第3章

基因工程第二節(jié)基因工程的基本操作程序（第二課時）思考：獲取了足夠量的目的基因后，能直接把目的基因導入受體細胞嗎？就算可以進行轉錄和翻譯成蛋白質，游離的DNA片段也無法隨著細胞分裂進行復制，導致子代細胞不再含有目的基因游離的DNA片段進入受體細胞，一般會直接被分解

不能原因那怎樣才能讓基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代呢？二、基因表達載體的構建（一）目的：①讓基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代;

（二）組成：啟動子：基因的前端，RNA聚合酶識別和結合的部位；驅動基因轉錄出mRNA。限制酶切割位點，插入目的基因終止子：基因的尾端，能終止mRNA的轉錄標記基因：作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來。②使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用——基因工程的核心基因表達載體=啟動子+目的基因+終止子+標記基因+復制原點（若需要能完成自主復制，還應有復制原點）思考：目的基因該插入什么位置？目的基因插入位點不是隨意的：基因表達載體需要啟動子與終止子的調控，所以目的基因應插入

，若目的基因插入啟動子部位，啟動子將失去原功能。啟動子和終止子之間的部位思考：啟動子有哪些類型？①組成型啟動子：每種組織器官中均發(fā)揮作用。②組織特異型啟動子：特定組織器官中才能發(fā)揮作用。③誘導型啟動子：特定條件下刺激才能發(fā)揮作用。誘導型啟動子誘導物作用激活或抑制目的基因表達誘導型啟動子：

載體

≠

基因表達載體二者都有：標記基因和復制原點兩部分DNA片段。基因表達載體：在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子。思考：“載體”＝“基因表達載體”？原因：①生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達；②通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體生物中無法轉錄；③目的基因導入受體生物中需要有篩選標記；④為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調無件，如增強子等；⑤有時需要確定目的基因表達的產物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標識存在部位的基因或做成目的基因與標記基因的融合基因，如綠色熒光蛋白基因。思考:“啟動子”＝“起始密碼子”？

“終止子”＝“終止密碼子”？啟動子（DNA分子中）≠起始密碼子（mRNA分子中）

終止子（DNA分子中）≠終止密碼子（mRNA分子中）

終止子非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子三、基因表達載體的構建過程：載體（質粒）DNA分子（含目的基因）限制酶處理帶有黏性末端或平末端的切口帶有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質粒）同一種思考：該過程需要用到基因工程哪些工具酶？重組DNA分子目的基因

一、目的基因的篩選與獲?。?）種類：編碼蛋白質的基因（主），具有調控作用的因子（次）1.目的基因（1）概念：用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因注意：

所有的基因都編碼蛋白質或肽鏈。不是基因的種類一般分為結構基因、轉錄基因和調控基因。結構基因的功能：具有轉錄和翻譯功能，能控制生物性狀（編碼蛋白質或肽鏈）。轉錄基因的功能：只有轉錄功能，沒有翻譯功能，能轉錄形成tRNA和rRNA。調控基因的功能：不能進行轉錄和翻譯，只能調控其他基因的表達。思考:使用同一種DNA限制酶進行切割，會得到幾種重組DNA？有何缺點？怎么改進？載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質粒自連目的基因與質粒連接目的基因與目的基因連接質粒與質粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’1雙酶切：選擇2種不同的限制酶同時對目的基因和質粒切割，得到兩種不同的末端，可減少自身環(huán)化及反向連接等問題出現(xiàn)。思考：如何防止自身環(huán)化和反向連接的問題？雙酶切-G-CTTAA-A-TCTAG雙酶切：切出的黏性末端不能再堿基互補配對（一）方法農桿菌轉化法（主要）花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法（又叫感受態(tài)細胞法）——我國科學家獨創(chuàng)將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入微生物細胞基因槍法（了解）受精卵或體細胞主要是：受精卵主要是：原核細胞三、將目的基因導入受體細胞（1）花粉管通道法（我國科學家獨創(chuàng)）方法2：在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。方法1：用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中目的基因目的基因適用生物：開花植物1.將目的基因導入植物細胞受體細胞：受精卵（或合子或早期胚胎細胞）1.將目的基因導入植物細胞

農桿菌是生活在土壤中的微生物，自然條件下可侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物沒有侵染能力。農桿菌細胞內含有Ti質粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的T-DNA（可轉移的DNA）轉移到被侵染的細胞、并且將其整合到該細胞的染色體DNA上。（2）農桿菌轉化法此處“轉化”與肺炎鏈球菌轉化實驗中的“轉化”含義相同，實質都是基因重組★★★原核生物作為受體細胞產生的真核生物的蛋白質（如胰島素）通常沒有生物活性，因為沒有經過內質網和高爾基體的加工，因此需要在體外進行再加工。

轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程。實質是基因重組。1.將目的基因導入植物細胞（2）農桿菌轉化法1.將目的基因導入植物細胞（2）農桿菌轉化法①農桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數單子葉植物沒有感染能力。Ti質粒上的T-DNA可以轉移到被侵染的受體細胞，并將其整合到該細胞染色體的DNA上。②原理：目的基因Ti質粒表達載體農桿菌植物細胞植物細胞染色體DNA新性狀植株構建轉入導入插入表達③過程：1.將目的基因導入植物細胞（2）農桿菌轉化法③過程：1.將目的基因導入植物細胞（2）農桿菌轉化法雙子葉、裸子植物受損傷口分泌酚類物質和糖類物質吸引農桿菌向受傷組織集中將Ti質粒上的T-DNA(可轉移的DNA)轉移到被侵染的細胞中，并且將其整合到該細胞染色體DNA上。激活Vir區(qū)基因，導致T-DNA加工和轉移③過程：1.將目的基因導入植物細胞（2）農桿菌轉化法1）載體：2）受體細胞：第農桿菌Ti質粒受精卵或體細胞③過程：1.將目的基因導入植物細胞（2）農桿菌轉化法3）

兩次拼接第一次拼接：目的基因拼接到Ti質粒的T-DNA上。第二次拼接：被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上。③過程：1.將目的基因導入植物細胞（2）農桿菌轉化法4）兩次導入第一次導入：將目的基因的重組Ti質粒導入農桿菌。第二次導入：含目的基因的T-DNA導入受體細胞。2.將目的基因導入動物細胞（1）常用方法：（2）受體細胞:顯微注射法受精卵①體積大，易操作。②易表現(xiàn)出全能性。（3)過程：構建基因表達載體并提純利用顯微注射將基因表達載體注入動物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動物問題:為什么常選用受精卵作為受體細胞呢？3.將目的基因導入微生物細胞Ca2+處理法Ca2+感受態(tài)細胞吸收受體細胞1）原核細胞（常選擇大腸桿菌）2）優(yōu)點：繁殖快，多為單細胞，遺傳物質相對較少，易于培養(yǎng)。Ca2+處理的目的可使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。實例：利用轉基因大腸桿菌生產藥物受體細胞植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法花粉管通道法、農桿菌轉化法、基因槍法顯微注射技術Ca2＋處理法法受體細胞受精卵或體細胞受精卵原核細胞轉化過程以農桿菌轉化法為例：將目的基因插入Ti質粒的T-DNA上↓轉入農桿菌中↓導入植物細胞↓整合到受體細胞的DNA上提純含目的基因的表達載體↓顯微注射↓受精卵發(fā)育↓具有新性狀的個體Ca2＋處理細胞↓感受態(tài)細胞↓基因表達載體與感受態(tài)細胞混合↓感受態(tài)細胞吸收DNA分子（二）將目的基因導入受體細胞——方法比較在棉花細胞中，重組表達載體是否導入成功？是否可以穩(wěn)定維持并表達出Bt蛋白？表達出的Bt蛋白是否具有殺蟲的功效？檢測目的基因進入受體細胞后，是否穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性。類型檢測內容方法分子水平的檢測個體生物學水平的鑒定DNA水平：受體細胞的染色體DNA上是否插入了目的基因RNA水平：目的基因是否轉錄出了mRNAPCR或DNA分子雜交技術蛋白質水平：目的基因是否翻譯成蛋白質抗原-抗體雜交技術個體是否具有相應性狀抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等PCR或分子雜交技術等四、目的基因的檢測與鑒定1，檢測目的：2.檢測內容及方法

檢測內容：目的基因是否插入到受體細胞的染色體DNA上（存在）如：檢測棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因或檢測Bt基因檢測方法：方法①：PCR等技術提取DNAPCR操作是否擴增出目的基因M：marker；1-陽性質粒；2：原始品系；3-9轉Bt品系；電泳操作害蟲死亡抗蟲棉PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結果（1）分子水平檢測

檢測方法：方法②：DNA分子雜交技術(DNA單鏈——DNA單鏈)檢測工具：基因探針帶有標記（放射性同位素標記、熒光分子標記等）的目的基因片段——單鏈檢測原理：將轉基因生物的基因組DNA提取出來，用標記了的目的基因作為基因探針，使探針與基因組DNA雜交，如果顯示出雜交帶，就表明目

的基因已插入染色體DNA中。（1）分子水平檢測（1）分子水平檢測如：檢測Bt基因是否轉錄出mRNABtM3C0T-9T-2T-51T-5T-23T-11T-20T-21T-34T-1010個PCR陽性棉花植株中，有四株Bt基因發(fā)生轉錄提取mRNAPCR操作是否擴增出目的基因對擴增產物進行檢測害蟲死亡抗蟲棉逆轉錄產生DNA檢測內容：目的基因是否轉錄檢測方法：方法①：PCR等技術（1）分子水平檢測檢測內容：目的基因是否轉錄檢測方法：方法②：分子雜交技術（DNA—RNA）——分子雜交檢測原理：用標記的目的基因作為基因探針，與轉基因生物中提取

mRNA雜交，若出現(xiàn)雜交帶，表明目的基因轉錄出mRNA。PCR等技術在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標記，以此作為探針，使探針與基因組DNA或mRNA雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則目的基因插入成功或轉錄出相應的mRNA。方法：DNA分子雜交分子雜交（1）分子水平檢測蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內抗體標記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交檢測內容：目的基因是否翻譯檢測方法：抗原—抗體雜交檢測檢測原理：抗原與抗體特異性結合抗原—抗體雜交技術從轉基因棉花中提取蛋白質，用相應的抗體進行抗原-抗體雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則目的基因成功翻譯出蛋白質。過程2.個體水平的檢測檢測內容：轉基因生物是否具有相應性狀檢測方法：轉Bt基因非轉基因沒有抗蟲基因的棉植株有抗蟲基因的棉植株接種棉鈴蟲蟲沒有死蟲被殺死沒有表達目的基因表達抗蟲或抗病接種實驗基因工程產品與天然產品的功能進行活性比較如：采摘抗蟲棉的葉子飼喂棉鈴蟲，觀察抗蟲效果。轉基因生物鑒定方法成功標志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產物的轉基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）接種實驗未染病鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細胞產物與天然產品進行功能活性比較功能、活性正常