第十章微生物分類和判定

第1頁地球上開始出現(xiàn)生命，主要是些類似簡單桿狀細(xì)菌原始生物。大約46億年前，地球形成；大約35億年前，通過“前生命化學(xué)進(jìn)化”過程漫長進(jìn)化歷程千姿百態(tài)生物種類第2頁形成于35億年前微生物化石主要是些類似簡單桿狀細(xì)菌原始生物形成于8.5億年前微生物化石20億年前后來巖石中微生物化石形態(tài)多樣性顯著增多第3頁形成于10億年前微生物化石形態(tài)上非常類似于當(dāng)代藍(lán)細(xì)菌，進(jìn)行不產(chǎn)氧光合作用光能自養(yǎng)菌，及化能無機(jī)營養(yǎng)硫細(xì)菌。形態(tài)上類似于當(dāng)代綠藻（真核生物）第4頁第5頁微生物分類學(xué)基本任務(wù)：

對已知大量提煉出分類單元1、分類2、判定3、命名給新發(fā)覺物種命名（一般用拉丁語）對未知個別進(jìn)行判定，歸入分類系統(tǒng)第6頁一分類單元界（Kingdom）門（Phylum或Division）

綱（Class）

目（Order）

科（Family）

屬（Genus）

種（Species）

第一節(jié)通用分類單元

第7頁二種概念

動物種：凡兩個能互相交配產(chǎn)生具有有性生殖能力物種。微生物種：是最基本分類單元，它是表型特性高度相同，親緣關(guān)系極其相近，與同屬內(nèi)其他種有著顯著差異菌株總稱。

菌株（Strain）：任何由一種獨立分離單細(xì)胞繁殖而成純種種群（純培養(yǎng)物）及其一切后裔。

模式菌株（種）：是被指定代表一種種菌株，該菌株具有此種各個典型形狀，即詳細(xì)種。

第8頁BacillussubtilisASI.398BacillussubtilisBF7658生產(chǎn)蛋白酶生產(chǎn)α淀粉酶第9頁第10頁三學(xué)名

屬名：在前，一般用拉丁文名詞表達(dá)，字首字母大寫，表達(dá)形態(tài)、構(gòu)造等主要特性。

種名：在后，常用拉丁文形容詞表達(dá)，所有小寫，表達(dá)起源、寄主、顏色等次要特性。若所分離菌株只判定到屬，而未判定到種，可用sp來表達(dá)，例如Bacillussp.（spp.）1、雙名法

學(xué)名＝屬名＋種加詞＋（初次定名人）＋現(xiàn)定名人＋定名年份

斜體正體（一般省略）

第11頁2、三名法

命名一亞種或變種時用三名法。

學(xué)名＝屬名＋種加詞＋符號Subsp或Var＋亞種或變種加詞

斜體正體（可省）斜體

亞種（subspecies，subsp，ssp.）：進(jìn)細(xì)一步分類單元，一般指除某一顯著而穩(wěn)定特性外，其他判定特性與模式種相同種。

變種（Variety，Var）：亞種同義詞，現(xiàn)已不用。型（Form）：菌株同義詞，現(xiàn)已廢除。第12頁四微生物在生物界中分類地位1、界級分類1753年，二界：動物界、植物界*；1860年，三界：動物界、植物界、原始生物界*；

1956年，四界：動物界、植物界、原始生物界*（原生動物、真菌、藻類）、菌界*（細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌）；第13頁1949年，六界：后生動物界、后生植物界、原生生物界*、真菌界*、原核生物界*、病毒界*；

1977年，王大耜

六界：在五界基礎(chǔ)上加一病毒界*；1996年，六界：動物界、植物界、原生生物界*、真菌界*、真細(xì)菌界*、古細(xì)菌界*。1969年，五界：動物界、植物界、原生生物界*、真菌界*、原核生物界*；第14頁2、三域?qū)W說（三原界系統(tǒng)）細(xì)菌域（真細(xì)菌原界）、古細(xì)菌域（古細(xì)菌原界）、真核生物域（真核生物原界）古細(xì)菌特點：1）細(xì)胞壁缺乏常規(guī)肽聚糖成份；2）細(xì)胞壁類脂成份特殊；3）16srRNA核苷酸序列特殊；4）tRNA成份特殊，無T；5）Pr合成起始密碼特殊：甲硫氨酸（與真核生物同）；6）生態(tài)條件特殊。

第15頁五各大微生物分類系統(tǒng)1、細(xì)菌細(xì)菌、放線菌等原核微生物分類系統(tǒng)很多，目前較有代表性和最有影響分類系統(tǒng)是美國《伯杰氏細(xì)菌學(xué)判定手冊》(Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology

，簡稱“手冊”)1923年第一版以來，相繼于1925、1930、1934、1939、1948、1957、1974和1994年出版了第二版至第九版第16頁2023年，Bergey’sManualofSystematicBacteriology第二版編輯完成并提成5卷陸續(xù)出版。在此第二版中，細(xì)菌域分為16門，26組，27綱，62目，163科，814屬，搜集了4727個種。古菌域分為2門，5組，8綱，11目，17科，63屬，搜集了208個種。供搜集進(jìn)原核微生物4935個種。在1984～1989年間，“手冊”出版者出版了《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》(Bergey’sManualofSystematicBacteriology，簡稱“系統(tǒng)分類學(xué)手冊”)與“手冊”有很大不一樣：首先是在各級分類單元中廣泛采取細(xì)胞化學(xué)分析、數(shù)值分類辦法和核酸技術(shù)，尤其是16SrRNA寡核苷酸序列分析技術(shù)，以說明細(xì)菌親緣關(guān)系，并對第八版手冊分類作了必要調(diào)整。第17頁2、菌物（真菌）

1995年，《安·貝氏菌物詞典》，第八版。第18頁第二節(jié)微生物分類判定一典型指標(biāo)1、個體細(xì)胞形態(tài)、大小、排列方式，染色反應(yīng)，有沒有運(yùn)動，多種特殊構(gòu)造特性等2、形態(tài)特性菌落形態(tài)，在固體、半固體或液體培養(yǎng)基中生長狀態(tài)等第19頁3、營養(yǎng)要求碳源、氮源、礦質(zhì)元素、生長因子等4、生理生化特性代謝產(chǎn)物種類、產(chǎn)量、顯色反應(yīng)等產(chǎn)酶種類和反應(yīng)特性等5、酶第20頁生理生化特性在以實用為主要目標(biāo)表型分類中，生理生化特性往往是細(xì)菌分類鑒定主要特性。腸道菌科細(xì)菌屬和種分類判定就是如此。能否發(fā)酵乳糖能否以檸檬酸為唯一碳源產(chǎn)生賴氨酸、脫羧酶志賀氏菌屬產(chǎn)生硫化氫沙門氏菌屬是否產(chǎn)生3-羥基丁酮檸檬酸桿菌屬埃希氏桿菌屬腸桿菌屬第21頁6、生態(tài)學(xué)特性生長溫度，對氧需要，酸堿度要求，宿主種類，生態(tài)分布等7、血清學(xué)反應(yīng)8、噬菌體敏感性第22頁形態(tài)和生理生化特性是最常用細(xì)菌分類、判定指標(biāo)第23頁在當(dāng)代微生物分類中，任何能穩(wěn)定地反應(yīng)微生物種類特性資料，都有分類學(xué)意義，都能夠作為分類判定根據(jù)。形態(tài)學(xué)特性、生理學(xué)特性、生態(tài)學(xué)特性從不一樣層次(細(xì)胞、分子)，用不一樣窗科(化學(xué)、物理學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)等)技術(shù)辦法來研究和比較不一樣微生物細(xì)胞、細(xì)胞組分或代謝產(chǎn)物，從中發(fā)覺反映微生物類群特性資料。生物分類傳統(tǒng)指標(biāo)：第24頁二當(dāng)代指標(biāo)

（一）遺傳學(xué)指標(biāo)1、DNA中G+Cmol%分析1）每個生物種都有特定G+C%范圍，因此可以作為分類判定指標(biāo)。細(xì)菌GC%范圍為25--75%，變化范圍最大，因此更適合于細(xì)菌分類判定。第25頁第26頁2）GC%測定主要用于對表型特性難辨別細(xì)菌作出判定，并可檢查表型特性分類合理性，從分子水平上判斷物種親緣關(guān)系。3）使用標(biāo)準(zhǔn)：G+C含量比較主要用于分類判定中否認(rèn)每一種生物都有一定堿基組成，親緣關(guān)系近生物，它們應(yīng)當(dāng)具有相同G+C含量，若不一樣生物之間G+C含量差異大表白它們關(guān)系遠(yuǎn)。但具有相同G+C含量生物并不一定表白它們之間具有近親緣關(guān)系。第27頁同一種種內(nèi)不一樣菌株G+C含量差異應(yīng)在4～5%下列；同屬不一樣種差異應(yīng)低于10～15%；若二個在形態(tài)及生理生化特性方面極其相同菌株，假如其G+C含量差異大于5%，則肯定不是同一種種，大于15%則肯定不是同一種屬。第28頁①

80年代此前螺菌屬(Spirillum)不一樣種G+C含量范圍寬達(dá)38～66%，后來“伯杰氏手冊”(1984)結(jié)合其他特性已將其提成三個屬：螺菌屬、海洋螺菌屬(Oceanospirillum)和水螺菌屬(Aquaspirillum)它們G+C含量分別為38%、42～51%和49～66%；②過去根據(jù)形態(tài)學(xué)特性曾以為微球菌屬(Micrococcus)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)是關(guān)系很近兩個屬，因而長期放在一種科內(nèi)，由于G+C含量差異(分別為30～38%和64～75%)表白它們親緣關(guān)系相稱遠(yuǎn)，目前根據(jù)16SrRNA序列資料已進(jìn)行新調(diào)整。第29頁在疑難菌株判定、新種命名、建立一種新分類單位時，G+C含量是一項主要，必不可少判定指標(biāo)。其分類學(xué)意義主要是作為建立新分類單元一項基本特性和把那些G+C含量差異大種類排除出某一分類單元。G+C含量比較主要用于分類判定中否認(rèn)第30頁2、核酸分子雜交不一樣生物DNA堿基排列次序異同直接反應(yīng)生物之間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，堿基排列次序差異越小，它們之間親緣關(guān)系就越近，反之亦然。直接分析比較DNA堿基排列次序------由于技術(shù)上困難目前尚難以普遍地進(jìn)行；核酸分子雜交(hybridization)間接比較不一樣微生物DNA堿基排列次序相同性第31頁1）DNA-DNA雜交；（親緣關(guān)系相對近微生物之間親緣關(guān)系比較）2）DNA-rRNA雜交；（親緣關(guān)系相對遠(yuǎn)微生物之間親緣關(guān)系比較）3）核酸探針；（利用特異性探針，用于細(xì)菌等迅速判定）第32頁第33頁第34頁特異性探針主要用于病原微生物迅速判定第35頁3、電子雜交伴隨微生物基因信息，尤其是全基因組完全測序不停增加，我們能夠通過多種計算機(jī)軟件對不一樣物種遺傳信息進(jìn)行直接比較，從而分析不一樣微生物間親緣關(guān)系。第36頁蛋白質(zhì)、RNA和DNA序列進(jìn)化變化顯著特點是進(jìn)化速率相對恒定，也就是說，分子序列進(jìn)化變化量(氨基酸或核苷酸替代數(shù)或替代百分率)與分子進(jìn)化時間成正比。4、16SrRNA編目分析

a）在兩群生物中，假如同一種分子序列差異很大時，------------進(jìn)化距離遠(yuǎn)，進(jìn)化過程中很早就分支了。b）假如兩群生物同一起源大分子序列基本相同，------------處于同一進(jìn)化水平上。第37頁16SrRNA被普遍公以為是一把好譜系分析“分子尺”：1）rRNA具有主要且恒定生理功能；2）在16SrRNA分子中，有高度保守、中度保守和高度變化序列區(qū)域，因而它適用于進(jìn)化距離不一樣各類生物親緣關(guān)系研究；3）16SrRNA分子量大小適中，便于序列分析；4）rRNA在細(xì)胞中含量大(約占細(xì)胞中RNA90%)，也易于提??；5）16SrRNA普遍存在于真核生物(同源分子是18SrRNA)和原核生物中。因此它能夠作為測量各類生物進(jìn)化工具。4、16SrRNA編目分析

第38頁核糖體RNA第39頁第40頁利用16SrRNA建立分子進(jìn)化樹美國科學(xué)家

CarlWoese

第41頁rRNA和系統(tǒng)發(fā)育樹1.rRNA次序和進(jìn)化培養(yǎng)微生物提取并純化rRNArRNA序列測定分析比較微生物之間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系（從cDNA序列得出）第42頁用反轉(zhuǎn)錄酶和雙脫氧測序法對微生

物培養(yǎng)物進(jìn)行測序步驟用PCR法進(jìn)行rRNA測序第43頁a代表16SrRNA全長c系統(tǒng)發(fā)育樹b進(jìn)化距離，即任意兩個生物RNAs間非同源序列百分比第44頁2.特性序列或序列印記（signaturesequence）通過對rRNA全序列資料分析比較（尤其是采取計算機(jī)）發(fā)覺在不一樣種群水平上特異特性性寡核苷酸序列，或在某些特定序列位點上出現(xiàn)單堿基印記。特性序列有助于迅速確定某種微生物分類歸屬，或建立新分類單位。第45頁定義3種生物領(lǐng)域16S或18SrRNA序列特性第46頁3.系統(tǒng)發(fā)育樹(phylogenetictree)通過比較生物大分子序列差異數(shù)值構(gòu)建系統(tǒng)樹稱為分子系統(tǒng)樹，其特點是用一種樹狀分枝圖型來概括各種(類)生物之間親緣關(guān)系。圖型中，分枝末端和分枝連結(jié)點稱為結(jié)(node)，代表生物類群，分枝末端結(jié)代表仍生存種類。系統(tǒng)樹也許有時間百分比，或者用兩個結(jié)之間分枝長度變化來表達(dá)分子序列差異數(shù)值。第47頁16SrRNA系統(tǒng)發(fā)育樹第48頁16SrRNA系統(tǒng)發(fā)育樹第49頁系統(tǒng)發(fā)育樹第50頁系統(tǒng)發(fā)育樹第51頁系統(tǒng)發(fā)育樹第52頁伴隨越來越多微生物全基因組序列測定，人們發(fā)覺生物在進(jìn)化中存在著非常廣泛水平基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，很多科學(xué)家都以為不能僅靠對16SrRNA序列比較來確定生物之間親緣關(guān)系，還必須借助多種信息對這個進(jìn)化樹進(jìn)行改善。CarlWooserRNA進(jìn)化樹完美無缺？第53頁指標(biāo)有：細(xì)胞壁氨基酸組分、全細(xì)胞糖組分、細(xì)胞膜類脂成份等。（二）細(xì)胞化學(xué)成份作為指標(biāo)細(xì)胞成份分析內(nèi)容在分類水平上作用細(xì)胞壁肽聚糖構(gòu)造種和屬多糖胞壁酸膜脂肪酸種和屬極性類脂霉菌酸類異戊二烯苯醌蛋白質(zhì)氨基酸序列分析屬和屬以上單位血清學(xué)比較電泳圖酶譜代謝產(chǎn)物脂肪酸種和屬全細(xì)胞成份分析熱解—氣液色譜分析種和亞種熱