2024/4/16第八章

分子發(fā)光分析法8.3.1

基本原理

8.3.2

化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型8.3.3化學(xué)發(fā)光分析裝置與技術(shù)8.3.4

化學(xué)發(fā)光分析法的應(yīng)用第三節(jié)

化學(xué)發(fā)光分析法Molecular

luminescenceanalysisChemiluminescenceanalysis2024/4/168.3.1基本原理1.化學(xué)發(fā)光反應(yīng)

在化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中，某些化合物接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)，發(fā)射出一定波長(zhǎng)的光。

A+B=C+D*；D*→D+hν(1)能夠發(fā)光的化合物多為有機(jī)化合物(芳香族)(2)多為氧化還原反應(yīng)，激發(fā)能與反應(yīng)能相當(dāng)

E=170～300kJ/mol，位于可見(jiàn)光區(qū)。(3)發(fā)光持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行

化學(xué)發(fā)光反應(yīng)存在于生物體中，稱生物發(fā)光(bioluminescence)。2024/4/162.化學(xué)發(fā)光效率化學(xué)效率：發(fā)光效率：時(shí)刻t的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(單位時(shí)間發(fā)射的光量子數(shù))dc/dt

分析物參加反應(yīng)的速率。2024/4/163.化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與化學(xué)發(fā)光分析的依據(jù)在化學(xué)發(fā)光分析中，被分析物相對(duì)于發(fā)光試劑小得多，對(duì)于一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)：

dc/dt

=kc；

k：反應(yīng)速率常數(shù)。定量依據(jù)：（1）在一定條件下，峰值光強(qiáng)度與被測(cè)物濃度成線性；（2）曲線下面積為發(fā)光總強(qiáng)度(S)，其與被測(cè)物濃度成線性：2024/4/164.抑制化學(xué)發(fā)光分析

抑制化學(xué)發(fā)光分析是利用某物質(zhì)對(duì)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的抑制作用進(jìn)行定量分析的方法。如在魯米諾-KMnO4發(fā)光體系中，Cu2+對(duì)該發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，使發(fā)光強(qiáng)度顯著降低，發(fā)光強(qiáng)度的降低量與Cu2+的濃度有關(guān)。該方法已用于水中微量銅的定量測(cè)定。2024/4/168.3.2化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型1.氣相化學(xué)發(fā)光反應(yīng)(1)一氧化氮與O3的發(fā)光反應(yīng)

NO+O3

→NO2*；NO2*→NO2+hν

發(fā)射的光譜范圍：600～875nm，靈敏度1ng·mL-1。(2)氧原子與SO2、NO、CO的發(fā)光反應(yīng)

O3

→O2+O（1000C石英管中進(jìn)行）

SO2

+O+O→SO2*+O2

SO2*→SO2+hν

最大發(fā)射波長(zhǎng)：200nm；靈敏度1ng·mL-1。

2024/4/16

O3

→O2+O（1000C石英管中進(jìn)行）

NO+O→NO2*；NO2*→NO2+hν

發(fā)射光譜范圍：400～1400nm；靈敏度1ng·mL-1。氧原子與CO的發(fā)光反應(yīng)：

CO+O→CO2*

CO2*→CO2+h

發(fā)射光譜范圍：300～500nm，靈敏度1ng·mL-1。氧原子與NO的發(fā)光反應(yīng)：2024/4/16(3)乙烯與O3的發(fā)光反應(yīng)

乙烯與O3反應(yīng)，生成激發(fā)態(tài)乙醛：

CH2O*→CH2O+h

最大發(fā)射波長(zhǎng)：435nm；對(duì)O3的特效反應(yīng)；線性響應(yīng)范圍1ng·mL-1

～1g·mL-1。2024/4/162.火焰中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)

在富氫火焰中，也存在著很強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；（1）一氧化氮

NO+H→HNO*

HNO

*→HNO+h

發(fā)射光譜范圍：660～770nm。

最大發(fā)射波長(zhǎng)：690nm。

在富氫火焰中：

NO2+2H→NO+H2O

該反應(yīng)十分迅速。2024/4/16（2）硫化物

揮發(fā)性硫化物SO2

，H2S

，CH3SH，CH3SCH3

等在富氫火焰中燃燒，產(chǎn)生很強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光（藍(lán)色）：

SO2

+2H2→S+2H2OS+S→2S2

*

S2*→S2+hν發(fā)射光譜范圍：350～460nm。最大發(fā)射波長(zhǎng)：394nm；靈敏度：0.2ng·mL-1。

發(fā)射光強(qiáng)度與硫化物濃度的平方成正比。2024/4/163.液相中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)

機(jī)理研究較多，應(yīng)用最多；可測(cè)痕量的H2O2

，Cu，Mn，Co，V，F(xiàn)e，Cr，Ce，Hg，Th等。魯米諾（3-氨基苯二甲酰肼）在堿性溶液中與雙氧水的反應(yīng)過(guò)程：化學(xué)發(fā)光反應(yīng)效率：0.15～0.05；反應(yīng)速率慢，某些金屬離子可催化反應(yīng)；利用這一現(xiàn)象可測(cè)定這些金屬離子。2024/4/16化學(xué)發(fā)光試劑2024/4/16

草酸二酯(能量提供體)+高濃度雙氧水+稠環(huán)芳烴(能量接受體)+金屬離子+溶劑組成的反應(yīng)體系，可發(fā)出很強(qiáng)的可見(jiàn)光，發(fā)光效率高，使用不同的稠環(huán)芳烴，發(fā)射出不同顏色的光(冷光源)。2024/4/164.生物發(fā)光反應(yīng)

生物發(fā)光是涉及生物或酶反應(yīng)的一類化學(xué)發(fā)光(生物體內(nèi)的發(fā)光)，有很高的發(fā)光效率(>50%)。著名的螢火蟲(chóng)發(fā)光反應(yīng)的過(guò)程為式中，LH2

為熒光素，E是熒光素酶，PPi是焦磷酸鹽，ATP是三磷酸腺苷，AMP是單磷酸腺苷。

利用上述反應(yīng)可測(cè)定ATP。最大發(fā)射波長(zhǎng)562nm。對(duì)10

g試樣，檢出限可低達(dá)10-14

g。

AMP·LH2

·E+O2

[氧化熒光素]*+AMP+CO2

+

H2O[氧化熒光素]*氧化熒光素+h

2024/4/16生物發(fā)光分析

許多生化反應(yīng)通常都涉及H2O2的生成或有H2O2參與反應(yīng)，可利用魯米諾發(fā)光體系來(lái)測(cè)定許多生化試劑或組分。例：2024/4/162024/4/168.3.3化學(xué)發(fā)光分析發(fā)的裝置與技術(shù)

裝置流程：發(fā)光反應(yīng)室光檢測(cè)器信號(hào)放大器顯示與記錄

發(fā)光反應(yīng)可采用靜態(tài)或流動(dòng)注射的方式進(jìn)行：

靜態(tài)方式：用注射器分別將試劑加入到反應(yīng)器中混合，測(cè)最大光強(qiáng)度或總發(fā)光量；試樣量小，重復(fù)性差。

流動(dòng)注射方式：用蠕動(dòng)泵分別將試劑連續(xù)送入混合器，定時(shí)通過(guò)測(cè)量室，連續(xù)發(fā)光，測(cè)定光強(qiáng)度；試樣量大。2024/4/168.3.4化學(xué)發(fā)光分析的應(yīng)用1.發(fā)光反應(yīng)速率慢，某些金屬離子可催化反應(yīng)；

利用這一現(xiàn)象可間接測(cè)定這些金屬離子?？蓽y(cè)痕量的Cu2+

，Mn2+，Co2+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+，Ni2+，Ag+，Hg2+等。2.可檢測(cè)低至10-9mol·L-1

的H2O2。3.間接測(cè)定某些生物試樣：

氨基酸+O2

酮酸+NH3

+H2O2

葡萄糖+O2

+H2O

葡萄糖酸+H2O2通過(guò)測(cè)定生成的H2O2，確定氨基酸、葡萄糖含量。2024/4/16生物發(fā)光分析應(yīng)用1在pH7～8；熒光素酶(E)和Mg2+的存在下，熒光素(LH2)與三磷酸腺苷(ATP)的反應(yīng)，生成磷酸腺苷(AMP)熒光素和熒光素酸的復(fù)合物和鎂的焦磷酸鹽(PPi)：ATP+LH2

+E+Mg2+

AMP·LH2·E+Mgppi

+2H+pH7-8復(fù)合物與氧反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光：

AMP·LH2·E+O2[氧化熒光素]*+AMP+CO2+

H2O[氧化熒光素]*氧化熒光素+hν最大發(fā)射波長(zhǎng)562nm。2024/4/16生物發(fā)光分析應(yīng)用2

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在細(xì)菌中的黃素酶作用下，在氧化型黃素單核苷酸(FMA)存在下，發(fā)生發(fā)光反應(yīng)：NADH

+FMA

+H+

NAD+

+FMNH2NADH脫氫酶FMNH2+RCHO

+O2

FMN+RCOOH+H2O+hν黃素酶最大發(fā)射波長(zhǎng)495nm。2024/4/16化學(xué)發(fā)光分析法的特點(diǎn)1.靈敏度極高例：熒光素酶和三磷酸腺苷(ATP)的化學(xué)發(fā)光分析，可測(cè)定210-17mol·L-1ATP，可檢出一個(gè)細(xì)菌中的ATP含量。2.儀器設(shè)備簡(jiǎn)單