蛋白質(zhì)的修飾和表達(dá)第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑一、功能基團(tuán)的特異性修飾

I.

多位點取代

II.單一的限制性取代

III.次級取代二、基于蛋白質(zhì)片段的嵌合修飾I.嵌合蛋白質(zhì)—非共價締合系統(tǒng)

II.二硫鍵與嵌合蛋白質(zhì)的形成

III.嵌合蛋白質(zhì)—通過化學(xué)激活形成肽鍵

IV.嵌合蛋白質(zhì)—通過酶連接反應(yīng)形成肽鍵

V.通過非肽鍵形成嵌合蛋白質(zhì)

一、功能基團(tuán)的特異性修飾在20種天然氨基酸的側(cè)鏈中，大約有一半可以在足夠溫和的條件下產(chǎn)生化學(xué)取代而不使肽鍵受損，其中氨基、巰基和羧基特別容易產(chǎn)生有用的取代。因為任何給定的氨基酸殘基在蛋白質(zhì)分子中可能出現(xiàn)不止一次，如果用化學(xué)的方法對氨基酸進(jìn)行修飾時，正常情況下所有相關(guān)的氨基酸側(cè)鏈都要被取代。至于談到氨基和羧基基團(tuán)，盡管處在側(cè)鏈上和末端基團(tuán)的pK值有差別，但在化學(xué)上很難將肽鏈的

-氨基或-羧基基團(tuán)與側(cè)鏈上的氨基或羧基相區(qū)別。一、功能基團(tuán)的特異性修飾1．多位點取代2．單一的或限制性取代

3．次級取代

1．多位點取代(1)常規(guī)的氨基保護(hù)

(2)亞氨代乙?；?/p>

(3)其他的側(cè)鏈取代

2．限制性取代

(1)

-異硫氰酸苯酯對

-氨基的選擇性(2)羰基二酰肼的親核取代(3)蛋白醛(4)通過蛋白質(zhì)水解的逆反應(yīng)產(chǎn)生蛋白和肽的

-酰胺(5)蛋白醛—由糖的化學(xué)氧化產(chǎn)生

3．次級取代(1)與蛋白醛偶聯(lián)—親核取代物

(2)與蛋白質(zhì)活性親核物偶聯(lián)—醛取代物

二、基于蛋白質(zhì)片段的嵌合修飾

通過非共價鍵相互作用、二硫鍵、常規(guī)肽鍵(通過化學(xué)法或酶法產(chǎn)生)或其他非肽共價鍵，可以將較小的肽段連在一起，這就是通過半合成對蛋白質(zhì)進(jìn)行工程操作的原則。二、基于蛋白質(zhì)片段的嵌合修飾1．通過非共價締合系統(tǒng)產(chǎn)生嵌合蛋白質(zhì)2．二硫鍵與嵌合蛋白質(zhì)的形成3．嵌合蛋白質(zhì)—通過化學(xué)激活形成肽鍵4．融合蛋白質(zhì)—通過酶連接反應(yīng)形成肽鍵5．通過非肽鍵形成嵌合蛋白質(zhì)

第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑一、編碼基因的專一性位點和區(qū)域性定向突變1.

編碼基因的專一性位點突變

2.

區(qū)域性定向突變

二、基因融合和基因剪接1.

利用基因融合技術(shù)表達(dá)外源基因的緣由

2.

基因融合的策略

3.

產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子嵌合體的方法

4.

蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子間的連接

三、tRNA介導(dǎo)定點攙入非天然氨基酸基因突變技術(shù)是通過在基因水平上對其編碼的蛋白質(zhì)分子進(jìn)行改造，在其表達(dá)后用來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的一種方法。根據(jù)其特點，可將基因突變分為兩大類：位點特異性突變和隨機(jī)突變。位點特異性突變又可大體分為三種類型：一類是通過寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變；第二類是盒式突變或片段取代突變；第三類是利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，以雙鏈DNA為模板進(jìn)行的基因突變?？梢赃@樣說，PCR技術(shù)的出現(xiàn)為基因的突變，基因的剪接開辟了一條極其有效、極其快捷的道路。當(dāng)然無論哪種方法都可以在為蛋白質(zhì)編碼的基因序列上產(chǎn)生插入、缺失、取代等突變。

1．編碼基因的專一性位點突變

專一性位點突變又稱特異性位點突變。這類突變都是在含有突變序列的寡核苷引物介導(dǎo)下進(jìn)行的，因此又稱為寡核苷酸介導(dǎo)的位點特異性突變。這種突變的方法從問世至今不斷更新，特別是PCR技術(shù)出現(xiàn)后變得更高效。

(1)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素

(2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

(2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

①Kunkel突變法②基于抗生素抗性“回復(fù)”的突變方法③基于去除特定限制酶切位點的突變④利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生定點突變2．區(qū)域性定向突變

基因工程技術(shù)不但可使基因產(chǎn)生特異性位點突變，也可以產(chǎn)生區(qū)域性的突變。常用的方法如盒式突變法(cassettemutagenesis)，又稱片段取代法(DNAfragmentreplacement)。這一方法的要點是利用目標(biāo)基因中所具有的適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點，用具有任何長度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片段來置換或取代目標(biāo)基因上的一段DNA序列。研究目的

通過改變幾個氨基酸序列來研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)-功能之間的關(guān)系，也可以通過盒式突變法產(chǎn)生嵌合蛋白質(zhì)。在這個嵌合蛋白質(zhì)中，蛋白質(zhì)分子中的整個結(jié)構(gòu)域都可以用完全不同的氨基酸序列來置換。盒式突變最主要的用途是產(chǎn)生各種特異性的突變或突變家族，在這些突變體中各種不同的序列被集中在目標(biāo)基因的一個特定區(qū)域，從而為研究蛋白質(zhì)特定結(jié)構(gòu)區(qū)段或特定結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能提供了一個切實可行的方法。二、基因融合和基因剪接1．利用基因融合技術(shù)表達(dá)外源基因的緣由2．基因融合的策略與蛋白質(zhì)分子嵌合體3．蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子間的連接基因融合的用途

上述這些基因融合策略，主要是有利于外源基因的表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化以及細(xì)胞定位。作為蛋白質(zhì)分子改造可以借用這些策略對蛋白質(zhì)分子中的特定序列、結(jié)構(gòu)元件乃至結(jié)構(gòu)域通過基因剪接來進(jìn)行操作。

第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)重組蛋白質(zhì)在酵母細(xì)胞中的表達(dá)重組蛋白質(zhì)在哺乳類動物細(xì)胞中的表達(dá)

一、大腸桿菌中表達(dá)體系的優(yōu)點大腸桿菌(E.coli)表達(dá)體系是目前應(yīng)用最廣的一個外源基因表達(dá)體系，是外源基因表達(dá)的首選體系。利用大腸桿菌作為表達(dá)體系的優(yōu)點：遺傳學(xué)和生理學(xué)背景清楚；容易培養(yǎng)，特別是高密度發(fā)酵；外源基因經(jīng)?？梢赃_(dá)到高效表達(dá)。大腸桿菌表達(dá)體系的缺點大腸桿菌系統(tǒng)最大的不足之處是不能進(jìn)行典型真核細(xì)胞所具有的復(fù)雜的翻譯后修飾，如糖基化、烷基化、磷酸化、特異性的蛋白水解加工等；而廣泛二硫鍵的形成以及外源蛋白質(zhì)組裝成多亞基復(fù)合體的能力也受到限制。大腸桿菌體系的另一個不足之處是外源基因產(chǎn)物在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)易形成不溶性的包涵體；而當(dāng)真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時，作為起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白質(zhì)的N末端。最后，由于真核mRNA的結(jié)構(gòu)特性以及密碼子使用頻率與大腸桿菌本身的差異，當(dāng)用真核mRNA的序列直接在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)時，有時不能得到足夠的產(chǎn)物。大腸桿菌表達(dá)體系的應(yīng)用

當(dāng)外源蛋白質(zhì)的分子量小于70kD,不存在半胱氨酸或分子內(nèi)的二硫鍵少于3～4個，以及不需要翻譯后修飾而能保持其生物活性的蛋白質(zhì)，大多可以利用大腸桿菌系統(tǒng)得到滿意的結(jié)果。1．表達(dá)載體的一般特點(1)復(fù)制起始點(2)選擇性基因(3)強(qiáng)的、可誘導(dǎo)的啟動子(4)強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止序列(5)核糖體結(jié)合位點(6)合適的多克隆位點2．與外源基因有效表達(dá)的相關(guān)因素(1)有效的轉(zhuǎn)錄起始(2)有效的翻譯(3)蛋白質(zhì)水解作用(4)蛋白質(zhì)的外泌3．改善表達(dá)水平的方法①誘導(dǎo)條件②外源基因的編碼序列③用蛋白酶缺失的宿主菌4.改善外源蛋白溶解性的方法

①外源蛋白的分泌表達(dá)②細(xì)菌生長溫度③外源蛋白與分子伴侶和折疊酶共表達(dá)④外源蛋白與相關(guān)蛋白或蛋白標(biāo)簽融合二、目標(biāo)蛋白質(zhì)在酵母細(xì)胞中的表達(dá)有關(guān)酵母表達(dá)載體的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、篩選元件

外源mRNA在酵母細(xì)胞中的翻譯

3.

外源蛋白質(zhì)在酵母中的分泌表達(dá)

4.

翻譯后修飾二、目標(biāo)蛋白質(zhì)在酵母細(xì)胞中的表達(dá)

1.有關(guān)酵母表達(dá)載體的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、篩選元件

2.

外源mRNA在酵母細(xì)胞中的翻譯

3.

外源蛋白質(zhì)在酵母中的分泌表達(dá)4.

外源蛋白質(zhì)的翻譯后修飾

三、重組蛋白質(zhì)在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)

1．選擇哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系的優(yōu)點2．兩個主要的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)1．哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系的優(yōu)點哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系的種類和數(shù)目已經(jīng)發(fā)展很快。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系有很多其他體系不能與之相比的優(yōu)勢。它具有復(fù)雜的翻譯后加工系統(tǒng)，糖基化以及二硫鍵在合成和分泌過程中自然而然的正確形成。哺乳動物細(xì)胞具有產(chǎn)生正確折疊和完全生物活性的蛋白質(zhì)。實例：組織血纖維蛋白溶酶原激活因子(tPA)、紅細(xì)胞生成素(EPO)、人DNA酶。在大腸桿菌中表達(dá)tPA時，產(chǎn)生錯折疊和非糖基化，而在酵母中表達(dá)tPA產(chǎn)生過糖基化，二者的產(chǎn)物都沒有生物活性。分泌型哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可以通過設(shè)計，使外源重組蛋白直接分泌到培養(yǎng)基中。這個重組表達(dá)單位包括N末端的信號肽，其作用是起始新生肽鏈插入到內(nèi)織網(wǎng)中，此信號肽在分泌過程中被切除，從而產(chǎn)生具正確N端的重組蛋白質(zhì)。從內(nèi)織網(wǎng)到高爾基體再到細(xì)胞外空間的分泌過程產(chǎn)生糖基化和防止蛋白被胞內(nèi)蛋白酶水解。分泌過程也使蛋白質(zhì)二硫鍵正確配對和正確折疊。哺乳類動物細(xì)胞表達(dá)體系的另一個用處

是在天然環(huán)境條件下，研究工程化基因產(chǎn)物的性質(zhì)。如將胰島素受體基因經(jīng)突變后，再導(dǎo)入到特定細(xì)胞中表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在受體蛋白質(zhì)上單一氨基酸的突變可導(dǎo)致其對胰島素結(jié)合活性的喪失，并導(dǎo)致激活自磷酸化和酪氨酸激酶。2．兩個主要的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在哺乳動物細(xì)胞中有兩個基因表達(dá)系統(tǒng)可供選擇，一是瞬時表達(dá)系統(tǒng)，一是穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)。瞬時基因表達(dá)系統(tǒng)是一個簡單、有效的外源蛋白表達(dá)手段，其表達(dá)水平最高可以達(dá)到穩(wěn)定細(xì)胞表達(dá)水平。蛋白質(zhì)是由未整合的、不復(fù)制的質(zhì)粒DNA產(chǎn)生的，這樣使得蛋白質(zhì)表達(dá)的時間相對短，只有48h到7天。穩(wěn)定表