變異鏈球菌對(duì)牙面的黏附

變異病原體是口腔中的一種重要引起的疾病。致蟲(chóng)性昆蟲(chóng)的主要活性因素是牙齒表面的粘附，糖含量的利用，以及強(qiáng)烈的酸和耐酸性。變異鏈球菌對(duì)牙面的黏附是其定植、致齲的基礎(chǔ)。變異鏈球菌與齲齒有著非常密切的聯(lián)系,明確變異鏈球菌的黏附機(jī)制有助于找到高效、方便、快捷且不良反應(yīng)小的有效藥物,以便齲病的預(yù)防和治療。1黏附反應(yīng)階段黏附是微生物在特定的組織表面定植的首要條件,是微生物與宿主發(fā)生關(guān)系和致病的基礎(chǔ)。其機(jī)制至今尚不完全清楚。主要的學(xué)說(shuō)包括非特異性靜電學(xué)說(shuō)(鈣橋作用)、氫鍵結(jié)合、疏水作用和特異性黏結(jié)素-受體學(xué)說(shuō)。目前,備受關(guān)注的是黏結(jié)素-受體學(xué)說(shuō),即細(xì)菌表面的蛋白樣成分或附屬結(jié)構(gòu)作為黏結(jié)素與組織表面特異性受體結(jié)合完成黏附作用。非特異性黏附,即非蔗糖依賴(lài)性黏附,是細(xì)菌黏附的第1步。當(dāng)菌體與遞質(zhì)表面接觸且間距為10~20nm時(shí),兩者間會(huì)產(chǎn)生排斥力,菌體可利用靜電、氫鍵和疏水作用等物理化學(xué)力來(lái)克服這種排斥力;當(dāng)間距小于10nm時(shí),菌體與遞質(zhì)表面產(chǎn)生較強(qiáng)的引力,從而使菌體有機(jī)會(huì)進(jìn)行特異性黏附。第2階段是變異鏈球菌的葡糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltransferase,GTF)利用蔗糖合成水不溶性葡聚糖來(lái)介導(dǎo)該菌的蔗糖依賴(lài)性黏附和集聚。GTF和葡聚糖可能通過(guò)提供葡聚糖結(jié)合蛋白(glucanbindingprotein,GBP)的結(jié)合位點(diǎn)直接影響變異鏈球菌初始黏附,因此,GTF催化產(chǎn)生的葡聚糖對(duì)初始黏附也有一定的意義。2特異性黏附的調(diào)節(jié)作用口腔細(xì)菌在牙面的選擇性定居,主要是其表面黏結(jié)素與牙面受體分子以立體化學(xué)方式特異性結(jié)合的結(jié)果。黏結(jié)素通常是指細(xì)菌表面某種特定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或糖脂成分,可存在于細(xì)菌細(xì)胞壁、外膜蛋白、鞭毛、菌毛和微毛等結(jié)構(gòu)中,在黏附中充當(dāng)配體角色。受體則是存在于唾液中的一種能夠識(shí)別和選擇性結(jié)合特定配體的大分子物質(zhì),多為糖蛋白,一般包括與配體結(jié)合的區(qū)域和產(chǎn)生效應(yīng)的區(qū)域。黏結(jié)素-受體介導(dǎo)的特異性黏附在細(xì)菌生物膜形成中起著決定性的作用。當(dāng)受體與配體結(jié)合后,受體的構(gòu)象改變并產(chǎn)生活性,啟動(dòng)一系列信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程,最終表現(xiàn)為生物學(xué)效應(yīng)。目前,與黏附有關(guān)的變異鏈球菌表面成分有細(xì)菌表面蛋白,如相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為1.8×105的P1以及Mr為1.1×105、1.2×105、1.3×105的糖蛋白脂磷壁酸等。有報(bào)道稱(chēng):GTF可作為變異鏈球菌的表面成分參與細(xì)菌對(duì)牙面的特異黏附。2.1菌表面蛋白初級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列及濃度變異鏈球菌的表面蛋白抗原P(surfaceproteinantigenP,SpaP)含有1500~1566個(gè)氨基酸殘基,Mr為1.8~2.1×104。變異鏈球菌表面蛋白初級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列分為一個(gè)信號(hào)肽區(qū)(aa1~38),兩個(gè)保守區(qū)[A區(qū)(aa186~464)和P區(qū)(aa840~963)],一個(gè)可變區(qū)[V區(qū)(aa679~823)],一個(gè)壁跨區(qū)(aa1486~1535)和一個(gè)跨膜區(qū)(aa1536~1556)。其中A區(qū)富含丙氨酸,含有82個(gè)氨基酸殘基的重復(fù)序列,呈α-螺旋狀,屬于黏附功能區(qū),與唾液糖蛋白具有高度的親合力;P區(qū)富含脯氨酸,表現(xiàn)為高度疏水性,呈暴露狀,形成伸展?fàn)顟B(tài)的β-片層結(jié)構(gòu),含有豐富的T、B淋巴細(xì)胞黏附表位,其近N端對(duì)人具有很好的免疫原性。2.1.1可溶性糖質(zhì)糖化及其功能表面蛋白P1和P1樣蛋白是變異鏈球菌主要黏結(jié)素之一,也是研究最多也是較肯定的黏結(jié)素。P1和P1樣蛋白存在于細(xì)胞表面的絨毛層中,在血清型c變異鏈球菌中被稱(chēng)為P,其Mr為1.8×105,是主要的細(xì)胞表面抗原,含有兩個(gè)主要的抗原決定簇,可通過(guò)蛋白溶解釋放。P1和或P1樣蛋白參與變異鏈球菌與牙面的非蔗糖依賴(lài)黏附,對(duì)變異鏈球菌在牙面的初始黏附起重要的作用。P1既能以共價(jià)結(jié)合方式存在于細(xì)胞壁,亦可脫離細(xì)胞壁成為游離態(tài)。P1一旦游離,則細(xì)菌的黏附能力下降。低pH值、細(xì)菌的高生長(zhǎng)率、果糖替代葡萄糖作為糖源等均可使P1游離態(tài)增多,結(jié)合態(tài)減少,導(dǎo)致細(xì)菌在獲得性膜上的黏附降低。P1還與變異鏈球菌的疏水性有關(guān),即它可通過(guò)立體化學(xué)識(shí)別牙面受體和疏水反應(yīng)而介導(dǎo)細(xì)菌黏附,表面疏水性越強(qiáng)的細(xì)菌黏附力越強(qiáng)。在人類(lèi)的口腔中,疏水性菌株較親水性菌株容易定居;因此,P1質(zhì)量越高的變異鏈球菌,黏附性越強(qiáng)。Crowley等證實(shí),缺乏表面蛋白抗原Ⅰ、Ⅱ的變異株,對(duì)無(wú)菌鼠模型的致齲性降低。周智等發(fā)現(xiàn),隨殼寡聚糖質(zhì)量濃度的增高,變異鏈球菌的細(xì)胞表面疏水性明顯下降,即殼寡聚糖可能對(duì)變異鏈球菌表面的疏水性分子表達(dá)有抑制作用,從而降低了細(xì)菌對(duì)牙面的黏附性。在就植物提取物對(duì)變異鏈球菌的疏水性和黏附作用的影響所進(jìn)行的研究中,最低抑菌質(zhì)量濃度(minimuminhibitoryconcentration,MIC)之下(7.81~31.25mg·L-1)的意大利永久花提取物降低了細(xì)胞表面的疏水性,對(duì)變異鏈球菌黏附到玻璃表面的抑制率接近90%。1g·L-1的可可塊提取物對(duì)變異鏈球菌的疏水性有明顯的抑制作用,對(duì)變異鏈球菌MT8148R的疏水抑制率達(dá)48%。程睿波等發(fā)現(xiàn),隨著白屈菜紅堿溶液質(zhì)量濃度的升高,變異鏈球菌的表面疏水性逐漸減弱,黏附率也隨之降低。這表明白屈菜紅堿可抑制變異鏈球菌細(xì)胞表面的疏水性和黏附作用,其機(jī)制可能是白屈菜紅堿與表面蛋白間的化學(xué)反應(yīng)引起表面蛋白化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化和數(shù)量的減少,從而降低了變異鏈球菌細(xì)胞表面的疏水性,并導(dǎo)致黏附減少。2.1.2重復(fù)區(qū)的基因免疫A區(qū)多肽的主動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫,都可以激發(fā)宿主針對(duì)變異鏈球菌的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。無(wú)論是針對(duì)完整的SpaP的特異性抗體,還是針對(duì)SpaP的唾液結(jié)合功能區(qū)的抗體,都能明顯阻礙變異鏈球菌在唾液包裹的羥磷灰石上的附著。Katz等發(fā)現(xiàn),SpaP抗體能使嚙齒類(lèi)動(dòng)物、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物和人的齲齒發(fā)生率明顯降低。Takahashi等在使用SpaP的A重復(fù)區(qū)合成肽免疫小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn),變異鏈球菌在牙面的附著明顯受到抑制。Redman等發(fā)現(xiàn),表兄鏈球菌SpaP/A的抗體能保護(hù)大鼠免遭表兄鏈球菌所致的齲侵害。上述研究表明,表面蛋白抗體能有效阻斷細(xì)菌最初在牙面的黏附、聚集和定植。劉天佳等以變異鏈球菌SpaP中的T、B細(xì)胞表位和黏附功能區(qū)相關(guān)肽段的編碼基因?yàn)橥庠椿驑?gòu)建基因防齲疫苗,免疫動(dòng)物檢測(cè)到特異性表面蛋白抗原C(proteinantigenC,PAc)抗體,結(jié)果所構(gòu)建的基因疫苗具有明顯的防齲作用。賈榮等將SpaP/A區(qū)和P區(qū)同時(shí)克隆到載體質(zhì)粒中構(gòu)建防齲基因疫苗,免疫動(dòng)物后可檢測(cè)到特異性抗體。這些研究證實(shí),根據(jù)PAc分子結(jié)構(gòu)構(gòu)建的多種基因工程防齲疫苗,都可激發(fā)宿主產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答,有效抑制變異鏈球菌在口腔中的定居與繁殖,降低齲齒的發(fā)生率。鑒于A區(qū)的分子結(jié)構(gòu)及其重要的生物學(xué)功能,曲云鵬等將SpaP的A區(qū)編碼基因克隆到可用于人體免疫的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1中,經(jīng)轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞COS-7證實(shí),該重組質(zhì)粒能正確表達(dá)目的蛋白。以該重組質(zhì)粒免疫動(dòng)物能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)SpaP/A區(qū)的特異性抗體,阻斷變異鏈球菌對(duì)牙面的蔗糖依賴(lài)和非依賴(lài)黏附,起到防齲的作用。2.2變異鏈球菌發(fā)生蔗糖依賴(lài)在變異鏈球菌眾多的表面抗原中,GTF無(wú)疑是最重要的。GTF能使蔗糖轉(zhuǎn)化為水溶性葡聚糖(watersolubleglucan,WSG)和非水溶性葡聚糖(waterinsolubleglucan,WIG)。WSG又稱(chēng)右旋糖酐,通過(guò)α-1,6糖苷鍵連接葡糖基形成葡聚糖結(jié)構(gòu),主要作為細(xì)胞外能源儲(chǔ)庫(kù)及底物,誘導(dǎo)底物依賴(lài)性GTF合成水溶性和非水溶性葡聚糖;WIG又稱(chēng)變聚糖,通過(guò)α-1,3糖苷鍵將葡糖基彼此連接成葡聚糖。WIG具有黏性,在細(xì)菌黏附、菌斑形成中起著重要的作用,是變異鏈球菌致齲的主要毒力因子之一。變異鏈球菌在代謝過(guò)程中可以產(chǎn)生細(xì)胞外GTF,而GTF在變異鏈球菌的定植中起著關(guān)鍵性作用。大多數(shù)變異鏈球菌至少含有g(shù)tfB、gtfC、gtfD基因,少數(shù)還有g(shù)tfA基因。gtfB基因編碼的GTF-Ⅰ合成WIG,gtfC基因編碼的GTF-SI合成WIG和WSG的混合物,gtfD基因編碼的GTF-S合成WSG。gtfD并非變異鏈球菌蔗糖依賴(lài)性定植所必需,而gtfB和gtfC則與變異鏈球菌蔗糖依賴(lài)性黏附密切相關(guān)。gtfB和gtfC失活可使變異鏈球菌喪失在牙光滑面上實(shí)施蔗糖依賴(lài)性定植的能力。根據(jù)gtfB的核苷酸序列推測(cè),GTF-Ⅰ氨基酸序列中不含半胱氨酸,其5’端存在多個(gè)細(xì)胞外信號(hào)肽序列,3’端有3.5個(gè)正向重復(fù)序列單位。Chia等證實(shí):gtfC緊靠gtfB下游,與gtfB有高度的同源性,DNA印跡分析得出多數(shù)同源基因含7.3kb的PstⅠ片段,有3個(gè)開(kāi)放閱讀框架;GTF-SI蛋白質(zhì)整體呈親水性,由1375個(gè)氨基酸殘基組成,序列中幾乎不含半胱氨酸。Ooshima等發(fā)現(xiàn),只含一個(gè)編碼WIG的gtf拷貝的變異鏈球菌合成WIG的能力差,不能實(shí)現(xiàn)在牙齒光滑面的定植,但插入gtfC后可增強(qiáng)其合成WIG的能力,從而使其能在牙齒光滑面定植。變異鏈球菌的許多菌株均可與葡聚糖反應(yīng)并發(fā)生凝集,其分泌的GTF-S與葡聚糖有高度的親和力,變異鏈球菌表面還有非酶性GBP。GTF還存在于人的唾液中,可進(jìn)入早期獲得性膜并合成葡聚糖,為GBP提供受體,從而直接參與牙面的初始定植。3影響粘土環(huán)境因素的環(huán)境因素3.1變異鏈球菌組織主要功能成分唾液對(duì)變異鏈球菌在牙面的定植起重要的調(diào)節(jié)作用。唾液中存在的可與變異鏈球菌反應(yīng)、誘導(dǎo)其凝集的唾液凝集素(salivaryagglutinin,SAG),主要通過(guò)識(shí)別細(xì)菌表面蛋白來(lái)介導(dǎo)細(xì)菌的凝集或黏附。存在于液相中的SAG主要介導(dǎo)細(xì)菌凝集,吸附于固相上的SAG則介導(dǎo)細(xì)菌的黏附。變異鏈球菌與唾液的作用有如下幾點(diǎn)。其一,不同的變異鏈球菌株,其表面的黏結(jié)素不同,不同的唾液組分促進(jìn)了不同菌株的黏附。變異鏈球菌的黏附主要為黏蛋白和淀粉酶所促進(jìn),倉(cāng)鼠鏈球菌(a)主要由富脯蛋白和淀粉酶促進(jìn),大鼠鏈球菌(b)由富脯蛋白和IgA促進(jìn),表兄鏈球菌則不受唾液成分的影響。其二,不同狀態(tài)的SAG對(duì)變異鏈球菌的黏附作用不同。溶液中的SAG可誘導(dǎo)細(xì)菌凝集或通過(guò)封閉細(xì)菌表面唾液結(jié)合點(diǎn),有利于消除細(xì)菌;SAG吸附于牙面后構(gòu)型可發(fā)生改變,暴露出變異鏈球菌黏結(jié)素的結(jié)合位點(diǎn),促進(jìn)黏附。其三,唾液成分空間構(gòu)象和分子結(jié)構(gòu)對(duì)變異鏈球菌黏附有影響。一些SAG經(jīng)理化處理降解變性后,分子結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象發(fā)生改變,失去了與變異鏈球菌結(jié)合的能力。其四,不同個(gè)體的唾液對(duì)變異鏈球菌黏附定植的影響和凝集變異鏈球菌的能力不同,且唾液的凝集力同變異鏈球菌感染水平呈負(fù)相關(guān)。牛奶中的乳鐵蛋白(lactoferritin,LF)對(duì)SAG與細(xì)菌的結(jié)合具有抑制作用,且呈劑量依賴(lài)性。其中,主要的功能成分是LF411(473538位氨基酸殘基)片段。盡管LF是一種離子結(jié)合型蛋白,其離子結(jié)合能力會(huì)影響其生物學(xué)功能,但是在LF411片段上并沒(méi)有離子結(jié)合位點(diǎn),且LF411與半胱氨酸清道夫受體家族P-2片段的結(jié)合也不需要離子的存在。目前,尚不太清楚LF對(duì)變異鏈球菌黏附的具體機(jī)制,需進(jìn)一步深入研究。Oli等發(fā)現(xiàn),當(dāng)變異鏈球菌編碼PAc的基因被取代后,其與GP-340的凝集和黏附活性受到不同程度的抑制。針對(duì)PAc不同位點(diǎn)的單克隆抗體可阻斷變異鏈球菌與SAG的黏附,而多克隆抗體的阻斷作用則更強(qiáng)。3.2基于葡萄糖的初始黏附素姜穎等發(fā)現(xiàn),質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.0%的葡萄糖組黏附力最強(qiáng),0.2%的葡萄糖組黏附力最低,1.0%的葡萄糖組黏附力界于兩者之間,即一定范圍內(nèi)高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的葡萄糖可促進(jìn)變異鏈球菌的初始黏附。這既可能緣于充裕的葡萄糖為變異鏈球菌合成蛋白質(zhì)提供了更多的前體和能源,有利于變異鏈球菌表面黏附素的表達(dá),促進(jìn)變異鏈球菌spaP基因的表達(dá);也可能緣于充裕的葡萄糖影響轉(zhuǎn)肽酶SrtA和內(nèi)源性表面蛋白釋放酶的活性,但其確切的分子機(jī)制是今后的研究方向。3.3ph對(duì)變異鏈球菌的影響在pH5.5的酸性環(huán)境中,初始黏附能力較強(qiáng)和較弱變異鏈球菌菌株的spaP表達(dá)均明顯下降;不過(guò)在pH為酸性或中性的環(huán)境中,初始黏附力強(qiáng)的變異鏈球菌的spaP表達(dá)均明顯高于初始黏附力弱的變異鏈球菌。pH對(duì)變異鏈球菌某些基因的表達(dá)及其蛋白的質(zhì)和量都有重要的影響。Browngardt等發(fā)現(xiàn),糖類(lèi)和pH對(duì)于變異鏈球菌的主要毒力因子ftf和gtf-BC的表達(dá)起重要的調(diào)控作用。變異鏈球菌能耐受惡劣環(huán)境主要得益于其能產(chǎn)生一些應(yīng)激蛋白,這些蛋白通過(guò)折疊新合成的或者變性的蛋白質(zhì)聚集、轉(zhuǎn)運(yùn)、降解細(xì)胞蛋白而在細(xì)胞的代謝中起重要的作用。酸性環(huán)境使變異鏈球菌的spaP表達(dá)下調(diào),可能緣于在酸性環(huán)境中變異鏈球菌傾向于合成更多的應(yīng)激蛋白以耐受環(huán)境的刺激,而其他非應(yīng)激蛋白的合成受到了抑制。酸性環(huán)境抑制變異鏈球菌的spaP表達(dá),可能是酸性環(huán)境中變異鏈球菌初始黏附下降的原因之一。在不同pH環(huán)境中,初始黏附力強(qiáng)的變異鏈球菌菌株的spaP表達(dá)總體上高于黏附力弱的菌株,即變異鏈球菌黏附力可能與其黏附毒力因子的基因表達(dá)有關(guān)。更好地闡釋變異鏈球菌的黏附機(jī)制,有利于發(fā)現(xiàn)控制牙菌斑生物膜形成的有效措施,可更有針對(duì)性地預(yù)防齲病的發(fā)生。3.4蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)變異鏈球菌黏附的影響壁相關(guān)蛋白(wall-associatedprotein,WAP)A又稱(chēng)抗原A、抗原Ⅲ,是一種Mr為2.9×104的表面蛋白,編碼基因約長(zhǎng)1359bp。在Qian等插入滅活變異鏈球菌的wapA后,其突變株的集聚能力和蔗糖依賴(lài)性黏附能力分別下降了52%和40%,證實(shí)WapA在變異鏈球菌蔗糖依賴(lài)性黏附中起著非常重要的作用。Zhu等也發(fā)現(xiàn),wapA突變株形成的鏈明顯變短,細(xì)菌間聚集明顯減少,細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)改變,細(xì)胞表面黏性下降。隨著環(huán)境的改變,生物膜中細(xì)菌的許多生物活性和功能發(fā)生相應(yīng)的變化。蔗糖是人類(lèi)食用較多的糖類(lèi)之一,所合成的水不溶性細(xì)胞外多糖參與變異鏈球菌蔗糖依賴(lài)性黏附,蔗糖的供給情況是影響變異鏈球菌黏附的另一主要環(huán)境因素。為明確蔗糖促進(jìn)變異鏈球菌黏附的內(nèi)在機(jī)制,有研究檢測(cè)在不同蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)環(huán)境中,參與變異鏈球菌蔗糖依賴(lài)性黏附wapA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,隨著蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.5%、1%、5%)的增加,黏附性較強(qiáng)的變異鏈球菌菌株wapA表達(dá)上調(diào),黏附性較弱的菌株wapA表達(dá)先上調(diào)而后下降,但其變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即在一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi),蔗糖質(zhì)量的增加對(duì)變異鏈球菌wapA表達(dá)的影響不大。在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蔗糖環(huán)境中,黏附性較強(qiáng)的變異鏈球菌