蛋白純化步驟蛋白純化步驟走著,看著,身邊小說是否能“聯(lián)”到你生活里不經(jīng)意間感慨;聽著,學(xué)著,那些零碎知識是否“聯(lián)”到你科研里正在探索試驗;------知識公園里設(shè)計著一位主角,那棵樹,筆直干、側(cè)伸斜枝是思維框架,“聯(lián)著”地下,伸向天空?？蒲兴季S總在不停地計劃、設(shè)計,梳理知識,以備清楚行動。在設(shè)計步驟中不停吸收新知識,枝繁葉茂,豐富主干,正如條條大路通羅馬,思維也會隨之活躍,路也會愈加靈活?，F(xiàn)在天,我們所要梳理主干,是蛋白純化知識步驟,即蛋白純化基礎(chǔ)策略,愿這些簡單知識點歸類能夠聯(lián)到你科研思維。前奏:釋放蛋白,目標(biāo):濃縮捕捉蛋白;間奏:粗分離蛋白,關(guān)鍵利用離心、沉淀、萃取等方法將蛋白和細胞中其她成份（DNA、RNA等）物質(zhì)進行分離。主旋律:精細純化蛋白,去除蛋白質(zhì)分子量比較靠近蛋白以及痕量雜質(zhì)。蛋白質(zhì)純化蛋白質(zhì)純化精純化蛋白處理樣品粗分離蛋白精純化蛋白處理樣品粗分離蛋白層析電泳離心沉淀法萃取、透析動物組織破碎植物材料研磨細菌破碎層析電泳離心沉淀法萃取、透析動物組織破碎植物材料研磨細菌破碎等點聚焦電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳酶（纖維素酶、溶菌酶）超聲波破碎電動、勻漿機破碎有機溶劑沉淀等電點沉淀鹽析沉淀親和層析凝膠過濾層析疏水層析離子交換層析等點聚焦電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳酶（纖維素酶、溶菌酶）超聲波破碎電動、勻漿機破碎有機溶劑沉淀等電點沉淀鹽析沉淀親和層析凝膠過濾層析疏水層析離子交換層析我們需要依據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)多種性質(zhì)選擇適宜蛋白純化方法。親和層析因其高分辨率特點,常見于精制純化蛋白,依據(jù)目標(biāo)蛋白與配體之間特異性結(jié)合能力、重組標(biāo)簽蛋白螯合金屬離子能力、帶有糖基化修飾蛋白可于外源凝集素結(jié)合能力,親和層析含有高目蛋白分辨率,不過在進行精純化蛋白之前,需要對蛋白質(zhì)進行粗純化,常見有硫酸銨鹽析法。比如分享來自一位網(wǎng)友純化蛋白經(jīng)驗帖子,其目標(biāo)在于純化大腸桿菌表示可溶性sigma32蛋白,該蛋白能夠與細胞內(nèi)CoreRNApolymeras結(jié)合形成復(fù)合體,最終確定采取免疫親和柱來純化蛋白復(fù)合體,但為了提升純化效率,首先對復(fù)合體進行粗純化,利用帶正電PEI（聚乙烯亞胺）沉淀酸性蛋白和核酸,接著高鹽洗脫蛋白,為了去除洗脫液中PEI溶劑,采取硫酸銨沉淀蛋白,將蛋白和PEI分開,粗分離純化后,再采取免疫親和柱方法進行精細純化目標(biāo)蛋白。凝膠過濾層析能夠應(yīng)用蛋白分子間分級分離,也能夠去除蛋白混合物中分子量差異較大雜質(zhì)。比如從Hela細胞中純化一個叫AP-1轉(zhuǎn)錄因子,就采取凝膠過濾方法去除混合物中核酸酶,因為核酸酶能夠降解DNA親和柱,并能夠和其她非特異性蛋白結(jié)合,影響目標(biāo)蛋白純化。在分離純化蛋白時,因為其環(huán)境中PH值、有機溶劑、蛋白酶降解等不穩(wěn)定原因影響,使得蛋白質(zhì)分子間氫鍵、離子鍵、二硫鍵被破壞,影響蛋白穩(wěn)定性,而有蛋白質(zhì)對其所處緩沖液要求較高,比如,Stillman試驗室純化大腸桿菌表示CDC6蛋白,采取GST標(biāo)簽蛋白進行純化,純化得到CDC6不穩(wěn)定而發(fā)生沉淀,以后試驗了十多個buffer,結(jié)果發(fā)覺磷酸鉀和谷氨酸鉀緩沖液中,CDC6就不會沉淀并含有蛋白活性。由此可見,每一個蛋白往往需要多個純化方法精心組合才能達成分離純化目,而且需要仔細考慮試驗過程中環(huán)境原因,確保純化蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。在此篇文章中,我想提醒給大家是:知識聯(lián)絡(luò)和設(shè)計,將相關(guān)知識點串起來,同時給自己費心思了解知識穿上有個性外衣,這是基于你習(xí)性對于形式中理念了解,只要用心,我認(rèn)為會是一件有意思事情。另外,結(jié)合了部分進行蛋白質(zhì)純化試驗中經(jīng)驗,膚淺分析了綜合應(yīng)用多種方法標(biāo)準(zhǔn),每一個蛋白質(zhì)都有其對應(yīng)氨基酸序列,表現(xiàn)出不一樣理化性質(zhì),這些物理上差異性能夠作為進行蛋白純化線索,具體試驗操作還需數(shù)次實踐驗證,愿這些基礎(chǔ)知識能