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茚三酮法測(cè)氨基酸

茚三***顯色法測(cè)定氨基酸的含量:凡含有自由氨基的化合物,如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸的溶液與水合茚三***共熱時(shí),能產(chǎn)生紫色化合物,可用比色法進(jìn)行測(cè)定。

氨基酸與茚三***的反應(yīng)分兩個(gè)步驟。

第一步是氨基酸被氧化形成2、3和醛、茚三***被還原成還原型茚三***;其次步是所形成的還原型茚三***與另一個(gè)茚三***分子和3縮合生成有色物質(zhì)。

:721型分光光度計(jì)臺(tái)天平減壓蒸餾器干燥容量瓶移液槍燒杯試管架試管水浴鍋。

:1標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液:溶液2,2醋酸緩沖液:量取862醋酸鈉溶液,加入142乙酸混合而成。

用檢查校正。

3茚三***顯色液:稱取170茚三***和30還原茚三***,用20乙二醇甲醚溶解460%乙醇。

5樣品液:~50μ氨基酸。

茚三***若變?yōu)槲⒓t色,則需按下法重結(jié)晶:稱取5茚三***溶于15~25熱蒸餾水中,活性炭,輕輕攪拌。

加熱30后趁熱過濾,濾液放入冰箱過夜。

次日析出黃白色結(jié)晶,抽濾,用1冷水洗滌結(jié)晶,置干燥器干燥后,裝入棕色玻璃瓶保存。

還原型茚三***按下法制備:茚三***,沸蒸餾水溶解,得黃色溶液。

維生素用25溫蒸餾水溶解,一邊攪拌一邊將維生素溶液滴加到茚三***溶液中,不斷消失沉淀。

滴定后連續(xù)攪拌15,然后在冰箱內(nèi)冷卻到4℃,過濾、沉淀用冷水洗滌3次,置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存,備用。

乙二醇甲醚若放置太久,需用下法除去過氧化物:在500乙二醇甲醚中加入5硫酸亞鐵,振蕩1~2,過濾除去硫酸亞鐵,再經(jīng)蒸餾,收集沸點(diǎn)為121~125℃的餾分,為無色透亮?????的乙二醇甲醚。

四、操作步驟的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液0,,,,,于試管中,用水補(bǔ)足至1。

各加入1,2醋酸緩沖液;再加入1茚三***顯色液,充分混勻后,蓋住試管口,在100℃水浴中加熱15,用自來水冷卻。

放置5后,加入360%乙醇稀釋,充分搖勻,用分光光度計(jì)測(cè)定570。

脯氨酸和羥脯氨酸與茚三***反應(yīng)呈黃色,應(yīng)測(cè)定440。

以570為縱坐標(biāo),氨基酸含量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

123456標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液蒸餾水02醋111111酸緩沖液茚三***顯111111色液570混勻,蓋住試管口后在100水浴加熱15,然后用自來水冷卻。

放置5后,加入360%的乙醇稀釋,充分搖勻。

取樣品液1,,2醋酸緩沖液1和茚三***顯色液1,混勻后于100℃沸水浴中加熱15,自來水冷卻。

放置5后,加360%乙醇稀釋,搖勻

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