PAGEPAGE5快速序列測定：雙脫氧末端終止法06級生科A班蘇狄064120202摘要：核酸的序列分析，即核酸一級結(jié)構(gòu)的測定，是現(xiàn)代分子生物學(xué)中一項重要技術(shù)。目前應(yīng)用的兩種快速序列測定技術(shù)是Sanger等（1977年）提出的雙脫氧鏈終止法及Maxam和Gilbert（1977年）提出的化學(xué)降解法，其中雙脫氧鏈終止法是目前應(yīng)用最多，最好的技術(shù)。關(guān)鍵詞：快速序列測定、雙脫氧末端終止法目前應(yīng)用的兩種快速序列測定技術(shù)是Sanger等（1977）提出的酶法（雙脫氧鏈終止法）和Maxam（1977）提出的化學(xué)降解法。雖然其原理大相徑庭，但這兩種方法都同樣生成相互獨立的若干組帶放射性標(biāo)記的寡核苷酸，每組核苷酸都有共同的起點，卻隨機終止于一種（或多種）特定的殘基，形成一系列以某一特定核苷酸為末端的長度各不相同的寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長度由這個特定堿基在待測DNA片段上的位置所決定。然后通過高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)放射自顯影后，從放射自顯影膠片上直接讀出待測DNA上的核苷酸順序。高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳亦是DNA序列測定技術(shù)的重要基礎(chǔ)，可分離僅差一個核苷酸、長度達(dá)300~500個核苷酸的單鏈DNA分子。DNA序列測定的簡便方法為詳細(xì)分析大量基因組的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)，時至今日，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)氨基酸序列都是根據(jù)基因或cDNA的核苷酸序列推導(dǎo)出來的。除傳統(tǒng)的雙脫氧鏈終止法和化學(xué)降解法外，自動化測序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今DNA序列分析的主流。此外，新的測序方法亦在不斷出現(xiàn)，如上世紀(jì)90年代提出的雜交測序法（sequencingbyhybridization，SBH）等。雙脫氧末端終止法測序一、原理雙脫氧末端終止法是Sanger等在加減法測序的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的。其原理是：利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ，以單鏈DNA為模板，并以與模板事先結(jié)合的寡聚核苷酸為引物，根據(jù)堿基配對原則將脫氧核苷三磷酸（dNTP）底物的5′-磷酸基團與引物的3′-OH末端生成3′,5′-磷酸二酯鍵。通過這種磷酸二酯鍵的不斷形成，新的互補DNA得以從5′→3′延伸。Sanger引入了雙脫氧核苷三磷酸（ddTNP）作為鏈終止劑。ddTNP比普通的dNTP在3′位置缺少一個羥基（2′,3′-ddNTP）（圖7-4-1），可以通過其5′三磷酸基團摻入到正在增長的DNA鏈中，但由于缺少3′-OH，不能同后續(xù)的dNTP形成3′,5′-磷酸二酯鍵。因此，正在增長的DNA鏈不再延伸，使這條鏈的延伸終止于這個異常的核苷酸處。這樣，在4組獨立的酶反應(yīng)體系中，在4種dNTP混合底物中分別加入4種ddNTP中的一種后，鏈的持續(xù)延伸將與隨機發(fā)生卻十分特異的鏈終止展開競爭，在摻入ddTNP的位置鏈延伸終止。結(jié)果產(chǎn)生4組分別終止于模板鏈的每一個A、每一個C、每個G和每一個T位置上的一系列長度的核苷酸鏈。通過高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，從放射自顯影膠片上直接讀出DNA上的核苷酸順序。雙脫氧鏈終止法測序原理如圖7-4-2所示。圖7-4-1脫氧核苷三磷酸和雙脫氧核苷三磷酸分子結(jié)構(gòu)55′GAGTCACACTTGAC——3′待測單鏈DNA33′CTG—5′引物、Klenow酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和少量α-32P-dATP濃度的dNTP的較低溫度，以便將合成反應(yīng)限制在適度之下并確保放射性標(biāo)記dNTP和較低溫度，以便將合成反應(yīng)限制在適度之下并確保放射性標(biāo)記dNTP的有效摻入，這步反應(yīng)的產(chǎn)物是僅僅延伸了20-30堿基的引物。再將第一步反應(yīng)等分于4組1套的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)系統(tǒng)中，每組反應(yīng)中都含有高濃度的dNTP和一種ddNTP。這樣聚合反應(yīng)就得以繼續(xù)，直至造成鏈終止的核革酸摻入正在增長的鏈中。（4）TaqDNA聚合酶：適用于測定在37℃形成大段穩(wěn)定十級結(jié)構(gòu)的單鏈DNA模板序列。這是因為TaqDNA聚合酶在70-75℃活性最高，這一溫度下即使GC豐富的模板也無法形成二級結(jié)構(gòu)。按照1nnis等（1988）介紹的方法使用TaqDNA聚合酶進(jìn)行測序，在放射自顯影片上得到的測序梯連續(xù)數(shù)百個堿基條帶始終清晰如一，表明這種酶的持續(xù)合成能力甚佳。模板鏈的每一個A、每一個G或每一個T的位置上。模板鏈的每一個A、每一個G或每一個T的位置上。循環(huán)測序法利用了熱循環(huán)儀的自動循環(huán)的高效能力。循環(huán)測序反應(yīng)與普通PCR反應(yīng)有所不同。只需一條引物，通過單引物進(jìn)行熱循環(huán)，模板DNA以線性方式被擴增，而不是標(biāo)準(zhǔn)PCR的指數(shù)方式擴增；反應(yīng)底物除四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）外，還加入了雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），進(jìn)行擴增時，鏈的延伸終止于摻入ddNTP的位置，產(chǎn)生分別終止于不同核苷酸的一系列不同長度的擴增片段。（四）放射性標(biāo)記的dNTP傳統(tǒng)的DNA測序方法都采用α-32P-dNTP作為放射性標(biāo)記物，但由于32P發(fā)射的高能β射線，常會引起二個問題。首先是導(dǎo)致放射自顯影圖譜條帶擴散、分辨率低，限制了識讀序列的數(shù)量和準(zhǔn)確性。其次是32P衰變會導(dǎo)致DNA樣品分解，通常都應(yīng)在測序反應(yīng)后24h內(nèi)進(jìn)行電泳，否則無法獲得好的結(jié)果。近年來α-35S-dNTP被廣泛采用，是由于35S產(chǎn)生較弱的β射線，克服了32P的二大缺點。放射自顯影圖譜具有較高的分辨率和較低的本底，測序反應(yīng)產(chǎn)物可在-20℃保存一周，而分辨率并不下降。（五）dNTP類似物二重對稱的DNA區(qū)段（特別是GC含量高者）可以形成鏈內(nèi)二級過程中不能充分變性。因此將引起不規(guī)則遷移，使鄰近的DNA條帶壓縮在一起，以致難以讀出序列。這種壓縮現(xiàn)象歸因于DNA二級結(jié)構(gòu)的存在，而且不可能通過改變測序反應(yīng)中出序列。這種壓縮現(xiàn)象歸因于DNA二級結(jié)構(gòu)地存在，而且不可能通過改變測序反應(yīng)中所用DNA聚合酶的種類而得到減輕。但是凝膠中的壓縮區(qū)段往往可以通過采用諸如dITP（2'－脫氧次黃苷15'－三磷酸）或7－脫氮－dGTP（7－脫氮－2'－脫氧鳥苷－5'－三磷酸）等核苷酸類似物進(jìn)行分辨。這些類似物與普通堿基的配對能力較弱，而且是測序酶和TaqDNA聚合酶等DNA聚合酶的合適底物（Gough和Murray，1983;Mixusawa等，1986;Innis等，1988）。但對某些壓縮條帶，7－脫氮－dGTP無濟于事；同樣，dITP也無補于另一壓縮條帶（尤其是得于GC豐富區(qū)的縮條帶）的分辨。如果需要采用類似物，首先可試用dOTP，如果壓縮條帶用dITP或7－脫氮－dGTP都無法分辨，則轉(zhuǎn)而測定另一條鏈的DNA序列幾乎總能如愿以償。如上所述，兩種形式的測序酶和TaqDNA聚合酶對核苷酸類似物的耐受性優(yōu)于大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段。此外，制造廠商聲稱在測定含穩(wěn)固二結(jié)構(gòu)的模板序列時，測序酶2.0版要優(yōu)于原來的測序酶。測序酶2.0版持續(xù)合成能力強于測序酶，其作用總是一氣呵成，很少半途而廢，因而消除了“鬼”帶。而且，測序酶2.0版對諸如dITP類核苷酸類惟物的耐受性看來也優(yōu)于原來的測序酶。（六）關(guān)于DNA序列的識讀DNA序列的識讀是一個熟能生巧的過程。注意幾點技巧：①在顯影前后一定要注意標(biāo)明模板名稱、日期和測序人等，并標(biāo)明各套反應(yīng)位置；②識讀時從顯而易見的特征序列開始，如連續(xù)的同聚核苷酸（如TTTTT、AAAAA）或交替出現(xiàn)的嘌呤和嘧啶（如GTGTGTGT），一旦找到這種序列，便可較快地確定目的序列的位置。三、雙脫氧鏈止終法測定戰(zhàn)略由于DNA一般都由幾千個單核苷組成。而目前測定DNA序列的最好方法，一次也只能測約600個核苷酸，因此進(jìn)行DNA順序測定前，需要用不同限制酶pUC1,18pUCl18,pUC19,M13mp18,M13mp19等載體中，分別測定各小片段的順序，由于不同限制酶產(chǎn)生的片段之間有交錯重疊順序，根據(jù)片段間和末端重疊序列，用計算機軟件如MacVectorTM5.0分析DNA，AssemblylignTM排列出各片段的位置，進(jìn)而排出DNA的全序列。四、雙脫氧鏈終止法測定方法以M13噬菌體為載體的雙氧鏈終止法的實施步驟為例：1．M13噬菌體復(fù)制型雙鏈DNA（RFDNA）的制備。為了將待測雙鏈DNA進(jìn)行克隆，必須制備M13mp18或M13mp19復(fù)制型（閉環(huán)雙鏈）DNA，從M9培養(yǎng)基中，挑起單個克隆大腸桿菌，JM101到50ml2×YT培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜。稀釋1ml培養(yǎng)物到50ml2×YT培養(yǎng)中，于37℃振搖6h，轉(zhuǎn)移2ml培養(yǎng)物于微量離心管中，12000g，離心5min細(xì)菌沉淀保留用于分離復(fù)制型RFDNA，上清用于分離噬菌體單鏈DNA。細(xì)菌沉淀用于分離復(fù)制型DNA，可以采用標(biāo)準(zhǔn)的堿解方法或采用天美公司的WizardMiniperpsDNA試劑盒制備。（方法同分離質(zhì)粒DNA方法）。2．重組噬菌體制備采用多克隆位點上的限制性內(nèi)加酶切割待測DNA，并采用相同內(nèi)切酶切割M13噬菌體RFDNA（采用Biol101genecleanⅡ試劑盒分別純化內(nèi)切酶切割后的DNA片段），然后將待測外源DNA片段與M13復(fù)制型載體DNA連接過夜，連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)染JM101感受態(tài)細(xì)菌，將連接物10μl與200μl感受態(tài)細(xì)菌混勻，放置冰上40～50min，再放在42℃水浴2min，然后加入1ml新鮮的靜止相JM101培養(yǎng)物混勻，然后分別以300μl于含有IPIG（200mg/ml）和X-gal200mg/ml的2×YT培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)8h即可出現(xiàn)藍(lán)色和白色噬斑，白色或稱無菌噬斑，即為陽性重組噬菌體。3．單鏈?zhǔn)删wDNA（模板DNA）的制備上述平板的每個白色噬菌斑是由一種重組M13DNA分子轉(zhuǎn)染細(xì)菌后產(chǎn)生的，如果取一個白色噬菌斑進(jìn)行培養(yǎng)便可得到一種單鏈形式的DNA。為此，挑取一個白色噬菌斑轉(zhuǎn)接到一個新鮮制備的OD600=0.1的大腸桿菌JM101培養(yǎng)物中，于37℃振搖5h左右，12000g離心10min，上清轉(zhuǎn)移到另一新微量離心管中用于分離單鏈DNA，按1ml上清液中加入含20%聚乙二醇PEG-6000的2.5mNaCl200μl沉淀噬菌體，再用飽和酚抽提除去噬菌體蛋白，最后用1/10體積的3mNaAc和乙醇沉淀單鏈DNA，濃度調(diào)至0.1～0.5μg/μl，也可采用天美公司的WizardTMM13DNA純化試劑盒分離純化M13單鏈DNA。4．引物制備可以購買通用引物或?qū)嶒炇液铣?5bp～26bp長度的引物，通常以2μg/ml的濃度貯存于-20℃?zhèn)溆谩?．微量滴板進(jìn)行大批量的模板測序時，常在密閉的微量離心管中進(jìn)行與引物的退火反應(yīng)，然后在微量滴板中進(jìn)行鏈延伸-鏈終止反應(yīng)。6．變性聚丙烯酰胺凝膠測序凝膠裝置的大小形狀均不相同，其主要參數(shù)有：①長度通常為40～50cm；②寬度通常為20cm；③厚度通常為0.3～0.4mm；④橫截面形狀為楔形或錐形，即頂部薄，底部厚，或者是將底部凝膠緩沖液的濃度提高；⑤加樣槽；⑥整塊凝膠上的溫度