■亞硫酸鹽測(cè)序操作方案一、樣品收集1、 配制2%低熔點(diǎn)瓊脂糖稱取0.02g低熔點(diǎn)瓊脂糖，倒入1.5mL離心管中，隨后加入1mLmPBS溶液，置于100°C金屬浴中反復(fù)加熱并顛倒混勻至完全溶解，取出4^保存待用。2、 收集細(xì)胞樣品80C以上熱水浴使低熔點(diǎn)瓊脂糖溶化。向1.5mL離心管底部加入8險(xiǎn)低熔點(diǎn)瓊脂糖，避免產(chǎn)生氣泡。迅速吸取細(xì)胞樣品吹入瓊脂糖中，冷卻后加入500"L礦物質(zhì)油覆蓋。最后將離心管在熱水浴中短暫浸泡使瓊脂糖小球成型，取出-20X保存待用。二亞硫酸氫鹽修飾3、配制DNA細(xì)胞裂解液：向20mLTE緩沖液中加入100pL的20mg/ml蛋白酶K。4、向含樣品的離心管內(nèi)加入500pLDNA細(xì)胞裂解液，50X金屬浴8h以上，以消化樣品。5、在上一步消化進(jìn)行的同時(shí)配制轉(zhuǎn)化液，注意避光亞硫酸氫鈉4.75g雙蒸水4.5mL2MNaOH3.5mL對(duì)苯二酚0.138g共計(jì)10mL6、消化完成后，將離心管取出，換液清洗使小球變性:0.3MNaOH,500pL,15min,2次；0.1MNaOH,1mL,5min,1次。7、換液加入500pL轉(zhuǎn)化液，50X金屬浴8h以上，以轉(zhuǎn)化樣品，注意避光。8、用TEft沖液中止轉(zhuǎn)化，1mL,15min,6次。9、用0.2MNaOH脫磺化，500pL,15min,2次。10、 用TE^沖液中止脫磺化，1mL,15min,3次。11、 用雙蒸水清洗，1mL,10min,2次。12、 清洗完成，用槍頭吸取瓊脂糖小球轉(zhuǎn)移至200口1離心管中，-20C保存待用。甲基化基因的PCR

13、使用設(shè)計(jì)好的兩對(duì)甲基化特異性引物對(duì)轉(zhuǎn)化后的DNA樣品進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)。步驟預(yù)變性變性退火延伸終延伸降溫溫度94C94C55~65C72C72C4C時(shí)間2min30s30s30s2min8第一輪反應(yīng)體系25陀，轉(zhuǎn)化后瓊脂糖小球計(jì)為2pLDNA。第二輪反應(yīng)體系擴(kuò)大為50rLo試劑25pL反應(yīng)體系50pL反應(yīng)體系2xTaqMasterMix12.525RNase-FreeWater8.519ForwardPrimer,10pM12ReversePrimer,10pM12TemplateDNA2214、將第二輪反應(yīng)產(chǎn)物全量加入膠孔中，跑膠時(shí)盡量跑完全程以分離雜帶。在紫外燈下找到目的條帶，快速精確切取，將膠塊放入1.5mL離心管內(nèi)。15、對(duì)膠塊稱重，向離心管內(nèi)加入3倍膠體積（0.1g=100嘰）QGBuffer,50°C金屬浴至膠融化，同批樣品可統(tǒng)一為450pL,以便于離心。16、加入116、加入1倍膠體積（150pL）異丙，顛倒混勻后將液體移入離心柱離心,13000g,1min。17、 倒掉收集管內(nèi)液體，向離心柱內(nèi)加入500嘰QGBuffer，再次離心，13000g,1min。18、 倒掉收集管內(nèi)液體，加入750pLPEBuffer，靜置2min，再次離心，13000g,1min。19、 更換收集管再次離心，13000g,1min,倒置離心柱在濾紙上晾干2min，再插入新收集管。20、 將25pLEBBuffer精確加至離心柱中心內(nèi)膜，靜置3min后離心，18000g,10min。21、 取少量收集管內(nèi)DNA溶液檢測(cè)樣品濃度（分光光度計(jì)或跑膠檢測(cè)），余下-20C保存待用。微'■分光光度計(jì)：測(cè)定DNA濃度并記錄，連接微'■分光光度計(jì)：測(cè)定DNA濃度并記錄，連接T載體時(shí)稀釋各組至合適的統(tǒng)?濃度。,跑膠：取5pLDNA^S與1pL6xloadingbuffer混合，點(diǎn)樣跑膠檢測(cè)目的條帶，依據(jù)目的條帶亮度決定連接T載體時(shí)的DNA上樣量。（亮1pL;中等2pL;弱3pL）五、克隆測(cè)序22、預(yù)先制冰，將pMD18-TVectorCloningKit冰上解凍，依次向200口1離心管內(nèi)添加:高DNA濃度中DNA濃度低DNA濃度

雙蒸水3pL2pL1pL共計(jì)5pL1pL頊pLpL1pL3pL混勻后，加入5pLSolutionI;再次混勻，放入PCR儀中16°C連接8h。T?體

DNAWS23、在上一步連接進(jìn)行的同時(shí)，配制LB/AMP培ffS(1)配制LB液體培^S(200T?體

DNAWS1%(w/v)Tryptone2g0.5%(w/v)YeastExtract1g1%(w/v)NaCl2g固定容后，加入200pL2MNaOH將pH值調(diào)至7.0，混勻后移入玻璃瓶?jī)?nèi)。(2)配制LB固體培^S(200mL)再配制200mLLB液體培養(yǎng)基，隨后倒入含3g瓊脂粉的燒杯中，(3)將兩種培養(yǎng)基與玻璃棒、涂板小桿等一同高壓滅菌。(4)高壓后冷卻至40~50C時(shí)，向200mLLB固體培養(yǎng)基內(nèi)加入200pL100mg/mLAmpicillin,向150mLLB液體培養(yǎng)基內(nèi)加入150pL100mg/mLAmpicillin剩余50mL不加Ampicillin。(5)搖勻LB固體培養(yǎng)S，取90mm培養(yǎng)皿分裝，每盤內(nèi)倒入約20mL。(6)待培養(yǎng)基凝固后，進(jìn)行涂板。每板加入50pL20mg/mLX-Gal與20pL50mg/mLIPTG,混合后涂抹均勻，避光晾干備用。24、轉(zhuǎn)化感受肽(1)連接完成后，將10pL樣品全量加入含100pLDH5a感受態(tài)細(xì)胞的1.5mL離心管內(nèi)。(2)輕輕混勻后冰上放置30min,42^金屬浴激發(fā)90s,冰上冷卻2min,操作時(shí)避免劇烈晃動(dòng)。(3)加入900pL不含Ampicillin的LB液體培WS，放入搖床，37C,150g,培養(yǎng)1h以上。25、養(yǎng)菌待搖床上離心管內(nèi)菌液長(zhǎng)好(充滿液體)，取100pL菌液滴入凝固的培養(yǎng)基并涂抹均勻。將涂板倒置在搖床內(nèi)，37V,避光，保濕，避風(fēng)，培養(yǎng)12h以上，待菌斑長(zhǎng)至直徑1mm左右。此時(shí)培養(yǎng)基上白斑可用，藍(lán)斑淘汰?？蓪⑴囵B(yǎng)基直接封口，送樣測(cè)序，也可進(jìn)一步挑菌培養(yǎng)。

26、挑菌用槍頭挑取單個(gè)陽(yáng)性克隆菌落混入加有1mL含Ampicillin的