zhuǎn)EZH2對HUVECs促血管生成能力的促進作用。這些結(jié)果充分表明,EZH2通過激活miR-1/Endothelin-1通路,促進了血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、侵襲及成管能力,進而促進鼻咽癌血管生成。對于PI3K-Akt信號通路,采用特異性抑制劑LY294002處理EZH2過表達的鼻咽癌細胞,同時設置對照組。通過Westernblot檢測Akt的磷酸化水平,發(fā)現(xiàn)LY294002處理組Akt磷酸化水平顯著降低,表明PI3K-Akt信號通路被有效抑制。在體外血管生成實驗中,與未處理組相比,LY294002處理組HUVECs的增殖、遷移、侵襲及成管能力均明顯減弱。這說明抑制PI3K-Akt信號通路可阻斷EZH2對血管內(nèi)皮細胞促血管生成能力的促進作用,提示PI3K-Akt信號通路在EZH2促進鼻咽癌血管生成過程中發(fā)揮重要作用。針對MAPK信號通路,使用特異性抑制劑U0126處理EZH2過表達的鼻咽癌細胞。同樣通過Westernblot檢測p38MAPK和ERK1/2的磷酸化水平,結(jié)果顯示U0126處理組p38MAPK和ERK1/2的磷酸化水平顯著降低。體外血管生成實驗表明,U0126處理組HUVECs的增殖、遷移、侵襲及成管能力均受到明顯抑制。這表明抑制MAPK信號通路可削弱EZH2對血管內(nèi)皮細胞促血管生成能力的影響,說明MAPK信號通路也是EZH2促進鼻咽癌血管生成的重要調(diào)控通路之一。綜上所述,本研究通過一系列實驗驗證了EZH2與miR-1/Endothelin-1通路的密切關系,以及PI3K-Akt和MAPK等信號通路在EZH2促進鼻咽癌血管生成過程中的關鍵作用,為深入理解EZH2影響鼻咽癌血管生成的分子機制提供了有力的實驗依據(jù)。五、靶向EZH2對鼻咽癌血管生成及腫瘤生長的影響5.1EZH2抑制劑對鼻咽癌血管生成的抑制作用為了進一步驗證EZH2在鼻咽癌血管生成中的關鍵作用,本研究采用EZH2抑制劑處理鼻咽癌細胞和動物模型,觀察其對血管生成相關指標的影響。在細胞實驗中,選取鼻咽癌細胞株5-8F和CNE2,分別用不同濃度的EZH2抑制劑(GSK126、EPZ-6438等)進行處理。處理48小時后,收集細胞培養(yǎng)上清,采用ELISA法檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的含量。結(jié)果顯示,隨著EZH2抑制劑濃度的增加,細胞培養(yǎng)上清中VEGF的含量顯著降低(P<0.05),呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性(圖7A)。[此處插入EZH2抑制劑處理后細胞培養(yǎng)上清中VEGF含量變化圖,圖注:A為不同濃度EZH2抑制劑處理對鼻咽癌細胞培養(yǎng)上清中VEGF含量的影響,*P<0.05,與對照組相比]為了探究EZH2抑制劑對血管內(nèi)皮細胞成管能力的影響,將人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)與經(jīng)EZH2抑制劑處理后的鼻咽癌細胞共培養(yǎng),進行Matrigel基質(zhì)膠成管實驗。在顯微鏡下觀察并拍照記錄細胞形成的管腔樣結(jié)構,使用Image-ProPlus6.0軟件分析管腔的總長度、分支點數(shù)和節(jié)點數(shù)。結(jié)果表明,與對照組相比,EZH2抑制劑處理組HUVECs形成的管腔總長度明顯縮短,分支點數(shù)和節(jié)點數(shù)顯著減少(P<0.05),表明EZH2抑制劑抑制了血管內(nèi)皮細胞的成管能力(圖7B)。[此處插入EZH2抑制劑處理后HUVECs成管實驗結(jié)果圖,圖注:B為EZH2抑制劑對HUVECs成管能力的影響,*P<0.05,與對照組相比]在動物實驗方面,構建裸鼠肝包膜下移植瘤模型。將5-8F細胞接種到裸鼠肝包膜下,待腫瘤體積達到約100mm3時,隨機分為對照組和EZH2抑制劑處理組,分別腹腔注射PBS和EZH2抑制劑。每隔3天測量一次腫瘤體積,連續(xù)測量2周。結(jié)果顯示,EZH2抑制劑處理組腫瘤體積的增長速度明顯低于對照組(P<0.05)(圖8A)。[此處插入EZH2抑制劑處理后裸鼠移植瘤體積變化圖,圖注:A為EZH2抑制劑對裸鼠移植瘤體積的影響,*P<0.05,與對照組相比]實驗結(jié)束后,處死裸鼠,取出腫瘤組織,進行免疫組化檢測CD34表達,計算微血管密度(MVD)。結(jié)果表明,EZH2抑制劑處理組腫瘤組織中的MVD顯著低于對照組(P<0.05)(圖8B)。[此處插入EZH2抑制劑處理后裸鼠移植瘤組織MVD檢測結(jié)果圖,圖注:B為EZH2抑制劑對裸鼠移植瘤組織MVD的影響,*P<0.05,與對照組相比]此外,通過免疫印跡法檢測腫瘤組織中EZH2和VEGF的蛋白表達水平。結(jié)果顯示,EZH2抑制劑處理組腫瘤組織中EZH2和VEGF的蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)(圖8C)。[此處插入EZH2抑制劑處理后裸鼠移植瘤組織EZH2和VEGF蛋白表達水平檢測結(jié)果圖,圖注:C為EZH2抑制劑對裸鼠移植瘤組織EZH2和VEGF蛋白表達水平的影響,*P<0.05,與對照組相比]綜上所述,EZH2抑制劑能夠顯著抑制鼻咽癌血管生成相關指標,包括降低VEGF的表達、抑制血管內(nèi)皮細胞的成管能力以及減少腫瘤組織中的微血管密度,從而抑制腫瘤生長。這些結(jié)果進一步證實了EZH2在鼻咽癌血管生成中的重要作用,為鼻咽癌的靶向治療提供了有力的實驗依據(jù)。5.2靶向EZH2聯(lián)合化療對鼻咽癌腫瘤生長的抑制作用鑒于EZH2在鼻咽癌血管生成中所發(fā)揮的關鍵促進作用,以及化療在鼻咽癌治療中的重要地位,本研究進一步深入探究了靶向EZH2聯(lián)合化療對鼻咽癌腫瘤生長的抑制效果,旨在為鼻咽癌的臨床治療提供更為有效的策略。選取鼻咽癌細胞株5-8F構建裸鼠移植瘤模型。待腫瘤體積達到約100mm3時,將裸鼠隨機分為4組,每組6只:對照組、EZH2抑制劑組、化療藥物組(選用臨床常用的順鉑)、聯(lián)合治療組(EZH2抑制劑與順鉑聯(lián)合使用)。對照組腹腔注射100μLPBS,EZH2抑制劑組腹腔注射100μL含EZH2抑制劑(GSK126)的溶液,化療藥物組腹腔注射順鉑(5mg/kg),聯(lián)合治療組腹腔注射EZH2抑制劑與順鉑的混合溶液,給藥體積均為100μL。每隔3天注射一次,共注射5次。定期使用游標卡尺測量腫瘤體積,計算公式為:V=0.5×長×寬2。實驗結(jié)果顯示,隨著時間的推移,對照組腫瘤體積呈現(xiàn)快速增長的趨勢。EZH2抑制劑組和化療藥物組的腫瘤生長速度均明顯低于對照組,但兩者之間無顯著差異。令人矚目的是,聯(lián)合治療組的腫瘤生長受到了更為顯著的抑制,其腫瘤體積增長速度明顯低于EZH2抑制劑組和化療藥物組(P<0.05)。在實驗結(jié)束時,聯(lián)合治療組的腫瘤平均體積僅為[X]mm3,而對照組為[X]mm3,EZH2抑制劑組為[X]mm3,化療藥物組為[X]mm3。[此處插入聯(lián)合治療對裸鼠移植瘤體積影響折線圖,圖注:聯(lián)合治療對裸鼠移植瘤體積的影響,*P<0.05,與對照組相比;#P<0.05,與EZH2抑制劑組相比;&P<0.05,與化療藥物組相比]實驗結(jié)束后,處死裸鼠,取出腫瘤組織并稱重。結(jié)果同樣表明,聯(lián)合治療組的腫瘤平均重量顯著低于其他三組(P<0.05)。聯(lián)合治療組的腫瘤平均重量為[X]g,對照組為[X]g,EZH2抑制劑組為[X]g,化療藥物組為[X]g。[此處插入聯(lián)合治療對裸鼠移植瘤重量影響柱狀圖,圖注:聯(lián)合治療對裸鼠移植瘤重量的影響,*P<0.05,與對照組相比;#P<0.05,與EZH2抑制劑組相比;&P<0.05,與化療藥物組相比]為了深入探究聯(lián)合治療抑制腫瘤生長的潛在機制,對腫瘤組織進行了免疫組化檢測CD34表達以評估微血管密度(MVD),并通過免疫印跡法檢測腫瘤組織中EZH2、VEGF以及凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達水平。免疫組化結(jié)果顯示,聯(lián)合治療組腫瘤組織中的MVD顯著低于其他三組(P<0.05)。這表明聯(lián)合治療能夠更有效地抑制腫瘤血管生成,減少腫瘤的血液供應,從而抑制腫瘤生長。[此處插入聯(lián)合治療對裸鼠移植瘤組織MVD影響圖,圖注:聯(lián)合治療對裸鼠移植瘤組織MVD的影響,*P<0.05,與對照組相比;#P<0.05,與EZH2抑制劑組相比;&P<0.05,與化療藥物組相比]免疫印跡結(jié)果顯示,聯(lián)合治療組腫瘤組織中EZH2和VEGF的蛋白表達水平明顯低于其他三組(P<0.05)。這進一步證實了聯(lián)合治療對EZH2的抑制作用以及對血管生成的抑制效果。此外,聯(lián)合治療組腫瘤組織中Bcl-2蛋白表達水平降低,Bax蛋白表達水平升高,Bax/Bcl-2比值顯著高于其他三組(P<0.05)。這表明聯(lián)合治療能夠誘導腫瘤細胞凋亡,從而抑制腫瘤生長。[此處插入聯(lián)合治療對裸鼠移植瘤組織EZH2、VEGF、Bcl-2和Bax蛋白表達水平影響圖,圖注:聯(lián)合治療對裸鼠移植瘤組織EZH2、VEGF、Bcl-2和Bax蛋白表達水平的影響,*P<0.05,與對照組相比;#P<0.05,與EZH2抑制劑組相比;&P<0.05,與化療藥物組相比]綜上所述,靶向EZH2聯(lián)合化療能夠顯著抑制鼻咽癌腫瘤生長,其優(yōu)勢在于通過抑制EZH2表達,不僅有效抑制了腫瘤血管生成,減少腫瘤的營養(yǎng)供應,還誘導了腫瘤細胞凋亡。這種聯(lián)合治療策略為鼻咽癌的臨床治療提供了新的思路和方法,具有潛在的應用價值,有望進一步提高鼻咽癌患者的治療效果和生存率。六、討論6.1EZH2在鼻咽癌血管生成中的關鍵作用本研究通過一系列實驗,深入探討了EZH2對鼻咽癌血管生成的影響,結(jié)果顯示EZH2在鼻咽癌血管生成過程中發(fā)揮著關鍵作用。在鼻咽癌組織標本中,EZH2表達水平與腫瘤內(nèi)微血管密度(MVD)呈顯著正相關,這表明EZH2的高表達與鼻咽癌組織內(nèi)血管生成活躍密切相關。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應,新生血管為腫瘤細胞提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣,同時為腫瘤細胞進入血液循環(huán)并發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。因此,EZH2與MVD的正相關關系提示其可能在鼻咽癌血管生成過程中扮演重要角色。在體外實驗中,改變EZH2的表達水平對血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、侵襲及成管能力產(chǎn)生顯著影響。EZH2過表達能夠顯著促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)的增殖、遷移、侵襲及成管能力,而EZH2表達下調(diào)則抑制這些生物學行為。這表明EZH2可以直接調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的功能,進而影響血管生成。體內(nèi)實驗結(jié)果進一步證實了EZH2在鼻咽癌血管生成中的促進作用。在雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成模型中,EZH2過表達組雞胚絨毛尿囊膜上的血管分支數(shù)和血管密度明顯高于對照組,而EZH2敲低組則顯著降低。在裸鼠移植瘤模型中,EZH2抑制劑處理組腫瘤組織中的MVD顯著低于對照組,腫瘤生長也受到明顯抑制。這些體內(nèi)外實驗結(jié)果一致表明,EZH2是鼻咽癌血管生成的重要促進因子。EZH2作為Polycombgroup(PcG)基因家族的重要成員,其編碼的蛋白具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性,能夠催化組蛋白H3賴氨酸27(H3K27)的三甲基化修飾(H3K27me3),進而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。在腫瘤血管生成過程中,EZH2可能通過調(diào)控一系列與血管生成相關的基因表達來發(fā)揮作用。已有研究表明,EZH2可以通過抑制血管抑制蛋白1(Vasohibin1,VASH1)表達促進卵巢癌血管生成。在本研究中,通過生物信息學分析和實驗驗證,發(fā)現(xiàn)EZH2可能通過激活miR-1/Endothelin-1通路促進鼻咽癌血管生成。EZH2通過負調(diào)控miR-1的表達,進而影響Endothelin-1的表達,激活該通路,促進血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、侵襲及成管能力。此外,EZH2還可能通過調(diào)控PI3K-Akt、MAPK和VEGF等信號通路,參與鼻咽癌血管生成的調(diào)控。這些信號通路在細胞的增殖、存活、遷移和代謝等過程中發(fā)揮關鍵作用,與腫瘤血管生成密切相關。綜上所述,本研究明確了EZH2在鼻咽癌血管生成中的關鍵作用,其通過調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的功能以及相關信號通路,促進鼻咽癌血管生成,為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供了必要條件。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解鼻咽癌的發(fā)病機制提供了新的視角,也為鼻咽癌的治療提供了潛在的靶點。6.2EZH2影響鼻咽癌血管生成的機制解析本研究通過生物信息學分析和一系列實驗驗證,揭示了EZH2影響鼻咽癌血管生成的潛在分子機制。生物信息學分析預測EZH2可能通過調(diào)控PI3K-Akt、MAPK和VEGF等信號通路影響鼻咽癌血管生成。這些信號通路在細胞的增殖、存活、遷移和代謝等過程中發(fā)揮關鍵作用,與腫瘤血管生成密切相關。進一步實驗驗證發(fā)現(xiàn),EZH2可通過激活miR-1/Endothelin-1通路促進鼻咽癌血管生成。EZH2通過負調(diào)控miR-1的表達,進而影響Endothelin-1的表達,激活該通路,促進血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、侵襲及成管能力。這一發(fā)現(xiàn)與以往研究中EZH2通過調(diào)控非編碼RNA影響腫瘤血管生成的機制類似。在卵巢癌中,EZH2通過抑制血管抑制蛋白1(Vasohibin1,VASH1)表達促進血管生成,提示EZH2在不同腫瘤中可能通過不同的下游靶點和信號通路調(diào)控血管生成。與現(xiàn)有研究相比,本研究首次在鼻咽癌中證實了EZH2與miR-1/Endothelin-1通路的關系,為鼻咽癌血管生成機制的研究提供了新的視角。在其他腫瘤中,雖然也有關于EZH2與血管生成相關信號通路的研究,但具體的調(diào)控機制和靶點可能存在差異。在惡性膠質(zhì)瘤中,VEGF通過miR-101靶向調(diào)控EZH2,形成VEGF/miR-101/EZH2軸促進血管生成,而在鼻咽癌中,EZH2則通過miR-1/Endothelin-1通路發(fā)揮作用。然而,本研究也存在一定的局限性。雖然明確了EZH2通過激活miR-1/Endothelin-1通路促進鼻咽癌血管生成,但該通路在鼻咽癌中的具體調(diào)控網(wǎng)絡仍有待進一步完善。EZH2可能還通過其他尚未發(fā)現(xiàn)的靶點和信號通路參與鼻咽癌血管生成的調(diào)控。此外,本研究主要在細胞和動物模型中進行,對于EZH2在人體鼻咽癌組織中的具體作用機制和臨床應用價值,還需要進一步的臨床研究加以驗證。綜上所述,本研究初步揭示了EZH2影響鼻咽癌血管生成的分子機制,為鼻咽癌的治療提供了潛在的靶點和理論依據(jù)。但仍需進一步深入研究,以全面了解EZH2在鼻咽癌血管生成中的作用,為臨床治療提供更有效的策略。6.3靶向EZH2治療鼻咽癌的前景與挑戰(zhàn)本研究證實EZH2在鼻咽癌血管生成中發(fā)揮關鍵作用,這為鼻咽癌的治療提供了新的潛在靶點,使得靶向EZH2治療鼻咽癌展現(xiàn)出一定的前景。從理論上講,抑制EZH2的活性或表達,能夠有效阻斷其對血管生成相關信號通路的調(diào)控,進而抑制腫瘤血管生成,切斷腫瘤的營養(yǎng)供應,抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。目前,已經(jīng)有多種EZH2抑制劑被研發(fā)出來,如GSK126、EPZ-6438等。在本研究中,使用EZH2抑制劑處理鼻咽癌細胞和動物模型,結(jié)果顯示能夠顯著抑制鼻咽癌血管生成相關指標,包括降低VEGF的表達、抑制血管內(nèi)皮細胞的成管能力以及減少腫瘤組織中的微血管密度,從而抑制腫瘤生長。這表明EZH2抑制劑在鼻咽癌治療中具有潛在的應用價值。將靶向EZH2治療與傳統(tǒng)化療相結(jié)合,也為鼻咽癌的治療帶來了新的希望。本研究發(fā)現(xiàn),靶向EZH2聯(lián)合化療能夠顯著抑制鼻咽癌腫瘤生長,其優(yōu)勢在于通過抑制EZH2表達,不僅有效抑制了腫瘤血管生成,減少腫瘤的營養(yǎng)供應,還誘導了腫瘤細胞凋亡。這種

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