動物胚胎工程實驗教程小鼠卵的體外成熟與體外受精材料與方法?一、引言動物胚胎工程是現(xiàn)代生物技術(shù)的重要領(lǐng)域，小鼠卵的體外成熟與體外受精技術(shù)在生殖生物學研究、轉(zhuǎn)基因動物制備、胚胎干細胞研究等方面具有重要意義。本實驗教程詳細介紹了小鼠卵的體外成熟與體外受精的材料與方法，旨在為相關(guān)研究人員提供標準化的實驗操作指導。

二、實驗材料

實驗動物性成熟的雌性小鼠（68周齡，體重2025g），品系可根據(jù)實驗需求選擇，常用的如ICR小鼠。

主要試劑1.基礎(chǔ)培養(yǎng)液：M16培養(yǎng)液（Sigma公司）或CZB培養(yǎng)液（Sigma公司），使用前需按照說明書要求添加碳酸氫鈉、青霉素、鏈霉素等成分，并調(diào)整pH至合適范圍（如M16培養(yǎng)液pH調(diào)至7.27.4）。2.激素孕馬血清促性腺激素（PMSG）：Sigma公司產(chǎn)品。人絨毛膜促性腺激素（hCG）：Sigma公司產(chǎn)品。3.卵泡刺激素（FSH）：Sigma公司產(chǎn)品。4.促黃體生成素（LH）：Sigma公司產(chǎn)品。5.透明質(zhì)酸酶：Sigma公司產(chǎn)品，用于去除卵丘細胞。6.胰蛋白酶EDTA：Gibco公司產(chǎn)品，用于消化組織。7.礦物油：Sigma公司產(chǎn)品，用于覆蓋培養(yǎng)液防止蒸發(fā)。8.其他試劑：乙醇、甲醛、臺盼藍等。

儀器設(shè)備1.體視顯微鏡：用于觀察小鼠的生殖器官和獲取卵母細胞。2.超凈工作臺：提供無菌操作環(huán)境。3.二氧化碳培養(yǎng)箱：維持培養(yǎng)液所需的氣體環(huán)境（5%CO?、95%空氣）和溫度（37℃）。4.離心機：用于培養(yǎng)液的離心等操作。5.移液器：包括不同規(guī)格的單道和多道移液器，用于準確移取試劑。6.培養(yǎng)皿：不同規(guī)格的塑料培養(yǎng)皿和玻璃培養(yǎng)皿，用于培養(yǎng)卵母細胞和胚胎。7.手術(shù)器械：眼科剪、眼科鑷、止血鉗等，用于小鼠的解剖操作。

三、實驗方法

小鼠卵母細胞的采集1.超排卵處理將雌性小鼠隨機分為實驗組和對照組（若有對照需求），每籠飼養(yǎng)35只小鼠。實驗組小鼠腹腔注射PMSG510IU/只，4852小時后腹腔注射hCG510IU/只。對照組小鼠注射等量生理鹽水作為對照。PMSG和hCG的用量可根據(jù)小鼠品系和實驗經(jīng)驗進行適當調(diào)整。例如，對于ICR小鼠，常用劑量為PMSG7.5IU/只，hCG7.5IU/只。2.卵母細胞采集在注射hCG后1315小時，將小鼠頸椎脫臼處死，然后用75%乙醇消毒腹部皮膚。在超凈工作臺內(nèi)，沿腹部正中線剪開皮膚和腹膜，暴露雙側(cè)卵巢和輸卵管。用眼科鑷小心分離輸卵管，將輸卵管傘端剪下，放入含有預(yù)溫基礎(chǔ)培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。用眼科鑷輕輕擠壓輸卵管壺腹部，使卵母細胞卵丘細胞復(fù)合體（COCs）隨培養(yǎng)液流入培養(yǎng)皿中。

卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)1.卵母細胞的篩選在體視顯微鏡下觀察收集到的COCs，選擇具有完整卵丘細胞層、卵母細胞胞質(zhì)均勻、透明帶完整的COCs用于體外成熟培養(yǎng)。去除周圍包裹的血細胞、脂肪顆粒等雜質(zhì)，并用預(yù)溫的基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗滌23次。2.體外成熟培養(yǎng)體系的準備將基礎(chǔ)培養(yǎng)液分裝到培養(yǎng)皿中，每皿加入適量培養(yǎng)液（如500μl），并覆蓋一層礦物油，防止培養(yǎng)液蒸發(fā)。在培養(yǎng)液中添加促性腺激素（如FSH110μg/ml和LH110μg/ml），可根據(jù)不同研究需求調(diào)整激素濃度。3.卵母細胞接種將篩選好的COCs用移液器輕輕接種到含有培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，每皿接種1020個COCs。將培養(yǎng)皿放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO?、95%空氣的條件下培養(yǎng)1416小時。

卵母細胞的體外受精1.精子的獲取選用性成熟的雄性小鼠，頸椎脫臼處死，用75%乙醇消毒腹部皮膚。在超凈工作臺內(nèi)，沿腹部正中線剪開皮膚和腹膜，暴露雙側(cè)附睪。用眼科鑷分離出附睪尾，放入含有預(yù)溫基礎(chǔ)培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。用眼科鑷輕輕擠壓附睪尾，使精子隨培養(yǎng)液流出，收集精子懸液。2.精子的處理將收集到的精子懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入適量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，輕輕吹打均勻。以10001500rpm離心510分鐘，棄去上清液。加入新鮮的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，調(diào)整精子濃度至合適范圍（如1×10?5×10?/ml）。3.體外受精體系的準備在培養(yǎng)皿中加入適量預(yù)溫的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，覆蓋礦物油。將經(jīng)過體外成熟培養(yǎng)的卵母細胞從培養(yǎng)皿中取出，用預(yù)溫的基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗滌23次，去除表面的成熟培養(yǎng)液。4.體外受精操作將處理好的精子懸液加入到含有卵母細胞的培養(yǎng)皿中，使精子濃度達到合適比例（如每10μl培養(yǎng)液中加入1μl精子懸液）。將培養(yǎng)皿放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO?、95%空氣的條件下培養(yǎng)46小時。

受精卵的培養(yǎng)與觀察1.受精卵的篩選體外受精培養(yǎng)46小時后，在體視顯微鏡下觀察受精卵的受精情況。受精成功的標志是在卵母細胞的透明帶內(nèi)可見兩個原核（雄性原核和雌性原核）。挑選出正常受精的受精卵，用預(yù)溫的基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗滌23次，去除多余的精子和雜質(zhì)。2.受精卵的培養(yǎng)將篩選好的受精卵接種到含有新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，每皿接種1020個受精卵，并覆蓋礦物油。將培養(yǎng)皿放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO?、95%空氣的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每隔一定時間（如24小時）觀察受精卵的發(fā)育情況，記錄受精卵發(fā)育到不同階段（如2細胞、4細胞、8細胞、桑椹胚、囊胚等）的比例。3.胚胎發(fā)育情況的評估在體視顯微鏡下觀察胚胎的形態(tài)結(jié)構(gòu)，判斷胚胎的發(fā)育是否正常。正常發(fā)育的胚胎應(yīng)該具有規(guī)則的細胞形態(tài)和清晰的細胞邊界。對于發(fā)育到一定階段的胚胎，可以采用不同的染色方法（如臺盼藍染色）來評估胚胎的活性?；钆咛ゲ恢琅咛t被染成藍色。

實驗注意事項1.整個實驗過程需嚴格遵守無菌操作原則，防止微生物污染。超凈工作臺在使用前需提前30分鐘開啟紫外燈消毒，操作時要佩戴口罩、帽子和無菌手套。2.實驗動物的飼養(yǎng)環(huán)境要保持清潔、安靜，溫度控制在2225℃，濕度保持在40%60%。飼料和飲水要保證質(zhì)量，定期更換。3.各種試劑的配制要準確無誤，嚴格按照說明書要求操作。使用的玻璃器皿和塑料器皿要經(jīng)過嚴格的清洗和消毒處理。4.在進行小鼠解剖操作時，要小心謹慎，避免損傷生殖器官。分離輸卵管和獲取卵母細胞的過程中動作要輕柔，防止對卵母細胞造成機械損傷。5.體外培養(yǎng)體系的氣體環(huán)境和溫度要嚴格控制，定期檢查二氧化碳培養(yǎng)箱的性能，確保培養(yǎng)條件的穩(wěn)定性。6.在觀察和操作胚胎時，要盡量減少外界因素對胚胎的影響，避免頻繁打開培養(yǎng)箱門。使用的培養(yǎng)皿和培養(yǎng)液要提前預(yù)溫至37℃，以減少溫度變化對胚胎的刺激。

四、結(jié)果記錄與分析1.記錄每次實驗采集到的卵母細胞數(shù)量、體外成熟培養(yǎng)后成熟卵母細胞的數(shù)量及成熟率（成熟率=成熟卵母細胞數(shù)/采集到的卵母細胞數(shù)×100%）。2.記錄體外受精后受精卵的數(shù)量、發(fā)育到不同階段胚胎的數(shù)量及各階段胚胎的發(fā)育率（如2細胞發(fā)育率=2細胞胚胎數(shù)/受精卵數(shù)×100%）。3.對不同實驗組（如不同激素處理組、不同培養(yǎng)條件組等）的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，比較各實驗組之間卵母細胞成熟率、胚胎發(fā)育率等指標的差異。常用的統(tǒng)計學方法有t檢驗、方差分析等，具體方法根據(jù)實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)特點選擇。4.根據(jù)實驗結(jié)果分析不同因素對小鼠卵母細胞體外成熟和體外受精的影響，總結(jié)實驗中的經(jīng)驗教訓，為進一步優(yōu)化實驗方案提供依據(jù)。例如，如果發(fā)現(xiàn)某一組的胚胎發(fā)育率明顯低于其他組，需要分析該組在實驗操作過程中是否存在問題，如培養(yǎng)液成分、培養(yǎng)條件、操作手法等，以便針對性地進行改進。

五、討論1.本實驗中采用的PMSG和hCG超排卵方案是目前較為常用的方法，但不同小鼠品系對激素的反應(yīng)可能存在差異。在實際實驗中，可以根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果適當調(diào)整激素的劑量和注射時間，以提高超排卵的效果，獲得更多高質(zhì)量的卵母細胞。2.體外成熟培養(yǎng)體系中激素的添加對卵母細胞的成熟具有重要作用。FSH和LH可以模擬體內(nèi)卵泡發(fā)育過程中的激素微環(huán)境，促進卵母細胞的減數(shù)分裂恢復(fù)和成熟。然而，激素的最佳濃度需要根據(jù)不同的培養(yǎng)液體系和實驗對象進行優(yōu)化。過高或過低的激素濃度都可能影響卵母細胞的成熟率和后續(xù)胚胎發(fā)育能力。3.體外受精過程中精子的處理和受精條件的優(yōu)化是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。精子的濃度、活力以及受精時間等因素都會影響受精率和胚胎發(fā)育率。在實際操作中，要嚴格控制精子的質(zhì)量，通過合適的處理方法去除精液中的雜質(zhì)和死精，提高精子的活力。同時，要根據(jù)實驗結(jié)果確定最佳的受精時間，以確保較高的受精成功率。4.胚胎培養(yǎng)條件對胚胎的發(fā)育至關(guān)重要。除了氣體環(huán)境和溫度外，培養(yǎng)液的成分、滲透壓、pH值等都需要精確控制。不同階段的胚胎對營養(yǎng)物質(zhì)的需求也有所不同，因此在培養(yǎng)過程中可能需要根據(jù)胚胎的發(fā)育情況適時更換培養(yǎng)液，以提供適宜的營養(yǎng)支持。5.本實驗方法在小鼠卵母細胞的體外成熟與體外受精研究中具有一定的可靠性和重復(fù)性，但仍然存在一些局限性。例如，體外培養(yǎng)條件與體內(nèi)環(huán)境存在差異，可能導致胚胎發(fā)育能力與體內(nèi)發(fā)育存在一定差距。未來的研究可以進一步探索更接近體內(nèi)環(huán)境的培養(yǎng)體系，結(jié)合基因編輯技術(shù)等手段，深入研究胚胎發(fā)育的分子機制，提高胚胎工程技術(shù)的效率和成功率。

六、結(jié)論本實驗教程詳細介紹了小鼠卵母細胞的體外成熟與體外受精的材料與方法，通過嚴格的實驗操作和對實驗結(jié)果的記錄與分析，可