1/1《培養(yǎng)基的制備與消毒滅菌》實驗報告《培育基的制備與消毒滅菌》試驗報告

試驗目的

1.學習和把握配制培育基（以牛肉膏蛋白胨培育基的配制為例）的一般方法和原理。

2.了解消毒和滅菌的原理，把握常用滅菌方法的操作步驟。

試驗原理

培育基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的養(yǎng)分基質，用以培育、分別、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。在自然界中．微生物種類繁多，養(yǎng)分類型多樣，加之試驗和討論的目的不同，所以培育基的種類許多。但是，不同種類的培育基中，一般應含有水分、碳源、氮源、能源、無機鹽、生長因素等。不同微生物對PH要求不一樣．雷菌和酵母的培育基的pH一般是偏酸性的，而細菌和放線菌的培育基的pH一般為中性或微堿性的(嗜堿細菌和嗜酸細菌例外)。所以配制培育基時，都要依據(jù)不同微生物的要求將培育基的pH調到合適的范圍。此外，由于配制培育的各類養(yǎng)分物質和容器等含有各種微生物，因此，已配制好的培育基必需馬上滅菌．假如來不及滅菌，應暫存冰箱內，以防止其中的微生物生長繁殖而消耗養(yǎng)分和轉變培育的酸堿度所帶來不利的影響。

高壓蒸氣滅菌是將持滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸氣。待水蒸氣急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關閉排氣閥．連續(xù)加熱，此時由于蒸氣不能道出，而增加了滅菌器內的壓力，從而使沸點增高，得到高于100℃的溫度。導致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。

牛肉膏蛋白胨培育基是一種應用最廣泛和最一般的細菌基礎培育基，有時又稱為一般培育基。由于這種培育基中含有一般細菌生長繁殖所需要的最基本的養(yǎng)分物質，所以可供作微生物生長繁殖之用?；A培育基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏為微生物供應碳源、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要供應氮源和維生素，而NaCl供應無機鹽。在配制固體培育基時還要加入肯定量瓊脂作凝固劑，瓊脂在常用濃度下96℃時溶化，實際應用時，一般在沸水浴中或下而墊以石棉網(wǎng)煮沸溶化，以免瓊脂燒焦。瓊脂在40℃時凝固，通常不被微生物分解利用。固體培育基中瓊脂的含量依據(jù)瓊脂的質量和氣溫的不同而有所不同。

由于這種培育基多用于培育細菌，因此要用稀酸或稀堿將其PH調至中性或微堿性，以利于細菌的生長繁殖。

牛肉膏蛋白胨培育基的配方如下：

牛肉膏3.0g

蛋白胨10.0g

NaCl5.0g

水1000ml

pH7.4—7.6

試驗儀器與藥品

1.溶液或試劑：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂、1mol／LNaOH、1mol／LHCl。

2.儀器或其他用具：試管、三角瓶、1000ml燒杯（或1000ml刻度搪瓷杯）、量筒、玻棒、培育基分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙（pH5.5-9.0）、一般棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布等。

試驗步驟

（一）牛肉膏蛋白胨培育基的制備

1.稱量（假定配制1000ml培育基）

按培育基配方比例依次精確?????地稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入燒杯（或1000ml刻度搪瓷杯）中．牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。也可放在稱量紙上，稱量后直接放人水中，這時如略微加熱，牛肉膏便會與稱量紙分別，然后馬上取出紙片。

2.溶化

在上述燒杯中先加入少于所需要的水量（如約700ml），用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解，將藥品完全溶解后，補充水到所需的總體積（1000ml）；假如配制固體培育基時，將稱好的瓊脂放人已溶的藥品中，再加熱溶化，最終補足所損失的水分。

3.調pH

在未調pH前，先用精密pH試紙測量培育基的原始pH，假如偏酸．用滴管向培育基中逐滴加入1mol／LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其PH，直至pH達7.4-7.6。反之，用1mol／LHCl進行調整。

4.過濾

趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利某些試驗結果的觀看?？梢允∪?本試驗勿需過濾)。

5.分裝

液體分裝

分裝高度以試管高度的1／4左右為宜。分裝三角瓶的雖則依據(jù)需要而定，一般以不超過三角瓶容積的一半為宜，假如是用于振蕩培育用，則依據(jù)通氣量的要求酌情削減；有的液體培育基在滅菌后，需要補加肯定量的其他無菌成分，如抗生素等，則裝量肯定要精確?????。

固體分裝

分裝試管，其裝量不超過管高的1／5，滅菌后制成斜面。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。

半固體分裝

一般以試管高度的1／3為宜，滅菌后垂直待凝。

6.加塞

培育基分裝完畢后，在試管口或三角瓶口上塞上棉塞(或硅膠塞、金屬或高溫塑料試管帽等)，以阻擋外界微生物進入培育基內面造成污染，并保證有良好的通氣性能(棉塞制作方法附本試驗后面)。

7.包扎

加塞后，將全部試管放入鐵絲筐或用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培育基名稱、配制日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結形式扎好，使用時簡單解開，同樣用記號筆注明培育基名稱、配制日期。

8.滅菌

將上述培育基以0.103MPa，l21℃，20min高壓蒸氣滅菌。

9.擺斜面

將滅菌的試管培育基冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，將試管口端擱在玻棒或其他合適高度的器具上，擱置的斜面長度以不超過試管總長的一半為宜

l0.無菌檢查

將滅菌培育基放入37℃的恒溫箱中培育24-48h．以撿查滅菌是否徹底。

留意事項

1.蛋白胨很簡單吸濕，在稱取時動作要快速，另外，稱量時嚴防藥品混雜．一把牛角匙用于一種藥品．或稱取一種藥品后，洗凈——擦干——再稱職另一藥品——瓶蓋也不要蓋錯。

2.在瓊脂溶化過程中．應掌握火力，以免培育基因沸騰而溢出容器。同時，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦，制培育基時，不行用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進入培育基中，影響細菌生長。

3.對于有些要求PH較精確的微生物，其PH的調整可用酸度計進行(使用方法、可參考有關說明書)。pH不要調過頭，以避開回調而影響培育基內各離子的濃度。配制pH低的瓊脂培育基時．若預先記好PH并在高壓蒸汽下滅菌，則瓊脂因水解不能凝固。因此，應將培育基的成分和瓊脂分開滅菌后再混合，或在中性pH條件下滅菌，再調整pH。

4.分裝過程中，留意不要使培育基沾在管(瓶)口上，以免沾污面塞而引起污染。

（二）高壓蒸汽滅菌法步驟

1.加水

使用前在鍋內加入適量的水，加水不行過少，以防將滅菌鍋燒干，引起炸裂事故。加水過多有可能引起滅菌物積水。水面與三角架相平為宜

2.裝料

將滅菌物品放在滅菌桶中，不要裝得過滿。

3.加蓋

蓋好鍋蓋，按對稱方法旋緊四周固定螺旋，打開排氣閥。

4.加熱排氣

加熱后水蒸氣與空氣一起從排氣孔排出，待鍋內沸騰并有大量蒸汽自排氣閥冒出時，排出的氣流很強并有噓聲時，維持2—3min以排解冷空氣。如滅菌物品較大或不易透氣，應適當延長排氣時間，務必使空氣充分排解，然后將排氣閥關閉。

5.加壓

將排氣閥關閉

6.保壓

當壓力升至0.1MPa時，溫度達121℃，此時應留意觀看，掌握熱源。保持壓力穩(wěn)定，維持20-30min后，切斷熱源。

7.自然降壓

當壓力表降至“0”處，稍停，使溫度連續(xù)降至100℃以下后，打開排氣閥，旋開固定螺旋，開蓋，取出滅菌物。留意：切勿在鍋內壓力尚在“0”點以上，溫度也在100℃以上時開啟排氣閥，否則會因壓力突然降低，而造成培育基猛烈沸騰沖出管口或瓶口，污染棉塞，以后培育時引起雜菌污染。壓力降到“0”時，方可打開排氣閥。

8.保養(yǎng)

滅菌完畢取出物品后，將鍋內余水倒出，以保持內壁及內膽干燥，蓋好鍋蓋。

9.培育基無菌檢查五、關鍵步驟及留意事項

1.要嚴格按配方配制。

2.調pH不要過頭。

3.干熱滅菌要留意物品不要堆放過緊，留意溫度的時間掌握，70?C以下放物、取物。

4.高壓滅菌要留意物品不要過多，加熱后排解冷空氣，到時降壓回零取物。

5.過濾除菌要留意