檢查保護(hù)您現(xiàn)在不能檢查保護(hù)文檔或打印文檔，請根據(jù)以下三個步驟操作：1)如果您是Word2000或以上版本用戶，請把Word宏的安全性設(shè)為:"中"方法:Word菜單->工具->宏->安全性->安全級,設(shè)置為"中"(如果您是Word97用戶，繼續(xù)執(zhí)行以下步驟)2)關(guān)閉本文檔，重新打開本文檔3)點擊"啟用宏"按鈕，即可開始填寫本文檔或打印了申報日期：2004年3月16日徐長慶性別男主要研究領(lǐng)域在研項目批準(zhǔn)號哈爾濱醫(yī)科大學(xué)[在此錄入修改][在此錄入修改][在此錄入修改]大鼠心肌多胺代謝規(guī)律和"雙刃劍"作用機(jī)制的研究胞發(fā)生鈣爆炸和大鼠心肌缺血/再灌注時心肌總多胺池(尤其精胺)含量降低,適當(dāng)補(bǔ)充外源外源性精胺對心肌機(jī)能，代謝和形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響及劑量依賴關(guān)系，探討精胺引起心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣增加的機(jī)制和信號傳導(dǎo)途徑，揭示心肌缺血/再灌注損傷與多胺代謝紊亂的內(nèi)在關(guān)系，多角度證實我們首先提出的“多胺是把雙刃劍”和心肌損傷的“鈣爆炸”假說，為項目組主要成員(杰出青年科學(xué)基金不填此欄)1趙雅君趙雅君女m2孫軼華孫軼華女分子生物學(xué)3王麗娜王麗娜女wangln6@細(xì)胞培養(yǎng)和4韓麗萍韓麗萍女85張紅雨張紅雨男激光共聚焦6婁延平婁延平男高級實驗師67李鴻珠李鴻珠女分子生物學(xué)8王莞王莞女0451-39WangWangRui男Universitywangrui@duke.usask.ca1411022激光共聚焦,膜片鉗,高效液譜儀,分子生物學(xué)等檢報告正文報告正文1.項目的立項依據(jù)（研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及分析，附主要參考文獻(xiàn)目錄?；A(chǔ)研究需結(jié)合科學(xué)研究發(fā)展趨勢來論述科學(xué)意義；應(yīng)用研究需結(jié)合國民經(jīng)濟(jì)和社會發(fā)展中迫切需要解決的關(guān)鍵科技問題來論述其多價陽離子的多胺(polyamine)，包括4價的精胺(spermine)和3價的精咪1．全文檢索Polyamine）61410篇Polyamine＋Heart）2791篇Polyamine+myocyte）237篇。+Heart＋reperfusion）4篇Polyamine＋myocyte）2篇。文獻(xiàn)報道，多胺可穩(wěn)定染色質(zhì)、核酶、核酸和/或細(xì)胞膜，為細(xì)胞增殖和分化所必致癌基因所激活，如刺激心肌肥大的甲狀腺素、β和α1腎上腺素激鹽受體某些亞型的內(nèi)向整流特性，影響神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的興奮性和Ca2+的流入【8】。精胺可調(diào)節(jié)線粒體的鈣緩沖能力和天冬氨酸鹽受體的活性。腦缺血和再灌注引起細(xì)胞壞死時，多胺可由細(xì)胞釋放【9】。精咪/精胺乙?；D(zhuǎn)移酶活性增加，促成大道，多胺耗竭可誘導(dǎo)Akt（一種絲氨酸-蘇氨酸激酶）激活，進(jìn)而抑制正常腸道上皮細(xì)胞一部分涉及腸，肝，腎等器官，有關(guān)心臟的較少，涉及心肌缺血/再灌注更是屈指可生，慶大霉素和精胺(5mM)有效抑制之【16】；VenturaC等觀察到，精胺可誘導(dǎo)電刺激但許多文獻(xiàn)報道，精胺可成為多種細(xì)胞鈣敏感受體(CalciumSensing-Receptor,CaSR)以，多胺在心血管系統(tǒng)中生理作用和病理意義，尤其與心肌缺血/再灌注損傷的關(guān)系，索國內(nèi)著名檢索系統(tǒng)---萬方數(shù)據(jù)資源系統(tǒng)(中國數(shù)體，除調(diào)節(jié)細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)外，尚具有許多重要生理功能，已成為國際上的研究熱點。項生物學(xué)和激光共聚焦技術(shù)（Fura-2作為鈣離子熒光探針）等手段，首次證明大鼠心肌細(xì)胞膜存在著鈣敏感受體(圖2)。我們的論文“Calciumandpolyamineregulated象。在顯視屏上出現(xiàn)如同“原子彈爆炸”一樣的景象：蘑菇云驟然升起，爆炸后留下人們用激光共聚焦和熒光成像技術(shù)觀察到有關(guān)細(xì)胞內(nèi)鈣增加的現(xiàn)象有鈣振蕩(calciumoscillation)，鈣火花(calciumsparks)和鈣波(calciumwave)等。我們在和平滑肌(1995)得到闡述。自發(fā)性鈣火花是細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的基本單位，成為鈣波引發(fā)和傳播的位點,構(gòu)成心肌細(xì)胞興奮-收縮偶聯(lián)的基礎(chǔ)。心肌細(xì)胞橫小管結(jié)構(gòu)和肌漿網(wǎng)的ryanodine受體鈣通道同時開放,產(chǎn)生血/再灌注時多胺代謝池的變化以及外源性精胺對培養(yǎng)乳鼠的超微結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了初步研為驗證高濃度精胺確可誘發(fā)心肌細(xì)胞發(fā)生“鈣爆炸”的假本課題在原有研究的基礎(chǔ)上，將進(jìn)一步觀察心肌缺血/再灌注1.HaHC,etal.Structuralspe4.ShantzLM,etal.Targetedoverexpressionofornithinedecarboxylaseenhancesbeta-adreagonist-inducedcardiachypertrophy.BiochemJ.2001;3585.Ruiz-ChicaJ,etal.FouriertransformRamanstudyofthestructuralbetweenDNAandbiogenicpolyamines.BiophysJ.2001Jan;80(1):44analogueexposure.Ca7.MaccarroneM,etal.Oxidationproductsofpolyaminesinducemitoch9.PaschenW.Polyaminemetabolisminreversiblecerebralisch10.NageshBabuG,etal.Spermidine/spermineN1-acetyltransferasetransientfocalcerebralischemiaandrepe11.CamonL.etal.PolyaminemetabolismandgBBiomedSciAppl.2001Nov25;764(1-2):385-13．PorcianiS,etal.Polyaminesasbiochemicalindicatorsofradiationinjury.Phy15.GiladVHetal.Thepolyaminestressresponse:tissue-,endocrine-,andderegulation.BiochemPharmacol.2001Jan15;61(2):16.WoodcockEA,etal.Ins(1,4,5)P3duringmyocardialischemiaanditsrela18.BrownEM,etal.Ext19．RuiWang,ChangqingXu,etal.Calciumandpolyamineregula20.李建生.消化道腫瘤患者鳥氨酸脫羧酶和腐胺測定的臨床意義.醫(yī)師進(jìn)修雜志2000231122．孫若鵬，等.癲癇患兒多胺水平的變化及24.馮立新.多胺生物合成抑制誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的克隆及表達(dá).中華腫瘤雜志19980426.陳志華,柯海萍,李紅艷,房青,曹淑蘭,范慕貞.二氟甲基鳥氨酸對人肺癌細(xì)胞生長特性的影響及其相關(guān)基因ALT-04ag表達(dá)調(diào)控.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)29.畢春明等.小鼠卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂前的鈣離子波動及分布.南京師大學(xué)報（自然科學(xué)版）200023130.崔宗杰等.大鼠胰腺腺泡中膽囊收縮素類似物J31.王培勇；何作云；劉健.新生大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Ca22、項目的研究內(nèi)容、研究目標(biāo),以及擬解決的關(guān)鍵問題。）；）；(2)心肌缺血/再灌注對心肌組織內(nèi)源性多胺代謝的影響，觀察多胺組分和關(guān)鍵限和多胺含量變化的內(nèi)在聯(lián)系，從新的視覺揭示心肌缺血/再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制，并為(2)采用Langendoff離體器官灌流裝置，通過預(yù)心臟缺血/再灌注模型，并檢測不同時期心肌組織多胺各組分含量和多胺代謝標(biāo)志酶的活性，同時檢測心電圖、心功能、代謝（如LDH血/再灌注損傷和心肌組織多胺代謝穩(wěn)態(tài)破壞兩者之間內(nèi)在聯(lián)系。根據(jù)多胺變化情況，），成心肌損傷(酶學(xué)，心功能，心電圖，超微結(jié)構(gòu)，分子生物學(xué))，并檢測Fas、Fas-L、在動態(tài)觀察心肌缺血/再灌注內(nèi)源性多胺組分和關(guān)鍵限速酶(鳥氨酸脫羧酶和精咪/精胺乙酰轉(zhuǎn)移酶等)的變化的基礎(chǔ)上，確定其消長規(guī)律，分析多胺（主要是精胺）在什么情況下可發(fā)揮生理性心肌保護(hù)作用？又在什么情況下則表現(xiàn)出病理性心肌損傷作(探討發(fā)生的規(guī)律和機(jī)制)？其量效關(guān)系如何(重點解決兩者之間的劑量和時間依賴關(guān)胺是把雙刃劍”的假說提供實驗依據(jù)，為心肌缺血/再灌注損傷提供新的治療靶點，為14細(xì)胞或組織前處理同ODC活性分析，14,000g×20min，取上清加入S-[carboxyl-14C]S-[carboxyl-14C]adenosyl-L-methionine中釋放的[14C]CO2的量。酶活性以nmoleCO2/h/mg14中止反應(yīng)。帶正電荷的反映產(chǎn)物[14C]-acetylspermidine被吸附在帶負(fù)電荷的濾紙上。用液閃計數(shù)分離心肌細(xì)胞，在含抑肽酶的緩沖液中勻漿，離心800g去除細(xì)胞核，懸浮液再離心43,000g育。化學(xué)發(fā)光法顯現(xiàn)蛋白帶，轉(zhuǎn)移至Kod具體心肌細(xì)胞分離、貼壁、熒光探針標(biāo)記、游離鈣測量和分析等，參見我們已發(fā)表的論文（見電極拉制、細(xì)胞分離、電阻補(bǔ)償、膜片鉗議操作、電流記錄和分析等具體方法，參見后面《工作基用多道生理記錄儀記錄心功參數(shù)和心電圖，用微機(jī)化紫外分光儀檢測冠脈流出液中心臟標(biāo)記酶除上述判定精胺引起細(xì)胞內(nèi)鈣升高可能機(jī)制的實驗方案外，尚需觀察:(3)加入不同的保護(hù)劑(如自由基清除劑，鈣通道阻斷劑，細(xì)胞膜穩(wěn)定劑，能3)其他參見上面研究子激活【4】，缺血/再灌注為應(yīng)激原，故（SOD可取消之）和細(xì)胞壞死。這些都說明我們提出的“多胺14細(xì)胞或組織前處理同ODC活性分析，14,000g×20min，取上清加入S-[carboxyl-14C]S-[carboxyl-14C]adenosyl-L-methionine中釋放的[14C]CO2的量。酶活性以nmoleCO2/h/mg14中止反應(yīng)。帶正電荷的反映產(chǎn)物[14C]-acetylspermidine被吸附在帶負(fù)電荷的濾紙上。用液閃計數(shù)分離心肌細(xì)胞，在含抑肽酶的緩沖液中勻漿，離心800g去除細(xì)胞核，懸浮液再離心43,000g育?；瘜W(xué)發(fā)光法顯現(xiàn)蛋白帶，轉(zhuǎn)移至Kod具體心肌細(xì)胞分離、貼壁、熒光探針標(biāo)記、游離鈣測量和分析等，參見我們已發(fā)表的論文（見電極拉制、細(xì)胞分離、電阻補(bǔ)償、膜片鉗議操作、電流記錄和分析等具體方法，參見后面《工作基用多道生理記錄儀記錄心功參數(shù)和心電圖，用微機(jī)化紫外分光儀檢測冠脈流出液中心臟標(biāo)記酶除上述判定精胺引起細(xì)胞內(nèi)鈣升高可能機(jī)制的實驗方案外，尚需觀察:(3)加入不同的保護(hù)劑(如自由基清除劑，鈣通道阻斷劑，細(xì)胞膜穩(wěn)定劑，3)其他參見上面研究子激活【4】，缺血/再灌注為應(yīng)激原，故（SOD可取消之）和細(xì)胞壞死。這些都說明我們提出的“多胺在以后實驗中，我們又進(jìn)一步觀察到：1）大鼠離體灌流心臟再灌注時精胺和總多胺代謝池含量減少；2）適當(dāng)補(bǔ)充精胺（1mM）可預(yù)防分離大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧時的鈣超載；3）高濃度精胺（10mM）可導(dǎo)致培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞發(fā)生壞死。并根據(jù)文獻(xiàn)回多胺系統(tǒng)在心肌組織的分布，代謝及生理功能，尤其在心科研設(shè)計，采用多層次(整體，器官，細(xì)胞，分子)和多手段(高效液譜，膜片鉗，基因鉗，激光掃描熒光成像，分子生物學(xué)，流式細(xì)胞儀、電鏡等)相結(jié)合的方法，深入探討(1)觀察大鼠心肌缺血/再灌注不同時間冠脈流出液和心肌組織多胺含量的動態(tài)變(2)觀察不同劑量外源性精胺對大鼠分離或培養(yǎng)心肌細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響及劑量(1)觀察心肌缺血/再灌注時心肌組織多胺代謝限速酶(鳥氨酸脫羧酶和精咪/精胺預(yù)期本課題完成后，將揭示大鼠心肌正常和缺血/再灌注時多胺代謝（各組分含量（二）研究基礎(chǔ)與工作條件1、工作基礎(chǔ)（與本項目相關(guān)的研究工作積累和已取得的研究工作成績）2001.8-2002.5，本課題申請人徐長慶教授作為高級訪問學(xué)者赴加拿大開展合作研錄，課題申請人是第二作者(并署名國內(nèi)工作單位－徐長慶教授隨后在加拿大蒙特利爾大學(xué)心臟研究所，采用基因鉗技術(shù)(分子生物學(xué)進(jìn)一步探討鉀通道與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系和心律失常的發(fā)生機(jī)制（有關(guān)研究論文已投由基的形成有關(guān)(見圖5)。我們的研究成果在2002年11月于廣州的國際心臟研究會基金課題《大鼠心肌細(xì)胞鈣敏感受體的生物學(xué)活性及其在心肌缺血/再灌注損傷中的作織的多胺（腐胺、精咪和精胺）含量和缺血/再灌注時多胺代謝池的變化以及外源性精心臟缺血（礦置）/再灌注模型中心肌組織的多胺含量，并發(fā)現(xiàn)再灌注時心肌組織的多多胺標(biāo)準(zhǔn)品（腐胺、精咪和精胺）正常大鼠心肌組織多胺含量顯減輕或取消單個大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞內(nèi)的鈣超載；而復(fù)氧后加入則未見明后加精胺組（正常→缺氧→復(fù)氧→精胺）態(tài)對心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的正常至關(guān)重要。為此，我們首次提出的“多胺是把雙刃劍”2、工作條件（包括已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和擬解決的途徑，包括利用國術(shù)所需的各種設(shè)備，制冰機(jī)等)，多道生理記錄儀，雙光束紫外分光光度儀，液閃計數(shù)儀等，均為基對人胚心肌細(xì)胞電生理指標(biāo)影響和中藥保護(hù)研究》(2000-2002)、黑龍江省教育廳海外學(xué)人科研合作課題《心肌細(xì)胞鈣敏感受體的基因表達(dá)和生理病理意義研究》(2003-2005)，國家自然科學(xué)基金課題《大鼠心1．RuiWang,ChangqingXu,eta2．徐長慶，WANGRui，等.鈣敏感受體的研究進(jìn)展和大鼠心肌細(xì)胞鈣敏感受體的功能檢測.中國病理生理雜志志2002;18(13):1738-42.）：5．徐長慶,李玉榮,等．氧自由基致豚鼠心室肌細(xì)6．李全鳳,徐長慶，等.利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察丹參滴7．孫可青,徐長慶,等.不同預(yù)適應(yīng)方法抗缺血/再灌注心律失常的8．孫可青,徐長慶，等.丹參素的抗心律失常作9.單宏麗,徐長慶,等.紅花黃素對豚鼠單個心室細(xì)胞動作電位和鈣10.徐長慶,李玉榮,等.活性氧對豚鼠心室肌細(xì)胞不同鉀通道離子電流的影響.中國病理生理雜志13.王新一，徐長慶,等.不同濃度比的外源性自由基生成系統(tǒng)致心律失常作用的比較．哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報負(fù)責(zé)課題總體設(shè)計，指導(dǎo)和總結(jié)，并參加膜片reperfusionandprotectiveeffectofcompoundDanshendrippingpills.JOU（4）趙雅君，徐長慶，等.復(fù)方丹參滴丸對離體大鼠缺氧/復(fù)氧心肌的保護(hù)作用.中國病理生理雜志2002;18(10):（6）趙雅君，等.丹參滴丸對缺血/再灌（8）趙雅君，等.健康老人與高血壓、冠心病老人甲襞基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞的基礎(chǔ)研究及臨床觀察(第一名1.孫軼華，等.IL-2基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞體外2.孫軼華，等.IL-2轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞治療肺癌胸3.孫軼華，等.聯(lián)合用藥對糖尿病病人血糖血脂及血液流變學(xué)的影響.黑龍江醫(yī)學(xué)203.王莞，等.實驗性糖尿病大鼠血清一氧化氮與腫瘤壞死因子的相關(guān)性研究《中國病理4.王莞，等.實驗性糖尿病大鼠血清一氧化氮含量的變化2.中國第四軍醫(yī)大學(xué)病理生理專業(yè),碩士科研工作經(jīng)歷:BiochemistryandCellBiology；PediatricResearch；andnon-vasculartissues.BiochemPharmacol.67:147-156expressioninischemia-rePhysiol.Pharmacol.81:spontaneouslyhypertensiverats.J.Hypertens.21:16．WangR.Thegasotransmitterroleofhydrogensulfide.AntioxidantRedoxSignalNeuroscience121:7bychronicnicotineconsumption.Biochem.Biophys.Res.Comechanisms.Am.J.Physiol.283:H4inHypertension.Hypertension.16.NdisangJF,WangR.NoveltheraprectifierK+currentinratmmusclecells.J.Cardiovasc.Res.40:66(KATP)channelsubunitsCommun.296:463-469,ischemia-reperfusion.J.Cell.Biochem.822.MaltaisD,MateescuMA,WangR,PaquinJ.Themultifunctaggregationofnewlydifferorganization.Dev.Neurosci.2002,Calmodulin-dependentcyclicnucleotidephosphodiesteraseinanexpeischemia-reperfusion.Can.J.Physiol.Pharmacol.84、承擔(dān)科研項目情況（申請者和項目組主要成員正在承擔(dān)的科研項目情況，1）《大鼠心肌細(xì)胞