中藥不同分期對實驗性sd大鼠骨折愈合過程中fgf-2表達(dá)的影響

骨折三級治療是中醫(yī)治療骨折的指導(dǎo)原則。然而，該治療規(guī)則的提出是基于臨床經(jīng)驗的積累和總結(jié)，對其功能和機(jī)制缺乏系統(tǒng)的研究。目前對其作用存在嚴(yán)重分歧,甚至有學(xué)者認(rèn)為沒有分期治療的必要,出現(xiàn)三期治療、二期治療及一期治療的混亂局面,目前臨床用藥及所開發(fā)治療骨折的中成藥幾乎均是屬于一期治療的范疇。如何闡明骨折三期治療對骨折愈合的作用及其機(jī)制、明確中醫(yī)藥治療骨折的合理分期方法是中醫(yī)骨傷科學(xué)亟待解決的課題。本課題組對中藥不同分期治療對SD大鼠骨折愈合的作用進(jìn)行了X線和組織學(xué)初步研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)分期治療組骨痂出現(xiàn)時間、骨痂質(zhì)量和骨折臨床愈合時間等方面均優(yōu)于非分期治療組(一期治療組),其中二期治療有優(yōu)于三期治療的趨勢。同時,對不同分期治療對SD大鼠骨折愈合過程中骨生長因子BMPs表達(dá)的影響進(jìn)行了研究,顯示三期治療對BMPs表達(dá)的促進(jìn)作用明顯強(qiáng)于一期治療,而二期治療又顯著強(qiáng)于三期治療,提示在促進(jìn)SD大鼠骨折愈合過程中BMPs表達(dá)的作用方面,中藥分期治療骨折是必要的,二期治療可能是中藥治療骨折的最佳分期方法。局部骨生長因子調(diào)控著骨折愈合的整個過程,決定著骨折修復(fù)的速度與質(zhì)量。其中,成纖維細(xì)胞生長因子-2(fibroblastgrowthfactor-2,FGF-2)為骨折局部重要的關(guān)鍵骨生長因子之一,對促進(jìn)骨形成細(xì)胞的分裂增殖及骨折部位血液循環(huán)的重建具有極其重要的作用。本課題組研究了三期治療對骨折愈合過程中FGF-2及血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響,顯示三期治療對FGF-2及血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的促進(jìn)作用明顯強(qiáng)于一期治療,提示中藥治療骨折實行分期辨證治療是必要的。但是,不同分期治療對骨折愈合過程中FGF-2表達(dá)影響方面的研究尚未見報道。在此基礎(chǔ)上,本實驗對不同分期治療對SD大鼠骨折愈合過程中局部FGF-2表達(dá)的影響進(jìn)行了研究,以進(jìn)一步探討中藥治療骨折的合理分期方法。材料和方法1.動物實驗室國外動物實驗室SD大鼠:北京市實驗動物中心提供,SPF級,雄性,健康,體質(zhì)量(270±20)g。動物實驗室:中國中醫(yī)研究院動物室,二級。實驗用中藥:同仁堂醫(yī)藥公司崇文門分公司提供。2.poligir成像彩色圖像分析儀:Mis-2000SP,MicroimageAnalysisSystem,USA3Y-internationalCo.LTD.連接裝有PolaroidMDCNikon的顯微鏡。圖像分析軟件:Pixelpro,Ver.4.0.。SP免疫組化染色試劑盒:北京中山生物技術(shù)有限公司提供,SP9001,批號:30577916。FGF-2兔抗鼠多克隆抗體:SantaCruzBiotechnology,Inc,北京中山生物技術(shù)有限公司提供,批號:D0203。3.平均分組及分組將222只SD大鼠應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)取6只作為正常組,其余造模后平均分為一期、二期、三期治療組與模型組,每組再隨機(jī)平均分為9個小組,分別作為骨折后第1、3、5、7、9、12、15、21、28d組,每小組6只。動物分籠喂養(yǎng),標(biāo)準(zhǔn)飼料。5.配方之間的責(zé)任主體本研究所用基本方劑是高等中醫(yī)藥院校統(tǒng)編教材《中醫(yī)正骨學(xué)》中的肢傷一方、二方及三方,各經(jīng)加減而成:加減肢傷一方:當(dāng)歸12g,赤芍12g,桃仁10g,紅花6g,黃柏10g,防風(fēng)10g,乳香5g,生地黃12g,生甘草6g;加減肢傷二方:當(dāng)歸12g,赤芍12g,續(xù)斷12g,威靈仙12g,生薏苡仁30g,桑寄生30g,骨碎補(bǔ)12g,五加皮12g;加減肢傷三方:當(dāng)歸12g,赤芍12g,續(xù)斷12g,威靈仙12g,骨碎補(bǔ)12g,川木瓜12g,生黃芪15g,熟地黃15g,煅自然銅(先煎)10g,土鱉10g。按傳統(tǒng)中藥水煎劑制備方法制成含生藥1.5g/mL的濃縮液。5.3給藥方法最佳用藥劑量為2倍等效劑量,根據(jù)動物體質(zhì)量和體表面積確定給藥量,灌胃,早晚各1次。所有實驗動物均于造模后12h給藥。5.4骨折期根據(jù)骨折愈合分期方法與SD大鼠骨折局部組織學(xué)變化,將SD大鼠骨折愈合過程分為3期:早期、中期和后期。5.5后期的骨折工藝根據(jù)“中醫(yī)骨折三期治療”原則,分3期治療:早期:活血化瘀、行氣止痛,選用加減肢傷一方;中期:接骨續(xù)筋、舒筋活絡(luò),選用加減肢傷二方;后期:補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨,選用加減肢傷三方。將骨折分為早期與后期,即將骨折的原始骨痂形成期和改造塑形期合并作為后期。早期:活血化瘀、行氣止痛,選用加減肢傷一方;后期:接骨續(xù)筋、舒筋活絡(luò)、補(bǔ)肝益腎、強(qiáng)筋壯骨,選用加減肢傷二方與三方的綜合方:當(dāng)歸12g,赤芍12g,續(xù)斷12g,骨碎補(bǔ)12g,煅自然銅(先煎)10g,生黃芪15g,熟地黃15g,炙甘草6g。將骨折的早期、中期與后期合并為一期,活血化瘀、行氣止痛、接骨續(xù)筋、補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨,選用加減肢傷一方、二方與三方的綜合方:紅花10g,當(dāng)歸12g,赤芍12g,續(xù)斷12g,骨碎補(bǔ)12g,煅自然銅(先煎)10g,生黃芪15g,熟地黃15g,炙甘草6g。給予和實驗組等體積的生理鹽水。6.大鼠骨髓內(nèi)固定分別于造模后第1、3、5、7、9、12、15、21、28d,以斷髓法每組各處死1小組大鼠,取出脛骨,標(biāo)本常規(guī)處理?？v行切片,厚6μm。常規(guī)進(jìn)行組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢查。7.fgf-2免疫組織化學(xué)試驗7.1fgf-2兔抗鼠多克隆抗體(1)采用SP法進(jìn)行免疫組化染色;(2)FGF-2兔抗鼠多克隆抗體,工作濃度為1:30;(3)同時用1組織標(biāo)本切片,以PBS代替一抗,作為陰性對照。7.2平均光密度選取細(xì)胞漿被染成棕黃色為FGF-2表達(dá)陽性,未顯棕色者為陰性。根據(jù)平均光密度MOD值分級:微陽性(MOD≤0.10)、弱陽性(0.10<MOD≤0.20)、中度陽性(0.20<MOD≤0.30)、強(qiáng)陽性(0.30<MOD)。8.圖像分析8.1圖像選擇位置的確定于骨折間隙內(nèi),分別于兩骨折斷端平齊原骨皮質(zhì)的內(nèi)、外緣各取1個視野,然后于骨折間隙的中心向兩側(cè)骨折斷端方向各取1視野,共6個視野。8.2曝光時間、敏感度顯微鏡的物鏡固定為×40,光柵孔徑為0.25,光源電壓為9mV,曝光時間為0.16s,色溫為5500K,敏感度為M,分辨率為1600×1200。8.3fgf-2表達(dá)特點采用3Y圖像分析儀進(jìn)行圖像分析,FGF-2表達(dá)陽性細(xì)胞記數(shù)與相應(yīng)MOD測定。陽性細(xì)胞的確定條件:(1)染色成棕黃色;(2)細(xì)胞核比較清晰;(3)形狀比較規(guī)則;(4)輪廓比較清楚。完全具備上述條件方確定為陽性表達(dá)細(xì)胞。圖像周邊壓線的細(xì)胞不計數(shù)。細(xì)胞面積的范圍:100-1e+009;FGF-2表達(dá)MOD值的范圍:-1e+009-1e+009。以每個切片6個視野的陽性細(xì)胞數(shù)之平均數(shù)為該切片的陽性細(xì)胞數(shù),6個視野的總MOD之平均數(shù)為該切片陽性細(xì)胞MOD值。9.kruskal-培養(yǎng)了或f檢驗方法進(jìn)行檢驗FGF-2表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)與MOD值數(shù)據(jù)以表示,以Kruskal-Wallis檢驗或F檢驗方法進(jìn)行檢驗,設(shè)定α=0.05。P≤0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;0.05<P≤0.09,存在有差異的趨勢。fgf-2表達(dá)情況正常組個別骨細(xì)胞FGF-2表達(dá)弱陽性,MOD值0.59OD,陽性細(xì)胞數(shù)3.00個/視野。在骨折愈合過程中不同時段,FGF-2表達(dá)定位也隨之發(fā)生相應(yīng)改變。骨折后1-5d缺損區(qū)內(nèi)血腫細(xì)胞和炎性細(xì)胞FGF-2表達(dá)陽性,以后間充質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞與新形成的骨細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)陽性,隨著時間的推移,編織骨逐漸向板層骨轉(zhuǎn)變,骨細(xì)胞FGF-2表達(dá)的程度顯著減弱,陽性細(xì)胞數(shù)也相應(yīng)顯著減少,當(dāng)編織骨轉(zhuǎn)化成板層骨時只有散在骨細(xì)胞弱陽性。骨折后各組各時間點FGF-2表達(dá)陽性細(xì)胞光密度值見表1。每組以各時間點FGF-2表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)或MOD的總體平均值為FGF-2表達(dá)基礎(chǔ)水平,陽性細(xì)胞數(shù)或MOD值高于此基礎(chǔ)水平的各時間點組成FGF-2表達(dá)高峰期,該期內(nèi)最高陽性細(xì)胞數(shù)或MOD值稱為峰值水平。二期治療組顯著高于三期期治療組(P<0.05);三期治療組有高于一期治療組的趨勢;一期治療組明顯高于模型對照組(P<0.05)。(1)高峰期出現(xiàn)時間:一期、二期和三期治療組FGF-2表達(dá)高峰期出現(xiàn)時間顯著早于模型對照組:二期治療組比一期治療組提前4d,一期治療組比三期治療組提前2d,三期治療組比模型對照組提前2d;(2)高峰期持續(xù)時間:一期和二期治療組顯著長于三期治療組和模型對照組,其它各組之間無明顯差別。(1)峰值出現(xiàn)時間:二期治療組明顯早于其它組,較其它組提前8d以上,而其它各組間無明顯差別。(2)峰值水平:二期治療組顯著高于其他組(P<0.05);有三期治療組高于一期治療組、一期治療組高于模型對照組的趨勢。骨折后各組各時間點FGF-2表達(dá)陽性細(xì)胞計數(shù)見表2,其變化趨勢與MOD值的變化趨勢基本一致。充分利用分期治療新方法,顯著提高骨折愈合過程中fgf-2表達(dá)的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)骨折局部存在大量生長因子,并闡明和克隆了其相應(yīng)控制基因,如BMP、TGF-?、FGF-1、FGF-2、PDGF、SGF、IGF-1、EGF、VEGF、IL-1、IL-3、IL-6、TNF、G-CSF、GM-CSF等。其中,FGF-2是廣泛存在于機(jī)體組織的一種多聚肽,為廣譜有絲分裂原,能促進(jìn)來源于中胚層和神經(jīng)外胚層細(xì)胞的分裂增殖,具有趨化和遷移作用,同時也促進(jìn)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂增殖,是一種毛細(xì)血管增殖刺激劑,因而對促進(jìn)骨形成細(xì)胞的聚集和增殖及骨折部位血液循環(huán)的重建具有極其重要的促進(jìn)作用。將外源性FGF-2應(yīng)用于骨折或骨缺損部位,以探索其對骨修復(fù)的作用,取得了另人鼓舞的結(jié)果。本課題組在發(fā)現(xiàn)三期治療對FGF-2表達(dá)的促進(jìn)作用明顯強(qiáng)于一期治療,顯示了在中藥治療骨折實行分期治療必要性的基礎(chǔ)上,對分期對SD大鼠骨折愈合過程中FGF-2表達(dá)的影響進(jìn)行了比較,進(jìn)一步研究不同分期治療方法對SD大鼠骨折愈合的作用,以探討中藥治療骨折的合理分期方法。結(jié)果顯示:(1)在整個骨折愈合過程中FGF-2表達(dá)MOD值和陽性細(xì)胞數(shù)的總體平均值方面,二期治療組顯著高于三期期治療組,三期治療組有高于一期治療組的趨勢,一期治療組明顯高于模型對照組,此說明二期治療較其它方法能夠更顯著地提高骨折愈合過程中FGF-2的表達(dá)量;(2)在FGF-2表達(dá)的高峰期方面:(1)高峰期出現(xiàn)時間:一期、二期和三期治療組FGF-2表達(dá)高峰期出現(xiàn)時間顯著早于模型對照組:二期治療組比一期治療組提前4d,提前了80%;一期治療組比三期治療組提前2d,提前了29%;三期治療組比模型對照組提前2d,提前了22%。(2)高峰期持續(xù)時間:一期和二期治療組顯著長于三期治療組和模型對照組。此提示二期治療可以更明顯地加速FGF-2的表達(dá)、延長其表達(dá)高峰的持續(xù)時間;(3)在FGF-2表達(dá)峰值水平方面:(1)峰值出現(xiàn)時間:二期治療組明顯早于其它組,較其它組提前8d以上,提前了67%以上,而其它組無明顯差別。(2)峰值水平:二期治療組顯著高于其他組,有三期治療組高于一期治療組、一期治療組高于模型對照組的趨勢。此顯示二期治療不但可以加快FGF-2表達(dá)峰值的出現(xiàn),而且顯著地提升了其峰值的水平。骨折愈合的實質(zhì)是骨細(xì)胞再生、骨折完全性修復(fù),其整個過程受局部骨生長因子的調(diào)控。局部骨生長因子調(diào)控著骨折的整個修復(fù)過程,決定著骨折修復(fù)的速度與質(zhì)量。FGF-2是關(guān)鍵的骨生長因子之一,在骨形成細(xì)胞聚集、增殖和局部血液循環(huán)重建中發(fā)揮著極其重要的作用。本研究顯示和其它治療方法相比,二期治療不但可以明顯提高SD大鼠骨折愈合過程中FGF-2的表達(dá)量,而且顯著加速了FGF-2表達(dá)高峰期的出現(xiàn)、延長其高峰期的持續(xù)時間,尤其重要的是顯著加快了FGF-2表達(dá)峰值的出現(xiàn)、提升了峰值的水平,提示二期治療對骨折愈合過程中FGF-2表達(dá)的促進(jìn)作用顯著強(qiáng)于三期治療和一期治療,從而說明二期治療對骨折愈合的促進(jìn)作用強(qiáng)于三期治療和一期治療。所以就促進(jìn)SD大鼠骨折愈合過程中FGF-2表達(dá)的作用方面而言,二期治療可能是中藥治療骨折的最佳分期方法。4.小組在SD大鼠雙側(cè)脛骨上1/3段前的中點造成2mm×1.5mm的骨質(zhì)缺損,復(fù)制骨折模型。5.1基本配方的組成5.2給藥