綠色熒光蛋白(GFP)技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)研究中應(yīng)用

第1頁熒光現(xiàn)象在許多海洋無脊椎動物中普遍存在著。許多刺胞亞門動物和幾乎全部櫛水母類動物在受到刺激時都能夠發(fā)出熒光：刺胞亞門動物多發(fā)射綠色熒光，而櫛水母類發(fā)射藍(lán)色熒光。綠色螢光蛋白(greenfluorescentprotein)，簡稱GFP，它發(fā)覺和應(yīng)用被稱為細(xì)胞生物學(xué)上一次革命。這種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)很特殊，在受到藍(lán)光或紫外線刺激時能夠發(fā)射綠色熒光，并不需要任何協(xié)同因子、底物，適適用作普遍匯報標(biāo)識，尤其適合于活體細(xì)胞或組織。因?yàn)镚FP穩(wěn)定、靈敏度高、無生物毒性、熒光反應(yīng)不需要任何外源反應(yīng)底物及表示無物種或細(xì)胞組織專一性,檢測簡單，結(jié)果真實(shí)可靠，是一個獨(dú)特匯報蛋白(Reporterprotein)?？蓮V泛用于基因表示與調(diào)控、蛋白質(zhì)定位、轉(zhuǎn)移及相互作用、信號傳遞、轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)化,以及細(xì)胞分離與純化等研究領(lǐng)域。第2頁圖1綠色熒光蛋白第3頁1962年Shimomura和Johnson等人[1]首先從一個水母類動物AequoreaVictoria中分離純化出了GFP,1992年P(guān)rasher[2]等克隆了GFP基因cDNA并分析了GFP一級結(jié)構(gòu),1994年M.Chalfie[3]等最早用重組野生GFP型基因做匯報基因,成功地在原核和真核生物中得到表示。90年代后,人們對GFP性質(zhì)和應(yīng)用進(jìn)行了不停深入研究,相關(guān)GFP及其利用研究進(jìn)展較快，現(xiàn)在它已經(jīng)發(fā)展成了當(dāng)代生物學(xué)研究一個準(zhǔn)確工具。當(dāng)前在細(xì)胞生物學(xué)、植物學(xué)、動物學(xué)、微生物學(xué)等學(xué)科研究中都有著相當(dāng)廣泛應(yīng)用。伴隨人們對GFP發(fā)光機(jī)制研究深入,經(jīng)過對其發(fā)光團(tuán)區(qū)域和其它區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)誘變,已經(jīng)得到了許多GFP突變型,有發(fā)藍(lán)光或黃光而不是綠光[4]；有發(fā)出熒光比野生型強(qiáng)很多,激發(fā)后很輕易用肉眼觀察到；有則是溫度突變型,其表示不受溫度限制[5]；有突變體則能夠特異地在一些物種中高效表示。這些突變體極大地拓寬了GFP應(yīng)用范圍,使GFP在細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用顯示出更為遼闊和誘人前景。第4頁一、GFP結(jié)構(gòu)

圖2綠色熒光蛋白結(jié)構(gòu)第5頁GFP編碼238個氨基酸多肽單體，只有完整GFP分子才會產(chǎn)生生物熒光，被切斷GFP(即使是C、N末端少數(shù)幾個氨基酸)亦能造成GFP失去發(fā)光能力[6]。與熒光產(chǎn)生直接相關(guān)是GFP分子中一小段被稱為熒光生色團(tuán)(Chromophore)部位[7]。在GFP初級氨基酸序列上，第65～67個氨基酸(Ser-Tyr-Gty)形成環(huán)狀三肽，以共價形式與GFP蛋白肽鍵骨架相連。生色團(tuán)形成不受種屬限制，其經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)廣泛存在成份作用或經(jīng)過自催化作用都能產(chǎn)生。熒光生色團(tuán)非常穩(wěn)定,不易變性,用酸、堿處理或者加入鹽酸胍都不會使它失去熒光。不過當(dāng)pH值恢復(fù)到中性或者移去變性物時，它熒光又會恢復(fù)到變性前水平。GFP生色團(tuán)之間是經(jīng)過共價鍵結(jié)合。生色團(tuán)形成機(jī)理當(dāng)前尚不清楚，但在有分子氧存在條件下，酪氨酸氧化成脫氫酪氨酸，并環(huán)化形成六肽，這可能是形成色基必定過程。[8]第6頁二、GFP應(yīng)用特點(diǎn)1易于檢測GFP熒光反應(yīng)不需外加任何反應(yīng)底物，酶或其它共反應(yīng)因子,也就不存在這些物質(zhì)可能難于進(jìn)入細(xì)胞問題，只需紫外光或藍(lán)光激發(fā),即可發(fā)出綠色熒光，GFP發(fā)射熒光用肉眼或熒光顯微鏡就能夠檢測到。靈敏度高,對于單細(xì)胞水平表示也可識別,同時還可利用其進(jìn)行定量檢測。因?yàn)镚FP對活細(xì)胞基本無毒害,所以無須特殊處理就能夠很方便地進(jìn)行活體觀察。而且，含有不一樣光譜特征GFP突變體取得,使在同一細(xì)胞中同時分析兩種不一樣蛋白或開啟子成為可能,能夠用于發(fā)育細(xì)胞學(xué)、藥品篩選、分析診療等研究。這就使GFP有可能成為一個快速、簡便、經(jīng)濟(jì)標(biāo)識蛋白，GFP基因作為報道基因可能有廣泛用途。第7頁2熒光穩(wěn)定GFP無光漂白現(xiàn)象，在很大pH范圍內(nèi)(pH7～12)都能夠正常發(fā)出熒光，受溫度影響也很小，只有在超出65℃時才會變性，熒光消失。熒光顯微鏡強(qiáng)光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比熒光素(fluorescein)強(qiáng)[9]。尤其在450～490nm藍(lán)光波長下更穩(wěn)定,但在340～390nm或395～440nm范圍內(nèi)，仍會發(fā)生光漂白現(xiàn)象。對于長時間光照，GFP也有很好耐受性，依據(jù)Sheen等研究，GFP在受體內(nèi)表示時能夠連續(xù)得到不低于10分鐘熒光。第8頁3廣譜性首先表現(xiàn)在它表示幾乎不受種屬范圍限制，在微生物、植物、動物中都取得了成功表示；其次就是沒有細(xì)胞種類和位置限制，在各個部位都能夠表示，發(fā)出熒光。第9頁4易于載體構(gòu)建因?yàn)镚FP較小，只含有238個氨基酸，編碼GFP基因序列也較短，約2.6kb，所以它能夠很方便地同其它序列一起構(gòu)建各種質(zhì)粒，而不至于使質(zhì)粒過大影響轉(zhuǎn)化頻率。盡管野生型GFP在一些植物和動物中表示很弱，但可經(jīng)過更換GFP生色團(tuán)氨基酸、改變堿基組分、除去內(nèi)含子、更換強(qiáng)開啟子等方法加強(qiáng)表示。Connack等篩選出了三種含Ser65突變突變體，在大腸桿菌中表示時，熒光強(qiáng)度比野生型高約100倍。第10頁5無毒害Chalfie等研究表明：GFP對生活細(xì)胞基本無毒害，Sheen等(1995)研究深入表明：在玉米中，即便GFP在細(xì)胞中表示量很高時，對細(xì)胞也不會產(chǎn)生顯著毒害。不過至今我們還不太了解它對植物再生能力影響。第11頁三、GFP在細(xì)胞生物學(xué)研究中應(yīng)用1對細(xì)胞生理過程監(jiān)控在過去幾年中，經(jīng)過隨機(jī)和人工誘變得到了許多不一樣顏色GFP突變體。經(jīng)過基因操作，許多蛋白都成功與GFP進(jìn)行了融合，經(jīng)過這些融合蛋白就能夠?qū)?yīng)蛋白表示和轉(zhuǎn)運(yùn)及生理反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)控。當(dāng)前GFP融合蛋白對細(xì)胞內(nèi)快速生理反應(yīng)匯報大約有三種方式：轉(zhuǎn)移和定位、GFP光譜生化修飾、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。Shen[10]等在培養(yǎng)神經(jīng)元中發(fā)覺，細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬間改變就會引發(fā)GFP標(biāo)識鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)可逆地易位到突觸后膜densities上。Shi[11]等用GFP標(biāo)識來監(jiān)控α-氨基羥甲基惡唑丙酸(AMPA)受體，發(fā)覺它會從細(xì)胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)移到樹突棘表面，依據(jù)突觸中AMPA受體含量能夠解釋突觸緘默、活化原因和機(jī)制。Siegel[12〕等將野生型GFP插人ShakeK十通道特殊部位，形成一個異源嵌合體，這個嵌合體發(fā)出熒光將會伴隨細(xì)胞去極化作用而遲緩降低。相反，Yanagawa[13]等將β-內(nèi)酰胺酶插人GFP得到了一個融合體，當(dāng)此融合體與β-內(nèi)酰胺酶抑制肽(BLIP)結(jié)合時,它熒光發(fā)射量會大大增加。第12頁2細(xì)胞篩選基于GFP能夠吸收、發(fā)射光，而且熒光穩(wěn)定以及檢測方法快速、方便特征，GFP在細(xì)胞篩選上應(yīng)用廣泛。譬如應(yīng)用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀來篩選蛋白產(chǎn)量增強(qiáng)細(xì)胞。Yuk等[14]使用GFP作為標(biāo)識能快速篩選出在生長抑制環(huán)境下，仍能保持重組蛋白大量表示CHO細(xì)胞。另外，研究發(fā)覺經(jīng)過GFP熒光降低，能夠測量出鼠和人細(xì)胞凋亡[15]。利用GFP融合蛋白作為細(xì)胞表面活體熒光標(biāo)識，經(jīng)過篩選已經(jīng)取得GFP表示E.coli、人體腎細(xì)胞和猿猴COS-1細(xì)胞等特殊類型。SheenJ等在GFP轉(zhuǎn)染玉米原生質(zhì)體中出現(xiàn)兩類細(xì)胞叢，第一類與對攝影同，展現(xiàn)紅色熒光，約占細(xì)胞總數(shù)66.3%；第二類細(xì)胞叢展現(xiàn)綠色熒光，熒光強(qiáng)度是對照74倍[16]。所以，用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或熒光活化細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(FACS)很輕易將兩類細(xì)胞分離開來。第13頁3細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)分子定位對于許多蛋白質(zhì)來說，易位是它們激活機(jī)制中一部分。以前多是用細(xì)胞分級分離和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)進(jìn)行研究，而現(xiàn)在利用GFP融合蛋白顯像技術(shù)無疑是一個簡便而可靠檢測方法，我們不但能夠更加快地而且能夠更全方面地對蛋白質(zhì)移動進(jìn)行研究。近幾年,在GFP技術(shù)進(jìn)步中最主要就是對幾個GFP突變體判定。經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡，依據(jù)它們所發(fā)出不一樣顏色熒光，就能夠在活細(xì)胞中同時而準(zhǔn)確區(qū)分各種不一樣熒光融合蛋白以及了解它們分布情況[17]。在實(shí)際中，慣用藍(lán)綠色熒光蛋白(CFP)和黃色熒光蛋白(YFP)兩種突變體組合來在活細(xì)胞中進(jìn)行雙色顯示。而其它突變體如藍(lán)色熒光蛋白(BFP)和紅色熒光蛋白(RFP)使用還受到許多限制，因?yàn)樗鼈冇泻芸旃馄鬃饔没蛘呤前l(fā)射熒光強(qiáng)度太低。最近又發(fā)覺GFP是一個良好細(xì)胞間信號傳遞動態(tài)標(biāo)識分子,能夠跟蹤觀察第二信使,如Ca2+和cAMP水平起伏改變,細(xì)胞間隙pH值改變等[18]。第14頁4用于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)動力學(xué)研究研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)主要有兩種：光漂白熒光恢復(fù)法(FRAP)、光漂白熒光損失法(FLIP)。FRAP主要是經(jīng)過對細(xì)胞內(nèi)特定點(diǎn)或區(qū)域進(jìn)行強(qiáng)烈光照，使熒光發(fā)生光漂白作用，再經(jīng)過相同時間間隔光影像采樣統(tǒng)計(jì)下熒光恢復(fù)動力學(xué)過程。FRAP不但能夠確定細(xì)胞器上蛋白，還能夠確定流動蛋白滯留時間。轉(zhuǎn)錄、m-RNA前體剪切、DNA修復(fù)中蛋白質(zhì)復(fù)合體操作機(jī)制都能夠用這種方法來研究。FLIP是對細(xì)胞一個區(qū)域進(jìn)行連續(xù)性光漂白，再對光漂白區(qū)外熒光損失進(jìn)行監(jiān)控就能夠取得一些標(biāo)識蛋白之間相關(guān)性信息。當(dāng)前正在體外經(jīng)過改變光照點(diǎn)大小和固定細(xì)胞來研究光漂白作用可逆性，不過還是與活細(xì)胞環(huán)境有一定差距。另外一個能夠用來研究細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)動力學(xué)方法就是熒光相關(guān)性分光光鏡檢驗(yàn)(FCS)。這種方法是首先經(jīng)過聚焦照射在細(xì)胞內(nèi)形成一個一定大小光洞，光洞中熒光探針移動會引發(fā)熒光波動，經(jīng)過校正計(jì)算出熒光顆粒平均滯留時間和平均數(shù)量，再依據(jù)已知光洞大小和平均光滯留時間就能夠計(jì)算出擴(kuò)散蛋白動力學(xué)參數(shù)[19]。第15頁5計(jì)算細(xì)胞生長速度在高水平組合型表示GFP細(xì)胞品系中,在細(xì)胞生長對數(shù)期,綠色熒光蛋白所發(fā)出熒光信號與細(xì)胞數(shù)量親密相關(guān)。測量到任何熒光強(qiáng)度都能夠?qū)?yīng)地轉(zhuǎn)變成細(xì)胞濃度。盡管在細(xì)胞生長后期,用熒光信號計(jì)算得到細(xì)胞數(shù)目略低于培養(yǎng)物中實(shí)際數(shù)目。但在慣用臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)方法中,這個誤差是允許。利用這一技術(shù),能夠測定一些細(xì)胞分布和生長情況,尤其是一些透明動物和植物組織內(nèi)特定細(xì)胞、化合物生長、分布情況。也有些人用此項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行病毒在植物體內(nèi)生長、擴(kuò)散情況研究,取得了不錯效果。第16頁6.觀察細(xì)胞內(nèi)酶活動

GFP突變子不但僅能夠用來探測融合蛋白空間定位，而且能夠?qū)罴?xì)胞酶活動，如：磷酸化作用、蛋白水解作用等進(jìn)行匯報，還能夠測量與酶活動相關(guān)細(xì)胞內(nèi)pH、cAMP、Ca2+濃度。經(jīng)過將外源序列插人GFP基因中，能夠?qū)?xì)胞內(nèi)酶活動進(jìn)行觀察以及了解這些酶生理學(xué)參數(shù)。插入外源基因后所表示融合蛋白中GFP蛋白發(fā)色基團(tuán)會發(fā)生構(gòu)像改變，其發(fā)射熒光強(qiáng)度也會發(fā)生很大改變。這些指示劑能夠用來檢測細(xì)胞內(nèi)許多酶作用，比如：蛋白水解酶、激酶、氧化還原酶以及一些小配基濃度[20]。第17頁7用于細(xì)胞示蹤試驗(yàn)研究利用GFP熒光能夠清楚地對腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移進(jìn)行追蹤。體內(nèi)腫瘤侵襲研究要求在周圍正常細(xì)胞背景下，能識別少許甚至是單個瘤細(xì)胞。以往用抗腫瘤細(xì)胞特異性抗原、抗體進(jìn)行免疫組化分析，操作較為復(fù)雜,且反抗原性有較高要求。利用β半乳糖昔酶(LacZ)作為標(biāo)識基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，操作較為復(fù)雜，且需底物分子。而用GFP就能夠準(zhǔn)確而簡便地對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行示蹤。李俠【21】等將攜有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因pEGFP-N3質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，篩選穩(wěn)定表示綠色熒光蛋白細(xì)胞克隆，以立體定向法植入SD大鼠腦實(shí)質(zhì)內(nèi)建立大鼠移植瘤模型。4周后處死大鼠并作鼠腦連續(xù)石蠟切片,相鄰切片分別做蘇木素-伊紅(HE)或免疫組化染色后熒光顯微鏡下檢測。在熒光顯微鏡很輕易區(qū)分腫瘤區(qū)和非腫瘤區(qū)，并能發(fā)覺侵襲至遠(yuǎn)處單個腫瘤細(xì)胞，其敏感性和特異性顯著優(yōu)于HE染色和免疫組化方法。朱君明[22]等將GFP和HTH1雙基因多基因表示載體GC-GFP-P-HTH1-SN轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞，且移植人Parkinon病模型大鼠紋狀體內(nèi)后，也清楚地觀察到了NIH-3T3細(xì)胞在腦內(nèi)生長情況。Xin[23]等將EGFP轉(zhuǎn)人EG4細(xì)胞(一個原胚細(xì)胞)中，建立了幾株既能夠表示綠色熒光蛋白又依然保持了多能干細(xì)胞特征EG4-GFP細(xì)胞系，經(jīng)過對聚集EG4-GFP細(xì)胞到8細(xì)胞胚胎研究,能夠追蹤到EG4-GFP細(xì)胞在體外分化情況以及在胚胎發(fā)育中命運(yùn)。第18頁8.基因表示調(diào)控Clontech企業(yè)構(gòu)建了一個叫開啟子匯報載體(Promoterreportervector)即是一個沒有開啟子GFP質(zhì)粒，專門用來測試各種開啟子對GFP表示效率，以及一些增強(qiáng)子對GFP表示調(diào)控效果。發(fā)覺用玉米C4PPDK基因5'端非翻譯片段(5'VTR)與花椰菜花葉病毒35S開啟子連接，GFP在玉米原生質(zhì)體中表示效率比對照質(zhì)粒(只有35S開啟子)提升近15倍，因?yàn)?'VTR片段中含轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。用擬南芥菜熱休克(Heat-shock)基因開啟子構(gòu)建GFP表示載體，用以轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體。發(fā)覺42℃熱激處理中50%原生質(zhì)體表示GFP熒光，37℃處理熒光較弱，而常溫下培養(yǎng),則完全觀察不到原生質(zhì)體中GFP熒光[24]。在高等植物遺傳轉(zhuǎn)化基因表示調(diào)控研究中，已經(jīng)有很多匯報蛋白被應(yīng)用，包含LacZ(β半乳糖苷酶)，CAT〔Chloramphenicolacethytransferase〕,Luc(熒光蟲Luciferase)和GUS(β-glucuronidase)等。但這些匯報蛋白都是酶，其表示產(chǎn)物檢測都需要進(jìn)行細(xì)胞固定、組織切片或蛋白提取等破壞性處理，極難用于活體觀察和檢測。GFP作為一個活體匯報蛋白，用于研究基因表示調(diào)控，顯著含有其它匯報蛋白不可替換優(yōu)點(diǎn)。第19頁9.定量分析GFP熒光強(qiáng)度很高，很輕易用儀器定量檢測，而且研究表明GFP熒光強(qiáng)度和與其相連細(xì)胞或蛋白有一定相關(guān)性，只需要做出一條相關(guān)性曲線，就能夠?qū)ρ芯繉ο筮M(jìn)行定量分析。Hack[19]等將用GFP標(biāo)識神經(jīng)元特異性鈣調(diào)蛋白calretinin(CR)基因轉(zhuǎn)人畸胎癌細(xì)胞中，經(jīng)過對微血管中GFP熒光測量，再做出GFP和CR含量標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算出CR表示量。Mcore[25]等將GFP在體外轉(zhuǎn)染9L膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞后接種于Fisher大鼠腦內(nèi)，2周后處死大鼠，進(jìn)行鼠腦標(biāo)本切片和熒光顯微鏡觀察，無熒光標(biāo)識暗區(qū)(blackspots)為腫瘤血管區(qū)，由此可計(jì)數(shù)新生血管數(shù)量。第20頁10GFP匯報蛋白用于細(xì)胞活體分離與純化利用細(xì)胞表面標(biāo)識，經(jīng)過流體細(xì)胞分光光度計(jì)或熒光活化細(xì)胞篩選儀(FACS)，能夠分離與純化特殊類型細(xì)胞，對分析cDNA文庫、研究基因細(xì)胞發(fā)育或組織專一性表示十分主要[26,27]。利用GFP融合蛋白為細(xì)胞表面活體熒光標(biāo)識，經(jīng)過篩選已經(jīng)取得GFP表示大腸桿菌、人體腎細(xì)胞和猿猴COS-1細(xì)胞特殊類型。SheenJ等在GFP轉(zhuǎn)染玉米原生質(zhì)體流體參數(shù)分析中發(fā)覺，轉(zhuǎn)染15～18小時后，對照中只有一類細(xì)胞叢，表現(xiàn)較強(qiáng)紅色熒光和微弱綠色熒光，而且細(xì)胞間熒光強(qiáng)度相當(dāng)一致，沒有顯著差異。而GFP轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體中出現(xiàn)兩類細(xì)胞叢，第一類與對攝影同，展現(xiàn)紅色熒光，約占細(xì)胞總數(shù)66.3%；第二類細(xì)胞叢展現(xiàn)綠色熒光，熒光強(qiáng)度是對照74倍。所以，用流式細(xì)胞分光光度計(jì)或熒光活化細(xì)胞篩選儀(EpicsElite,ConlterElectronics,MiamiFL,USA)很輕易將兩類細(xì)胞分離開來。原生質(zhì)體能夠起源于不一樣類型組織細(xì)胞原生質(zhì)體表示GFP信息，即可代表某種組織信息。采取發(fā)育專一性開啟子構(gòu)建GFP表示載體，能夠?qū)⑦@些含有基因表示特異性細(xì)胞類型分離出來。利用不一樣表示文庫轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體，經(jīng)過流體參數(shù)分析和細(xì)胞分類，能夠揭示在信號傳導(dǎo)路徑中所包含許多反方活化因子(trans-activatingfectors)。GFP在生物學(xué)和分子生物學(xué)研究中利用還不但僅局限于上述幾個方面。伴隨研究深入開展，其廣泛利用潛力將不停表現(xiàn)出來。第21頁四、存在問題及展望GFP標(biāo)識蛋白有很顯著優(yōu)點(diǎn)，但這項(xiàng)技術(shù)還是有很多不足。第一，這種方法需要很高空間分辨力，培養(yǎng)細(xì)胞要稀疏而且很薄；第二，定量范圍會受到融合蛋白表示水平和顯像分辨力干擾；第三，因?yàn)槿诤系鞍讛U(kuò)散到膜表面需要一定時間，所以動力學(xué)響應(yīng)在一些情況下可能會受到時間上限制；第四，由GFP標(biāo)識物本身引發(fā)電勢干擾是極難預(yù)計(jì)，因?yàn)閹缀鯖]有其它方法能夠用來做比較；第五，幾乎在全部情況下,細(xì)胞內(nèi)GFP標(biāo)識分子表示都伴伴隨一些未標(biāo)識蛋白表示。比如,組成高爾基反面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)膜蛋白TGN38，它正確功效定位和動力學(xué)過程需要在同源系統(tǒng)中低水平表示，而在非同源系統(tǒng)中表示或在同源系統(tǒng)中高水平表示，則會造成其斷裂或被錯誤地定位[28]。第六，GFP分子量即使不大(27kDa)，但對蛋白功效影響比一些短(大約10個氨基酸)熒光標(biāo)識蛋白要大。最終，即使有報道指出，熒光只能在表示GFP細(xì)胞中檢測到，不過也有不少人擔(dān)心GFP基因可能還不能完全準(zhǔn)確地反應(yīng)轉(zhuǎn)化情況，GFP基因表示可能有假象存在：首先，細(xì)胞本身存在一些能夠受光激發(fā)物質(zhì)，能產(chǎn)生一定量熒光；另首先，GFP基固在受體內(nèi)表示頻率并不高。Sheen等(1995)在一些被CABGFP基因轉(zhuǎn)化植株中檢測不到清楚熒光信號。Hu、Sheen、Haselof等l995年在發(fā)表文章中也分別提到了這一現(xiàn)象，看來GFP應(yīng)用條件還需進(jìn)行深入探索。GFP成像技術(shù)是生化和分子細(xì)胞生物學(xué)中飛速發(fā)展一個工具,它已經(jīng)滲透到了分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、動物學(xué)、植物學(xué)、生理學(xué)等其它許多生命科學(xué)領(lǐng)域。有了GFP，培育出奇特?zé)晒鈩游锖蜔晒庵参镆巡辉偈菈粝?。相信伴隨基因工程技術(shù)和細(xì)胞工程技術(shù)日益成熟，GFP一定能夠?yàn)槲覀兘议_細(xì)胞中許多迄今為止還不為人所知秘密,掀起一場生物學(xué)上綠色革命。第22頁參考文件[1]ShimomuraO,JhsonFH,SaigaY,etal.,1962,J.Cell.Comp.Physiol,59:223.[2]PrasherD,EckenrodeV,WardW,etal.,1992,Gene,111:229-233.[3]ChalfieeM,TuY,EuskirchenG,etal.,1994,Science,263:802-805.[4]WachterRMandRemingtonSJ.,1999,Curr,Biol,9:R628-R629.[5]SiemeringKR,GolbikR,SverR,HaseloffJ.,1996,CurrBiol,6:1653-1663.[6]LiX,ZhangG,NgoN,etal.DeletionsoftheAequoreavictoriagreenfluorescentproteindefinetheminimaldomainrequiredforfluorescence[J].JBiolChem,1997,272(45):28545-28549.[7]MoriseH,ShimomuraO,JohnsonFH,etal.IntermolecularenergytransferinthebioluminescentsystemofAequorea[J].Biochemistry,1974,13(12):2656-2662.[8]DelagraveS,YouvanDC.Searchingsequencespacetoengineerproteins:Ex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