馬鈴薯莖尖誘導(dǎo)與壯苗技術(shù)研究

在種植過程中，甘薯容易感染病毒。病毒會隨著持續(xù)積累而積累，這很容易導(dǎo)致種性退化、產(chǎn)量和品質(zhì)下降。通過詔書尖脫毒和鑒定病因，我們不僅可以在短時間內(nèi)獲得大量無病毒苗，而且保持品種的良好特性。通過這項工作，甘薯尖脫毒訓(xùn)練的難度主要與莖尖大小、培養(yǎng)基、培訓(xùn)條件和病毒類型有關(guān)。這項工作的內(nèi)容主要是對甘薯莖尖進(jìn)行剝離和培養(yǎng)，并使用雙重免疫吸痰法（das-elisa）對病毒檢測進(jìn)行脫毒苗。進(jìn)一步提高甘薯莖尖培訓(xùn)的成活率和脫毒率。1材料和方法1.1莖尖脫毒活性測定供試材料為田間長勢良好無病癥表現(xiàn)的大西洋、費(fèi)烏瑞它2個品種的植株,收獲后將薯塊置于室內(nèi)2~3周后,經(jīng)檢測用不帶有馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的塊莖進(jìn)行催芽,放入35~37℃恒溫箱中進(jìn)行熱處理1個月后,用解剖刀從薯塊切取長1cm左右的芽置于流水中沖洗1~2h,然后置于超凈工作臺滅菌,用75%的酒精浸泡30s,再用10%的次氯酸鈉滅菌6~8min,然后在40倍的顯微鏡下用解剖刀與解剖針剝?nèi)?個葉原基(直徑約為0.2~0.5mm)的莖尖置于培養(yǎng)基中培養(yǎng).以MS作為基本培養(yǎng)基并附加一定濃度6-BA和NAA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)3~5個月長出小芽后,轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng).馬鈴薯病毒檢測采用酶聯(lián)免疫檢測法(DSA-ELISA),主要檢測馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)、馬鈴薯A病毒(PVA)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯M病毒(PVM)、馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯S病毒(PVS).莖尖脫毒的統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn)為:對莖尖培養(yǎng)成活的植株,經(jīng)DSA-ELISA檢測,馬鈴薯卷葉病毒、A病毒、Y病毒、M病毒、X病毒、S病毒均呈陰性.1.2試驗設(shè)計1.2.1ms培養(yǎng)實驗結(jié)果設(shè)計不同濃度6-BA、NAA與GA3的組合,研究激素對莖尖成活率的影響.每個設(shè)計組合接種40個直徑為0.2mm帶1~2個葉原基的莖尖,以MS為基本培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度為25℃,光照強(qiáng)度為2000lx,光照時間為8h,待芽點轉(zhuǎn)綠后轉(zhuǎn)入MS繼代培養(yǎng)中,4個月后統(tǒng)計實驗結(jié)果(表1).1.2.2莖尖成活率測定以大西洋和費(fèi)烏瑞它的塊莖芽為材料,在顯微鏡下分別挑取帶1個葉原基、2個葉原基、3個葉原基的莖尖,接種于MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L培養(yǎng)基中,每個處理接種40個莖尖,120d后統(tǒng)計實驗結(jié)果.待芽點變綠后轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)成苗,統(tǒng)計成活率與檢測脫毒率.莖尖成活率的統(tǒng)計方法參照蓋瓊輝等的方法.1.2.3馬鈴薯復(fù)壯的最佳濃度本實驗設(shè)計同一濃度IBA與不同濃度B9相組合,尋求B9對馬鈴薯試管苗復(fù)壯的最佳濃度.以大西洋為材料,在無菌條件下,將試管苗剪成約2cm長帶有1~2張葉片的莖段,接種到以下繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng),20d后統(tǒng)計實驗結(jié)果(表2).2結(jié)果與分析2.1不同濃度的6-ba、naa、ga3對葉原基莖尖生長的影響莖尖成活的關(guān)鍵因素是莖尖的大小,且同一大小的莖尖其成活率與培養(yǎng)激素的濃度有關(guān).實驗結(jié)果表明:以直徑為0.2mm帶1~2個葉原基的莖尖在MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+GA30.02mg/L培養(yǎng)基里成活率最高,達(dá)50%.說明較低濃度的6-BA、NAA與GA3組合有利于莖尖的生長,但隨著6-BA與GA3濃度的增加,莖尖玻璃化嚴(yán)重,甚至死亡(表3).2.2莖尖的成活率和脫毒率莖尖的大小對莖尖成活率與脫毒率有一定的影響,從表4可以看到,當(dāng)莖尖越大時,成活率就越高,但是脫毒率也就越低;反之,莖尖越小,越難于成活,但脫毒率會越高.因為莖尖病毒積累較少,切取的部位越小,帶病毒就越少,脫毒率就越高,但操作的難度也隨之而增大,成活率也會下降.實驗方法主要是對莖尖培養(yǎng)成活的植株進(jìn)行成活率統(tǒng)計,并對培養(yǎng)成活的植株進(jìn)行病毒檢測,測定植株的脫毒效果.結(jié)果表明:以直徑大小為0.2mm帶1~2個葉原基的莖尖為外植體進(jìn)行培養(yǎng),其成活率與脫毒率較高,分別為68%和56%(表4).2.3不同濃度b9對馬鈴薯植株生長的影響不同濃度的B9與同一濃度的IBA相結(jié)合對馬鈴薯試管苗復(fù)壯效果如表5所示.當(dāng)B9濃度為5mg/L時,與對照植株相比,無明顯差別;但隨著B9濃度升高,馬鈴薯葉色加深,呈濃綠色,同時葉片增大,莖增粗,植株矮化明顯.當(dāng)B9濃度達(dá)到20mg/L時,植株雖然較為粗壯,但是葉片稍微有些玻璃化.由此可見,B9在一定的濃度范圍內(nèi)對馬鈴薯植株矮化和壯苗有一定作用,但是隨著濃度的增高,對植株生長表現(xiàn)出一定的抑制作用.因此,從實驗結(jié)果來看,B9的濃度為15mg/L時,對植株的長勢最好.3討論3.1莖尖的培養(yǎng)由于馬鈴薯的脫毒培養(yǎng)技術(shù)要求較高,因此影響莖尖成活的因素也較多,一是莖尖的大小.掌握莖尖的大小是脫毒與成活的關(guān)鍵因素.一般而言,莖尖越大成活率越高,莖尖越小死亡率越高;但是莖尖越大脫毒效果也就越差,莖尖越小脫毒效果也就越好.因此,掌握好莖尖的大小是個關(guān)鍵的因素.本實驗結(jié)果表明以直徑大小為0.2mm帶1~2個葉原基的莖尖為外植體進(jìn)行培養(yǎng),其成活率較高,為68%.但是挑取的莖尖必須帶有葉原基,這樣既保證了成活率同時也保證一定的脫毒率.二是培養(yǎng)基中的激素濃度.附加一定種類與濃度的生長激素對于莖尖的生長有一定的促進(jìn)作用,但是由于挑取的莖尖較小,激素濃度若太高則易引起玻璃化而死亡,因此掌握激素的濃度也是非常關(guān)鍵的.本實驗用0.5mg/L濃度的細(xì)胞分裂素6-BA與0.1mg/L濃度的生長素NAA相結(jié)合對莖尖培養(yǎng)的成活率較好.三是培養(yǎng)的條件.莖尖培養(yǎng)的適宜條件為溫度22~25℃,光照時間為8h,環(huán)境的溫度過高或過低都不利于莖尖的生長.3.2植物生長減緩劑的使用采用不同的措施可以使馬鈴薯試管苗達(dá)到壯苗目的,使其莖桿變粗,葉片變濃綠,根系變粗.關(guān)于這方面的研究報道很多,有直接用1/2MS或用簡化培養(yǎng)基代替MS培養(yǎng)基,有用自然光代替日光燈等,以及在培養(yǎng)基中添加矮壯素或植物生長延緩劑B9.B9主要是抵制植物體內(nèi)源激素GA的合成,對調(diào)節(jié)試管苗生長、促進(jìn)壯苗都有重要作用,同時還抑制試管苗頂端優(yōu)勢,縮短節(jié)間距離,促進(jìn)腋芽的發(fā)育,從而有效提高繁殖系數(shù).本實驗結(jié)果與前人研究結(jié)果相符,在附加IBA激素的培養(yǎng)基上添加一定濃度的B9有利于馬鈴薯植株矮壯,莖桿增粗,葉片變濃,根系增粗.當(dāng)B9使用濃度為15mg/L時,植株長勢最好.3.3馬鈴薯病毒檢測方法一般在馬鈴薯病毒檢測中的應(yīng)用植物病毒診斷的方法有很多種:根據(jù)被侵染植株表現(xiàn)的癥狀進(jìn)行診斷,指示植物法,電子顯微鏡觀察法,核酸斑點雜交,PCR或RT-PCR法以及血清學(xué)檢測法等等.其中血清學(xué)檢測是目前最常用的快速有效的病毒檢測方法.雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法(DAS-ELISA)在馬鈴薯病毒檢測中應(yīng)用較廣,其方法操作簡單,檢測時間短,結(jié)果也較為準(zhǔn)確可靠.但是由于使用進(jìn)口的血清價格較為昂貴,成本較高,普及程度有限;再者由于操作不當(dāng)也會引起假陽性的情況出現(xiàn),從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性.因此,在采用DAS-ELISA測定法的同時,應(yīng)結(jié)合相應(yīng)的生物測定法,以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性.3.4馬鈴薯莖尖的脫毒率影響莖尖脫毒的關(guān)鍵因素主要有2個:一是病毒的種類;二是剝離莖尖的大小.不同種類的病毒脫除的難易程度不一,馬鈴薯病毒脫除的難易順序為:馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)、馬鈴薯A病毒(PVA)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯M病毒(PVM)、馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯S病毒(PVS)和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTV).莖尖培養(yǎng)雖然可以脫除馬鈴薯的病原菌,但脫毒率仍然很低.因此,可根據(jù)病毒和植物細(xì)胞對熱處理溫度與時間的反映,結(jié)合熱處理(3