蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第1頁一、蛋白質(zhì)酸堿性質(zhì)

二、蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)沉淀

三、蛋白質(zhì)分離純化普通標(biāo)準(zhǔn)

四、蛋白質(zhì)分離純化方法

五、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量測定

六、蛋白質(zhì)含量測定與純度判定教學(xué)內(nèi)容蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第2頁一、蛋白質(zhì)酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第3頁對某種蛋白質(zhì)來說，在某一pH，它所帶正電荷與負(fù)電荷恰好相等，也即凈電荷為零，這一pH，蛋白質(zhì)等電點。蛋白質(zhì)等電點有中性鹽時，蛋白質(zhì)等電點在一定程度上決定于介質(zhì)中離子組成。如Ca2+、Mg2+、Cl-、等可與蛋白質(zhì)一些可解離基團(tuán)結(jié)合，影響等電點。無鹽類干擾時，蛋白質(zhì)分子本身質(zhì)子供體基團(tuán)解離出來質(zhì)子數(shù)與它質(zhì)子受體基團(tuán)結(jié)合質(zhì)子數(shù)相等時溶液pH稱為等離子點(isoionicpoint,或稱等離點)。等離子點是每種蛋白質(zhì)一個特征常數(shù)。蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第4頁一、蛋白質(zhì)酸堿性質(zhì)

二、蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)沉淀

三、蛋白質(zhì)分離純化普通標(biāo)準(zhǔn)

四、蛋白質(zhì)分離純化方法

五、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量測定

六、蛋白質(zhì)含量測定與純度判定教學(xué)內(nèi)容蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第5頁二、蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)沉淀(一)蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)(二)蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第6頁分散相質(zhì)點在1～l00nm范圍內(nèi),在動力學(xué)上是穩(wěn)定,介質(zhì)分子對這種質(zhì)點碰撞協(xié)力不等于零,使它能在介質(zhì)中作不停布朗運(yùn)動;分散相質(zhì)點帶有同種符號凈電荷,相互排斥,不易聚集成大顆粒而沉淀;分散相質(zhì)點能與溶劑形成溶劑化層,比如與水形成水化層,質(zhì)點有了水化層,相互間不易靠攏而聚集.

(一)蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)分散相質(zhì)點在膠體系統(tǒng)中保持穩(wěn)定3個條件:蛋白質(zhì)溶液,穩(wěn)定親水膠體:親水基團(tuán)與水發(fā)生水化作用；某一pH下相同電荷。也有丁大爾現(xiàn)象、布朗運(yùn)動以及不能透過半透膜性質(zhì)蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第7頁蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定性與質(zhì)點大小、電荷和水化作用相關(guān),影響這些條件原因都會影響蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定性：加人脫水劑以除去它水化層；改變?nèi)芤簆H到達(dá)蛋白質(zhì)等電點使質(zhì)點凈電荷為零，蛋白質(zhì)分子則聚集成大顆粒而沉淀。(二)蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第8頁沉淀蛋白質(zhì)方法有以下幾個:鹽析法：中性鹽(硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等)，脫去水化層而聚集沉淀，蛋白質(zhì)不變性。有機(jī)溶劑沉淀法：脫去水化層、降低介電常數(shù)增加異性電荷間相互作用，蛋白質(zhì)變性。低溫操作，且盡可能縮短處理時間則可使變性速度減慢。重金屬鹽沉淀法：帶負(fù)電荷時易與重金屬離子結(jié)合成不溶性鹽而沉淀?？煽诜罅颗Ｄ袒蚨?jié){等可解重金屬鹽中毒。生物堿試劑和一些酸沉淀法：蛋白質(zhì)帶正電適當(dāng)與之結(jié)合沉淀。加熱變性沉淀法：加熱變性而凝固。少許鹽類促進(jìn)蛋白質(zhì)加熱凝固蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第9頁一、蛋白質(zhì)酸堿性質(zhì)

二、蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)沉淀

三、蛋白質(zhì)分離純化普通標(biāo)準(zhǔn)

四、蛋白質(zhì)分離純化方法

五、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量測定

六、蛋白質(zhì)含量測定與純度判定教學(xué)內(nèi)容蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第10頁三、蛋白質(zhì)分離純化普通標(biāo)準(zhǔn)(1)前處理:(2)粗分級分離:

(3)細(xì)分級分離:蛋白質(zhì)純化測總目標(biāo)：增加純度或比活力蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第11頁動物材料剔除結(jié)締組織、脂肪組織;種子材料應(yīng)先去殼和種皮以免受單寧等物質(zhì)污染,油料種子脫脂.選擇適當(dāng)方法,破碎組織或細(xì)胞：動物組織(電動搗碎機(jī)或勻漿器或超聲);植物組織(英砂或玻璃粉和適當(dāng)緩沖液研磨或用纖維素酶);細(xì)菌細(xì)胞(超聲,與砂研磨或溶菌酶).選擇適當(dāng)緩沖液把所要蛋白質(zhì)提取出來.假如蛋白質(zhì)是與細(xì)胞膜或膜質(zhì)細(xì)胞器結(jié)合,用超聲波或去污劑使膜結(jié)構(gòu)解聚,用適當(dāng)介質(zhì)提取。(1)前處理:蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第12頁(2)粗分級分離:

常見鹽析、等電點沉淀和有機(jī)溶劑分級分離等方法，有時可用超出濾或凝膠過濾等方法。(3)細(xì)分級分離:

各種層析、電泳巧妙配合,后期可用結(jié)晶法。蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第13頁一、蛋白質(zhì)酸堿性質(zhì)

二、蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)沉淀

三、蛋白質(zhì)分離純化普通標(biāo)準(zhǔn)

四、蛋白質(zhì)分離純化方法

五、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量測定

六、蛋白質(zhì)含量測定與純度判定教學(xué)內(nèi)容蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第14頁四、蛋白質(zhì)分離純化方法依據(jù)分子大小不一樣利用溶解度差異依據(jù)電荷不一樣利用選擇性吸附利用對配體特異生物學(xué)親和力純化方法(一)透析和超出濾(二)凝膠過濾(三)鹽溶和鹽析(四)有機(jī)溶劑分級分離法(五)凝膠電泳和等電聚焦(六)離子交換層析(七)親和層析(八)高效液相層析蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第15頁常見凝膠：交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖（sepharose或Bio-GelA）；凝膠網(wǎng)孔大小一定，只允許對應(yīng)大小分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，大分子則被排阻在外，即分級分離范圍或排阻極限;大分子從顆粒間隙流下來，洗脫液體積小。小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)洗脫歷程長，后洗脫下來，洗脫體積大；用洗脫體積同標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)百分比關(guān)系測定蛋白質(zhì)分子量；(二)凝膠過濾凝膠過濾層析、大小排阻層析或凝膠滲透層析蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第16頁Vt:柱床總體積，常稱柱床體積；V0：為孔隙體積或外水體積，測出不被凝膠滯留藍(lán)色葡聚糖-洗脫體積即為V0;Vi：內(nèi)水體積，凝膠珠內(nèi)部水相體積；Vm：為凝膠基質(zhì)體積；Vt=V0+Vi+Vm

Ve某一待分離物質(zhì)組分洗脫體積,自加樣品開始到該組分洗脫峰(峰頂)出現(xiàn)時所流出體積；各組分流出次序，可用分配系數(shù)Kd來量度：Kd=(Ve－Vo)/Vi。幾個要說明問題V0Vt－V0VtKd：組分分子大小函數(shù)；完全排阻大分子：Ve=V0，Kd=0;完全進(jìn)入凝膠珠小分子：Ve=V0+Vi，Kd=1;其它：Kd在0和1之間;Kd大于1：凝膠對組分有吸附蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第17頁幾個要說明問題V0Vt－V0VtKd：組分分子大小函數(shù)；完全排阻大分子：Ve=V0，Kd=0;完全進(jìn)入凝膠珠小分子：Ve=V0+Vi，Kd=1;其它：Kd在0和1之間;Kd大于1：凝膠對組分有吸附測得幾個標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)洗脫體積Ve以相對分子質(zhì)量對數(shù)(logM)對Ve作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，再測出未知樣品洗脫體積[Ve]，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出樣品蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量.蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第18頁(三)鹽溶和鹽析鹽溶：普通在低鹽濃度情況下，蛋白質(zhì)溶解度隨鹽濃度升高而增加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶；鹽析:當(dāng)鹽濃度升高到一定程度后，蛋白質(zhì)溶解度又伴隨鹽濃度升高而降低，結(jié)果使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析;同一濃度鹽溶液中，不一樣蛋白質(zhì)溶解度不一樣，借此可到達(dá)彼此分離目標(biāo)。鹽溶原理:蛋白質(zhì)吸附某種鹽離子后彼此排斥。鹽析原理：鹽濃度增高到一定數(shù)值后，水活性降低，水化膜相繼被破壞，最終引發(fā)蛋白質(zhì)分子間相互聚積并從溶液中析出蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第19頁(四)有機(jī)溶劑分級分離法降低水溶液介電常數(shù)，破壞大分子周圍水膜，使溶質(zhì)溶解度降低;利用不一樣蛋白質(zhì)在不一樣濃度有機(jī)溶劑中溶解度不一樣而使蛋白質(zhì)分離方法，有機(jī)溶劑沉淀法。經(jīng)常使用有機(jī)溶劑是乙醇和丙酮；易使蛋白質(zhì)和酶變性，操作必須在低溫條件下進(jìn)行.蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第20頁電泳：在外電場作用下,帶電顆粒,比如帶電蛋白質(zhì)分子,將向著與其電荷符號相反電極移動,這種現(xiàn)象稱為電泳(electrophoresis)或離子泳(ionophoresis)。(五)凝膠電泳和等電聚焦SampleWellDirectionofmigration蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第21頁帶電顆粒在電場中泳動時,受到兩種方向相反作用力:q：顆粒所帶電量；E：電場強(qiáng)度＝U/d；U：兩電極間電勢差(V)；d

：兩電極間距離(cm)；f摩擦系數(shù)；v：泳動速度(cm/s)；當(dāng)顆粒以恒穩(wěn)速度移動時,則F－Ff=0在一定介質(zhì)中對某一蛋白質(zhì)來說，q/f是一定值，因而v/E也是定值，它被稱為電泳遷移率或泳動度:μ=v/E電泳原理：蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第22頁AstablepHgradientisestablishedinthegelafterapplicationofanelectricfield.Proteinsolutionisaddedandelectricfieldisreapplied.Afterstaining,proteinsareshowntobedistributedalongpHgradientaccordingtotheirpIvalues.等電聚焦(IEF)pH梯度制作：利用兩性電解質(zhì)(商品名:Ampholine)，多氨基多羧酸系列兩性化合物同系物復(fù)雜混合物，它們有相近但不一樣pH和pI值，在電場作用下，自然形成pH梯度.蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第23頁FirstdimensionIsoelectricfocusingIsoelectricfocusinggelisplacedonSDSpolyacrylamidegel.SeconddimensionSDSpolyacrylamidegelelectrophoresis雙向電泳(Two-dimensionalelectrophoresis)蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第24頁利用蛋白質(zhì)分子對其配體(或稱為配基)分子特有識別能力建立起來純化方法.將特異配體共價地連接到像瓊脂糖凝膠這類載體表面官能團(tuán)(如-OH)上，配體和多糖載體之間插人一段長度適當(dāng)連接臂(如ε-氨基己酸)，使配體與凝膠之間保持足夠距離，不致因載體表面位阻妨礙待分離分子與配體結(jié)合.這類載體在其它性能方面允許蛋白質(zhì)能自由經(jīng)過.(七)親和層析(affinitychromatography)洗滌除去瓊脂糖凝膠珠配體分子雜蛋白分子(不被吸附)連接臂被吸附蛋白質(zhì)分子親和洗脫親和層析原理蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第25頁是離子交換層析、凝膠過濾、吸附層析和分配層析等技術(shù)新發(fā)展.對柱層析來說,固相載體顆粒愈小、分辨率愈高,不過洗脫液流速也愈慢。采取高壓和機(jī)械性能強(qiáng)、化學(xué)性能穩(wěn)定、顆粒度細(xì)小而均勻載體和其它設(shè)備自動完成份離純化.HPLC可用于蛋白質(zhì)、氨基酸及其它生物分子分析和制備。(八)高效液相層析(highperformanceliquidchromatography,HPLC)溶劑過濾器溶劑儲存器泵檢測儀統(tǒng)計儀搜集器恒溫裝置層析柱進(jìn)樣室蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第26頁一、蛋白質(zhì)酸堿性質(zhì)

二、蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)沉淀

三、蛋白質(zhì)分離純化普通標(biāo)準(zhǔn)

四、蛋白質(zhì)分離純化方法

五、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量測定

六、蛋白質(zhì)含量測定與純度判定教學(xué)內(nèi)容蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第27頁五、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量測定(一)凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量

(二)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子質(zhì)量

(三)沉降速度法測定相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第28頁蛋白質(zhì)過凝膠柱速度直接取決于它斯托克半徑。如某種蛋白質(zhì)與一理想非水化球體具相同過柱速度即相同洗脫體積，則這種蛋白質(zhì)具與此球體相同半徑，稱斯托克半徑。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(已知Mr和斯托克半徑)和待測蛋白質(zhì)須有相同分子形狀(靠近球體),不然不能得到比較準(zhǔn)確Mr.普通用交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）,

SephadexG-75(分級分離Mr范圍3000～80000)或G-100(M,范圍4000～150000).(一)凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量1966,Andrews提出個經(jīng)驗公式:蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第29頁（二）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子質(zhì)量SDS破壞蛋白氫鍵和疏水相互作用,巰基乙醇能打開二硫鍵,SDS和巰基乙醇存在下,單體蛋白或亞基(寡聚蛋白質(zhì)解離成亞基)處展開狀態(tài).SDS烴鏈與蛋白質(zhì)側(cè)鏈經(jīng)過疏水相互作用形成復(fù)合體.在一定條件下,SDS與大多數(shù)蛋白質(zhì)結(jié)合比:1.4gSDS/1g蛋白質(zhì),相當(dāng)于每兩分子氨基酸殘基結(jié)合一分子SDS.SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后:第一,SDS陰離子使多肽鏈覆蓋上相同密度負(fù)電荷,遠(yuǎn)超出蛋白質(zhì)原有電荷量,掩蓋了不一樣蛋白質(zhì)間原有電荷差異;第二,改變蛋白質(zhì)天然構(gòu)象,使大多數(shù)蛋白質(zhì)采取類似形狀.所以在SDS存在下電泳幾乎是完全基于相對分子質(zhì)量分離蛋白質(zhì).蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第30頁（二）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子質(zhì)量SDS，遷移率不受蛋白質(zhì)原有電荷、分子形狀等原因影響,但凝膠具分子篩效應(yīng).所以，遷移率與相對分子質(zhì)量(Mr)之關(guān)系:常數(shù)相對遷移率：樣品遷移距離/前沿(染料)蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第31頁（三）沉降速度法測定相對分子質(zhì)量直接測定蛋白質(zhì)Mr方法：滲透壓法、光散射法、沉降速度法、沉降平衡法和黏度法等，沉降速度法是經(jīng)典常見方法.超速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速:60000～80000r/min,相當(dāng)于位于距轉(zhuǎn)軸中心10cm處、單位質(zhì)量(1g)分子所受到離心力(離心場強(qiáng)度)為400000×g～700000×g.沉降速度與蛋白質(zhì)分子大小、密度和形狀相關(guān),且與溶劑密度和黏度相關(guān).單位離心場強(qiáng)度沉降速度稱為沉降系數(shù),用s(小寫)表示:從軸心到沉降界面徑向距離(cm)時間離心角速度(rad/s):轉(zhuǎn)速(r/min)×2π/60蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用第32頁（三）沉降速度法測定相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)、核酸、核糖體和病毒等沉降系數(shù)：1×10-13~200×10-13秒范圍.把l0-13s作為一個單位,斯維得貝格單位(Svedbergunit)或稱沉降系數(shù)單位,用S(大寫)表示.比如人血紅蛋白:4.46S,即4.46×10-13s。蛋白質(zhì)沉降系數(shù)(s)與相對分子質(zhì)量(Mr)關(guān)系可用斯維得貝格方程表示:摩爾氣體常數(shù)(8.314J·K-1·mol-1);熱力學(xué)溫度(K),舊稱絕對溫度蛋白質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)(cm2/s),數(shù)值上等于當(dāng)濃度梯度為1個單位時在1s內(nèi)經(jīng)過