小麥轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展

1992年，vasil等人以長(zhǎng)期培育的假種子為外植體，將gus和bar基因移植到小麥品種“pavon”，并獲得了世界上第一個(gè)牛奶轉(zhuǎn)世。迄今為止,在獲得的轉(zhuǎn)基因小麥植株報(bào)道中,基因槍法占絕大多數(shù),其次是根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,轉(zhuǎn)化率通常為1%-8%。小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了外源基因定向轉(zhuǎn)移,在一定程度上補(bǔ)充或改進(jìn)了傳統(tǒng)的育種方法,打破基因流的界限,大大縮短育種年限,為快速培育小麥新品種提供了一條有效的新途徑。小麥?zhǔn)寝D(zhuǎn)化難度較大的單子葉植物之一,其轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究起步較晚,近20年來經(jīng)過許多學(xué)者的不懈努力,已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展。利用不同的轉(zhuǎn)化方法已將抗病蟲、抗逆性、改善品質(zhì)和雄性不育基因等導(dǎo)入小麥,并獲得一批轉(zhuǎn)基因小麥品系,部分品系已經(jīng)進(jìn)入環(huán)境釋放階段。由于小麥?zhǔn)钱愒戳扼w,其基因組相對(duì)較大,遺傳背景復(fù)雜,基因型依賴性強(qiáng)等,目前轉(zhuǎn)化率仍然較低。本文論述了當(dāng)前小麥遺傳轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體(如啟動(dòng)子及選擇標(biāo)記基因)、轉(zhuǎn)化目標(biāo)基因、受體材料以及主要轉(zhuǎn)化方法等方面的研究進(jìn)展,針對(duì)當(dāng)前小麥轉(zhuǎn)基因研究存在的問題進(jìn)行討論,為利用基因工程對(duì)小麥進(jìn)行遺傳改良研究提供參考。1利用基因計(jì)算機(jī)進(jìn)行材料的轉(zhuǎn)化小麥遺傳轉(zhuǎn)化常用的表達(dá)載體主要是由pBI121、pMON505、pCAMBIA3301、pRTL2和pPZP212系列改造形成的。Cheng等首次利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將攜帶有雙元表達(dá)載體pMON18365質(zhì)粒導(dǎo)入小麥,獲得了轉(zhuǎn)基因小麥。李艷等用玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEPC基因片段替換雙元表達(dá)載體pCAMBIA3301上的GUS基因,構(gòu)建雙元表達(dá)載體p33012pepc,通過基因槍介導(dǎo)法將其導(dǎo)入小麥,實(shí)時(shí)定量PCR分析表明玉米PEPC基因已整合到小麥基因組中,且外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中既有單拷貝插入,也有多拷貝整合。李根英等成功地構(gòu)建了植物高效表達(dá)載體pFUBPaPb,該載體攜帶籽粒硬度Pina、Pinb融合基因,以Ubiqutin為啟動(dòng)子,?和poly(A)為增強(qiáng)子,bar基因?yàn)楹Y選標(biāo)記。通過基因槍轉(zhuǎn)化也獲得了轉(zhuǎn)基因植株。在小麥遺傳轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體構(gòu)建上,以玉米Ubi-1、CaMV35S和水稻Act1作為啟動(dòng)子較為普遍,以β-葡萄甘酸酶基因GUS和氯酶素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因CAT等為報(bào)告基因。轉(zhuǎn)基因小麥選擇標(biāo)記基因通常有bar、nptII、manA(pmi)、Cah、gst27、mopat、popat、CP4和GOX,篩選劑一般使用Bialaphos、Glufosinate、G418和Glyphosate等。邢莉萍等構(gòu)建由Ubi-1強(qiáng)啟動(dòng)子控制下的Ta-Tlp基因的表達(dá)載體pAHC-TlP,并通過基因槍法轉(zhuǎn)化揚(yáng)麥158的幼胚愈傷組織,經(jīng)過除草劑篩選和T0、T1和T2子代相關(guān)性狀分析表明,轉(zhuǎn)基因后代能夠延緩白粉病的發(fā)病進(jìn)程。然而這些選擇標(biāo)記基因?qū)儆诳股鼗虺輨╊?人們擔(dān)憂它們的存在會(huì)給環(huán)境和食品安全帶來潛在的危害。選擇并利用無標(biāo)記基因或者花色素苷基因作為選擇標(biāo)記基因,從而避免引入抗生素或除草劑基因。Chawla將花青苷調(diào)控基因B和C1利用基因槍法轉(zhuǎn)入小麥,通過對(duì)轉(zhuǎn)化受體及其細(xì)胞的顏色來選擇轉(zhuǎn)化子。Xuan等利用基因槍法轟擊預(yù)處理過的小麥幼胚盾片,將攜帶有新型標(biāo)記基因AtMYB12質(zhì)粒pBI121-MYB12轉(zhuǎn)移至小麥中,經(jīng)過大約6周的培養(yǎng),獲得了胚芽鞘為紫色再生植株。與GUS和GFP相比,AtMYB12基因作為篩選標(biāo)記,對(duì)再生植株的檢測(cè)更清晰、更方便。因此,利用AtMYB12基因作為小麥轉(zhuǎn)化體篩選的標(biāo)記基因,安全簡(jiǎn)便,廉價(jià)高效。2小麥基因的轉(zhuǎn)錄和測(cè)序技術(shù)隨著人們對(duì)小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)的深入的研究,一些有重要利用價(jià)值的基因被應(yīng)用于小麥遺傳轉(zhuǎn)化。按轉(zhuǎn)入目標(biāo)基因的功能可分為以下幾種類型:(1)抗除草劑基因,如bar、EPSPs、Bxn、CP4和GOX等。世界上第一株轉(zhuǎn)基因小麥——抗除草劑基因bar小麥,是由美國(guó)科學(xué)家Vasil于1992年通過基因槍法獲得的。(2)改良品質(zhì)基因,如高分子量谷蛋白亞基基因1Ax1、1Dx5、1Dx10、重組高分子量谷蛋白亞基Dy10-Dx5基因、籽粒硬度基因Pina和Pinb等。Martin等將Pina-D1a轉(zhuǎn)入小麥品種Bobwhite,3個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥株系隨著Pina在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量升高,籽粒硬度明顯變軟。(3)抗病蟲基因,如病毒外殼蛋白基因、雪花蓮凝集素基因、藜蘆醇合成酶基因、玉米Ds與Ac轉(zhuǎn)座子及大麥Mlo反義基因等。燕飛等構(gòu)建以Emu啟動(dòng)子的高效表達(dá)載體pPPI45(攜帶由BYDV-GPV株系復(fù)制酶基因部分序列和外殼蛋白基因序列構(gòu)建成復(fù)合發(fā)夾RNA結(jié)構(gòu)),利用基因槍法轉(zhuǎn)化小麥幼胚愈傷組織細(xì)胞,獲得了整合有外源基因的小麥再生植株,對(duì)再生植株進(jìn)行接種大麥黃矮病毒感染試驗(yàn),其中6株表現(xiàn)為高度抗性。(4)抗逆及提高產(chǎn)量相關(guān)基因,如BADH、DREB轉(zhuǎn)錄因子、擬南芥Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtNHX1、IPT基因等。奚亞軍等利用花粉管通道法將葉片衰老抑制基因PSAG12-IPT導(dǎo)入普通小麥西農(nóng)1376,通過對(duì)再生植株的葉片細(xì)胞分裂素含量、葉綠素含量、葉片衰老進(jìn)程及農(nóng)藝性狀分析,初步證明PSAG12-IPT基因在部分轉(zhuǎn)基因小麥的衰老葉片中特異表達(dá),能夠明顯的抑制葉片的衰老。(5)雄性不育基因,如核糖核酸酶類基因Barnase等。王瑞霞等利用改良的穗莖注射法將反義PLD-γ基因?qū)肫胀ㄐ←溙m考906,獲得的轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)特異PCR擴(kuò)增和PCR-Southern雜交技術(shù)分析表明,該基因已整合到小麥的基因組中。轉(zhuǎn)基因株系的成熟期明顯比受體提早4-8d;轉(zhuǎn)化株系后代中存在完全的雄性不育現(xiàn)象。3小麥外植體的基因外源基因小麥遺傳轉(zhuǎn)化的受體有幼胚、成熟胚、幼胚或成熟胚的胚性愈傷組織、懸浮細(xì)胞、盾片組織、幼穗、莖尖組織和花粉等。高效的再生體系是獲得轉(zhuǎn)基因小麥的前提,因此建立高效、完善的小麥組織培養(yǎng)體系,對(duì)小麥轉(zhuǎn)基因研究至關(guān)重要。在早期的小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究中,由于懸浮細(xì)胞及原生質(zhì)體再生困難,致使電擊法介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化受到了限制。幼胚、幼胚愈傷組織和成熟胚與其他的組織作為外植體相比,在愈傷組織的誘導(dǎo)和再生頻率方面具有更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì),在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移中常用這三種材料作為轉(zhuǎn)化受體。成熟胚作為外植體具有取材方便,不受季節(jié)限制等優(yōu)點(diǎn),是小麥遺傳轉(zhuǎn)化常用的外植體,然而其再生體系研究尚未成熟,植株再生率較低。幼胚的愈傷組織誘導(dǎo)率和植株再生率均較高,被認(rèn)為是比較理想的受體材料,已報(bào)道的轉(zhuǎn)基因小麥基本上以幼胚為主。然而由于幼胚取材受到季節(jié)的限制,所取材料的生理狀態(tài)不能保持一致,給遺傳轉(zhuǎn)化工作帶來許多不便。Cheng等以幼胚、幼胚愈傷組織和成熟胚為受體材料,利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功地獲得了轉(zhuǎn)基因植株。付永彩等利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將大麥黃矮病病毒CP基因轉(zhuǎn)入到小麥不同的外植體中(幼胚、莖尖、成熟胚和花藥),拓寬了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的受體范圍。董福雙等嘗試以小麥芽生長(zhǎng)點(diǎn)為受體,利用基因槍法將外源基因GUS和BADH/BAR導(dǎo)入到小麥基因組中,獲得了再生植株。GUS瞬時(shí)表達(dá)表明,以生長(zhǎng)點(diǎn)數(shù)統(tǒng)計(jì),轉(zhuǎn)化率達(dá)5.7%-8.6%;再生植株P(guān)CR擴(kuò)增分析表明外源基因已整合至小麥基因組中。4農(nóng)桿菌法、花粉管通道法小麥轉(zhuǎn)基因方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法及花粉管通道法等。目前在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用最多、效果最好的仍然是基因槍法,絕大多數(shù)轉(zhuǎn)基因小麥?zhǔn)遣捎迷摲椒ǐ@得的。農(nóng)桿菌法在轉(zhuǎn)基因小麥中的應(yīng)用也日趨成熟,而花粉管通道法也以其特有的優(yōu)點(diǎn)受到重視。近年來,隨著低能離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究的不斷深入,目前已在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中也逐步得到了應(yīng)用。4.1對(duì)小麥基因的檢測(cè)基因槍法又稱微彈轟擊法,以火藥爆炸、高壓放電或高壓氣體為驅(qū)動(dòng)力,將載有外源DNA的金粉(或鎢粉)等金屬微粒加速射入受體細(xì)胞或者組織中,從而將外源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。自1992年Vasil等利用基因槍轟擊獲得世界上第一株轉(zhuǎn)基因小麥以來,基因槍法仍然是當(dāng)今小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主流方法。Becker等分別以未成熟胚和幼胚盾片為外植體,通過基因槍法獲得了抗除草劑轉(zhuǎn)基因小麥。基因槍法的建立推動(dòng)了小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展,利用基因槍法已將耐除草劑、抗病、抗蟲、品質(zhì)改良及雄性不育等基因?qū)胄←溨小ＴS多因素影響基因轟擊后轉(zhuǎn)基因植株的再生,其中最關(guān)鍵的是轟擊盾片組織時(shí),不能傷害受體組織,以免體細(xì)胞胚發(fā)生能力的下降。劉永偉等采用基因槍共轉(zhuǎn)化法將雙功能基因(小麥黃花葉病毒的復(fù)制酶基因Nib8和具有廣譜抗病性的ERF基因W17)轉(zhuǎn)入小麥揚(yáng)麥品種,獲得具有綜合抗病性的轉(zhuǎn)基因材料。王華忠等在轉(zhuǎn)化試驗(yàn)前,利用玉米花青素苷合成調(diào)節(jié)基因C1-Lc作為報(bào)告基因,通過GUS瞬間表達(dá)后愈傷組織表面紅色斑點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)分析,并對(duì)基因槍法遺傳轉(zhuǎn)化的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,基因槍參數(shù)組合為金粉直徑1μm;每槍金粉用量500μg;氦壓1100psi;可裂膜與受體膜距離9.5mm;載體膜與阻擋網(wǎng)距離16mm;受體與阻擋網(wǎng)距離9cm;真空度28cmHg,所獲得的小麥基因瞬間表達(dá)頻率最高?；驑尫ㄒ云涫荏w來源廣泛,方法簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),成為迄今為止小麥轉(zhuǎn)基因的主要方法。然而基因槍法尚存在一些不足,如易形成嵌合體、多拷貝整合過程中會(huì)出現(xiàn)共抑制和基因沉默現(xiàn)象、外源基因在后代中易丟失、試驗(yàn)所需的費(fèi)用昂貴等,限制了基因槍法的普遍應(yīng)用。4.2外源基因的整合1983年Zambryski等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了世界上第一例轉(zhuǎn)基因植物——煙草。Horch等建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法,該法在雙子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化中得到了廣泛的應(yīng)用,先后成功獲得了轉(zhuǎn)基因馬鈴薯、番茄和擬南芥等。過去認(rèn)為對(duì)于單子葉植物,特別是以小麥為主的禾本科作物,不是根癌農(nóng)桿菌的天然寄主,不能轉(zhuǎn)入Ti質(zhì)粒上的T-DNA,因而使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物較難成功。隨著對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的原理深入系統(tǒng)的研究,發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌對(duì)單子葉植物侵染的不敏感性,可能是由于單子葉植物創(chuàng)傷后,在傷口附近往往發(fā)生木質(zhì)化或硬化,造成內(nèi)源信號(hào)分子相對(duì)不足,不能形成足夠的誘導(dǎo)vir區(qū)基因表達(dá)的酚類化合物。但通過添加外源信號(hào)物質(zhì)如乙酰丁香酮(AS)及其衍生物等可以促進(jìn)農(nóng)桿菌在小麥培養(yǎng)細(xì)胞上的吸附性,從而大大提高遺傳轉(zhuǎn)化率。1997年Cheng利用根癌農(nóng)桿菌C58(質(zhì)粒pMON18365攜帶GUS基因和NPTⅡ基因),分別侵染小麥的幼胚、幼胚愈傷組織和成熟胚,經(jīng)過培養(yǎng)后,3種外植體均獲得了再生植株。組織化學(xué)檢測(cè)以及Southernbolt雜交分析表明,外源基因已整合至小麥植株中,并能在小麥中穩(wěn)定表達(dá)和遺傳。陳立國(guó)等利用農(nóng)桿菌法將攜帶有BG2基因和GUS基因?qū)氲匠墒炫哂鷤M織,研究表明運(yùn)用超聲波處理或真空處理可以提高轉(zhuǎn)化效率。小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)也常用于進(jìn)行新基因功能的分析,Daniel以小麥的幼胚為受體,利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將GBSSI基因(限制性淀粉粒合成酶)轉(zhuǎn)移至小麥中,Southernblot雜交分析表明,外源基因已整合至小麥基因組中。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法與基因槍法相比,具有操作簡(jiǎn)單、成本低、可轉(zhuǎn)移較大片段DNA,外源基因的整合多為單拷貝,遺傳穩(wěn)定性好,后代多數(shù)符合孟德爾遺傳規(guī)律等優(yōu)點(diǎn),在小麥轉(zhuǎn)基因研究中被廣泛應(yīng)用。然而在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化中,由于受到外植體基因型、農(nóng)桿菌侵染濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、載體類型及篩選方式等因素的影響,目前仍然存在轉(zhuǎn)化率低的問題。4.3方差分析和基因整合20世紀(jì)80年代初,我國(guó)學(xué)者周光宇成功地將外源海島棉D(zhuǎn)NA導(dǎo)入陸地棉,培育出抗枯萎病的栽培品種,創(chuàng)立花粉管通道法。1993年曾君祉等報(bào)道了利用花粉管通道法將攜帶GUS標(biāo)記基因的質(zhì)粒pBI121轉(zhuǎn)化普通小麥小山3號(hào),獲得了轉(zhuǎn)基因小麥,對(duì)轉(zhuǎn)基因植株后代進(jìn)行GUS組織化學(xué)分析和Southernblot雜交鑒定,證明GUS基因已整合到小麥植株中,并能在植物體中表達(dá)。歐巧明等通過花粉管通道法將長(zhǎng)穗偃麥草DNA導(dǎo)入到冬小麥隴鑒127中,對(duì)后代產(chǎn)生的變異類型進(jìn)行連續(xù)選擇和抗病性鑒定。結(jié)果表明,D1、D2代各性狀產(chǎn)生變異明顯,D3代基本趨于穩(wěn)定;抗病性鑒定表明,變異后代有個(gè)別表現(xiàn)對(duì)條銹病免疫或高抗,部分材料兼抗白粉病。梁高峰等利用花粉管通道法將Prd29A:DREB1A融合基因(調(diào)控對(duì)干旱、高鹽、低溫逆境應(yīng)答相關(guān)基因表達(dá)的蛋白質(zhì))導(dǎo)入到溫麥19,獲得了含有外源基因的轉(zhuǎn)基因植株。通過GUS組織化學(xué)分析和PCR檢測(cè)證明,融合基因Prd29A:DREB1A已經(jīng)整合至再生植株的基因組中。王永芳等利用花粉管通道法,將谷子抗逆相關(guān)基因DNAj轉(zhuǎn)入小麥中,并對(duì)授粉方式、柱頭處理方式、質(zhì)粒DNA濃度及DNA稀釋試劑等因素對(duì)結(jié)實(shí)率的影響進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果顯示,授粉方式對(duì)結(jié)實(shí)率的影響有顯著差異,而其他條件下結(jié)實(shí)率均未無顯著差異;對(duì)所獲轉(zhuǎn)化體PCR檢測(cè)表明,僅有1株小麥擴(kuò)增到目的基因片段?；ǚ酃芡ǖ婪ㄔ谛←溸z傳轉(zhuǎn)化中有效地利用了自然生殖過程,不受受體基因型和愈傷分化能力的限制,在整株水平上進(jìn)行轉(zhuǎn)化,難度小,簡(jiǎn)便易行,在大田、溫室盆栽中即可進(jìn)行,因此受到了越來越多小麥育種工作者的青睞。但花粉管通道法介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)易受大田環(huán)境條件影響,經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng),重復(fù)性差,轉(zhuǎn)基因植株后代情況復(fù)雜,給轉(zhuǎn)化體的篩選帶來很大的難度。4.4低能重離子束的小麥品種該方法1989年由余增亮提出,1993年運(yùn)用到水稻轉(zhuǎn)基因中。2000年吳麗芳等利用低能離子束介導(dǎo)法將攜帶有GUS基因的質(zhì)粒導(dǎo)入到小麥的成熟胚愈傷組織中,并獲得了抗性植株。PCR擴(kuò)增和Southernblot雜交檢測(cè)證明,外源基因GUS已整合到小麥的基因組中,首次證明了離子束介導(dǎo)小麥遺傳轉(zhuǎn)化的可行性。同年,利用該方法將水稻幾丁質(zhì)酶基因RCH8轉(zhuǎn)入3個(gè)小麥品種中,分別獲得了轉(zhuǎn)基因植株,經(jīng)Southernblot交證實(shí)外源RCH8基因整合至小麥中,再生植株的葉片提取物質(zhì),表現(xiàn)出對(duì)小麥赤霉病的抑制作用。聶利紅等借助離子束介導(dǎo)法將大豆DNA轉(zhuǎn)移至普通小麥中,并對(duì)影響離子束介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化因素如受體小麥品種、供體大豆品種、DNA濃度和浸泡時(shí)間進(jìn)行了正交試驗(yàn)。方差分析表明,受體小麥品種對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響較大,其余因素對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響均較小。低能離子束介導(dǎo)的外源DNA直接轉(zhuǎn)化技術(shù),離子注入之后經(jīng)DNA處理的小麥種子,直接發(fā)芽成苗,獲得轉(zhuǎn)化植株。該方法不僅繞開了繁瑣的組培過程,而且以小麥成熟種子為受體,取材不受季節(jié)和小麥生長(zhǎng)期的制約,是其他方法所不具備的優(yōu)點(diǎn)。然而離子束注入過程需要在真空條件下進(jìn)行,這就使得一些含水量較高的受體材料受到了限制。目前該技術(shù)的生物學(xué)機(jī)理和應(yīng)用研究起步較晚,還有待于從其廣度和深度上進(jìn)一步研究。5小麥基因外源基因的生物安全性研究亟待加強(qiáng)雖然小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)開展很多年,目前小麥遺傳轉(zhuǎn)化的效率仍然較低,至今還沒有培育出用于生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因小麥品種,主要原因如下:(1)小麥本身為異源六倍體植物,遺傳背景復(fù)雜,阻礙了小麥遺傳轉(zhuǎn)化的進(jìn)程。(2)缺乏有效的受體及高效的受體再生體系,限制了小麥轉(zhuǎn)基因研究快速發(fā)展。小麥組織培養(yǎng)再生率低,且有較強(qiáng)的基因依賴性,從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率低下。目前所用的小麥?zhǔn)荏w僅限制在“Bobwhite”和“Pavn”有限基因型中,而這些品種的農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀較差。(3)缺乏高效表達(dá)載體。目前小麥遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù),常用的高效表達(dá)啟動(dòng)子局限于玉米Ubi-l、CaMV35S等。(4)小麥遺傳轉(zhuǎn)化涉及到的基因多數(shù)集中在報(bào)告基因或標(biāo)記基因上,轉(zhuǎn)化經(jīng)濟(jì)安全的目的基因成功的例子較少。(5)缺乏理想的選擇標(biāo)記基因。目前用于小麥轉(zhuǎn)基因的篩選基因多為抗生素基因,其生物安全性仍是社會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)基因生物爭(zhēng)議的焦點(diǎn)。(6)小麥大而復(fù)雜的基因組導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因后沉默現(xiàn)象,影響外源基因在受體細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)。拓寬小麥遺傳轉(zhuǎn)化的受體范圍,利用適應(yīng)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境的小麥品種作為受體是研究的方向之一。近年來小麥育種工作者從小麥主產(chǎn)區(qū)的推廣品種中篩選到了一些再生能力強(qiáng)、適宜進(jìn)行轉(zhuǎn)化的小麥品種,如科農(nóng)199、揚(yáng)麥158、揚(yáng)麥12等,并獲得一大批轉(zhuǎn)基因小麥材料。研究適宜于不同遺傳背景品種外植體的高效再生體系及遺傳轉(zhuǎn)化體系是小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)突破的關(guān)鍵。加強(qiáng)對(duì)小麥遺傳轉(zhuǎn)化機(jī)理的研究,特別是外源基因在小麥染色體中的整合方式,以及與其他基因的互作效應(yīng)等,可以有效地控制轉(zhuǎn)基因在某一位點(diǎn)的整合,盡可能的克服轉(zhuǎn)基因后的沉默現(xiàn)象。利用已發(fā)布的其他植物全基因組序列,挖掘和克隆